含BMP-2的牙槽骨修复材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于含活性蛋白的生物医学材料领域和再生医学领域，具体地，本申请提供了一种牙槽骨修复材料，包含羟基磷灰石、烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、以及bmp-2多肽。该材料可用于牙槽骨修复和牙种植。

背景技术：

骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2、bmp-2)是1965年由marshallr.urist进行成骨实验时发现的促进骨生成的关键因子。bmp-2属于tgf-α家族，其由成骨细胞分泌,并作用于成骨细胞,bmp-2为细胞分化成矿物质沉积成骨细胞的主要信号分子，起到诱导成骨细胞分化的作用。在肢体生长、软骨内骨化、骨折时表达,在骨骼生长发育和再生修复起重要作用。由于bmp-2有显著的刺激新骨形成的作用,其被认为是治疗骨折、骨缺损等疾病的有前景的活性成分，在脊柱融合和关节融合等情况下，还可以作为骨移植的替代医疗方案(此类应用已经经过fda批准)。

bmp-2的主要缺点在于其半衰期短,静脉注射后的t1/2仅6-7min，并且容易因新陈代谢过程、生理环境变化，或与酶的作用而变性。因此注射、口服等给药途径即使大剂量持续给药也往往不能提供给靶部位持续有效的浓度，对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说无法提供良好的治疗效果，并且容易引起患者成骨质量低、炎症反应以及其他潜在的风险。因此，选择适合的递送方式，例如将bmp-2置于骨修复材料中是实现bmp-2广泛应用，并提高其疗效的关键。

近年来，面部整形和种植牙得到了快速发展和广泛应用，但在实践中，牙槽部位骨量不足成为了医生面临的常见问题，牙槽部位面临的体内环境和机械刺激情况与体内骨骼又有明显的区别。因此，如何在牙槽骨修复再生中使用bmp-2，还具有不同于一般骨修复的特点，主要在于特定的降解速度、机械强度、弹性模量以及防止成纤维细胞和肌肉组织侵入。

天然高分子壳聚糖材料由于其良好的生物相容性、降解特性以及与周边组织的良性相互作用成为了组织工程的重要材料，也是bmp-2良好的载体，但其作为骨修复材料时有力学性能差且降解快的问题，即使配合其他材料也难以取得良好的平衡，此外，壳聚糖的过敏性也是其临床应用中的一大障碍。

技术实现要素：

发明人尝试对天然高分子—壳聚糖进行改性以解决上述技术问题。发明人发现以烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖在降解/释药时间上实现了巨大的进步，并且显著降低了过敏性。配合羟丙基甲基纤维素以及羟基磷灰石等无机骨修复材料后也达到了适合的机械强度和弹性模量。在体外释放实验和动物实验中均取得了显著优于壳聚糖和现有类似材料的效果。细胞毒性实验也初步证明了其安全性。

一方面，本申请提供了一种牙槽骨修复材料，包含选自羟基磷灰石、磷酸钙、硫酸钙中一种或多种的钙基质、改性壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、以及bmp-2多肽；按质量比，钙基质：改性壳聚糖：羟丙基甲基纤维素：bmp-2多肽为3000-6000：1000-3000：1000-3000：1-400；所述的bmp-2多肽的基因序列为序列表中seqidno.1；氨基酸序列为序列表中seqidno.2。

进一步地，按质量比，钙基质：改性壳聚糖：羟丙基甲基纤维素：bmp-2多肽为5000：2000：1500：300。

进一步地，其中改性壳聚糖为烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖。

进一步地，其中改性壳聚糖按以下方法制备：

将3g壳聚糖溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至90℃，加入6ml0.08mol/l硝酸铈，反应30min；加入9ml50％(质量)烯丙基三甲基氯化铵水溶液，反应2h；冷却，乙醇沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥得烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖。

进一步地，其中改性壳聚糖按以下方法制备：

将3g壳聚糖溶液溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至50℃，加入5ml0.06mol/l硝酸铈，反应30min；加入8g丙烯酰胺，反应2h；冷却，加氢氧化钠溶液调节ph至10，得沉淀，丙酮洗涤沉淀，真空干燥得丙烯酰胺改性壳聚糖。

进一步地，其中钙基质为羟基磷灰石。

进一步地，其制备过程为，将bmp-2多肽与钙基质混合均匀，将改性壳聚糖和羟丙基甲基纤维素以20％-40％的质量/体积浓度溶于ph5-6的pbs缓冲液，将bmp-2多肽与钙基质的混合物加入改性壳聚糖和羟丙基甲基纤维素溶液中，混合均匀即得。

另一方面，本申请提供了上述牙槽骨修复材料的制备方法，该制备方法的过程为，将bmp-2多肽与钙基质混合均匀，将改性壳聚糖和羟丙基甲基纤维素以20％-40％的质量/体积浓度溶于ph5-6的pbs缓冲液，将bmp-2多肽与钙基质的混合物加入改性壳聚糖和羟丙基甲基纤维素溶液中，混合均匀即得。

另一方面，本申请提供了上述牙槽骨修复材料在牙槽骨修复中的应用。

另一方面，本申请提供了上述牙槽骨修复材料在牙种植中的应用。

本申请中所使用的bmp-2包括各种来源的，具有骨形成活性的bmp-2蛋白，蛋白突变体，蛋白活性片段，其可以从来源中提取或者以基因工程方法从各种宿主菌种表达获得，其可以由实施主体自行提取/表达获得，也可以是购自市场的成品。

壳聚糖可以来自各种来源，其分子量可以由本领域技术人员根据修复部位的需要在1万到80万的范围内调节，改性修饰可以由实施者自行行进或者购买改性成品。

除了牙槽骨修复外，本申请的组合物还可以用于治疗性牙槽矫形修复，美容性牙槽矫形修复等需要在牙槽和临近区域填充和促进骨生长的情形。

附图说明

图1：牙槽骨修复实验磨片观察结果，从左向右依次为对照材料组、丙烯酰胺改性壳聚糖材料组、烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖材料组的典型情况。

具体实施方式

试剂和仪器：

羟丙基甲基纤维素由浙江海申新材料有限公司生产；

羟基磷灰石(10μm，99.9％)由北京德科岛金科技有限公司提供

壳聚糖(中等分子量，约40万)由上海艾研生物科技有限公司生产；

烯丙基三甲基氯化铵、丙烯酰胺(分析纯)由上海邦成化工有限公司生产；

大肠杆菌宿主残留蛋白检测试剂盒由上海澄绍生物科技有限公司生产；

人bmp-2elisa检测试剂盒由天津安诺瑞康生物技术有限公司生产；

cck-8细胞增殖毒性检测试剂盒由大连美仑生物科技有限公司生产；

nicolet5700红外光谱仪由nicolet生产；

部分分子生物学操作委托金斯瑞生物科技有限公司进行；

部分化学改性操作委托上海开拓者化学研究管理有限公司进行；

部分动物实验委托北京中医药大学科研实验中心/实验动物中心进行；

其余试剂和仪器均为国产常规品牌和型号。

实施例1bmp-2的制备

为便于实验进程和质量控制，实验中所用的bmp-2由申请人自行制备获得：

根据genbank中的bmp-2氨基酸和基因序列，构建适合在大肠杆菌中表达的bmp-2基因序列，其核苷酸序列(含部分酶切位点)为序列表中seqidno.1；将基因片段酶切后插入pet质粒载体，连接后转化大肠杆菌宿主；筛选阳性克隆，诱导bmp-2表达；发酵，破碎菌体，收集包涵体，包涵体裂解和蛋白复性；阴离子和阳离子交换层析纯化获得bmp-2，电泳显示单一的12kda左右条带(与报道的bmp-2一致)，产物氨基酸序列为序列表中seqidno.2。

以大肠杆菌宿主残留蛋白检测试剂盒检测大肠杆菌宿主残留蛋白(低于0.005％)，以抑菌圈法检测抗生素残留(低于0.1ppm)均符合进一步实验的需求。

实施例2改性壳聚糖的制备

以烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖：

将3g壳聚糖溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至90℃，加入6ml0.08mol/l硝酸铈，反应30min；加入9ml50％(质量)烯丙基三甲基氯化铵水溶液，反应2h；冷却，乙醇沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥得烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖。

产物红外光谱检测显示1415cm^-1(-nh)、1555cm^-1(c＝o)的特征吸收峰，表明烯丙基三甲基氯化铵已枝接在壳聚糖上。

以丙烯酰胺改性壳聚糖：

将3g壳聚糖溶液溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至50℃，加入5ml0.06mol/l硝酸铈，反应30min；加入8g丙烯酰胺，反应2h；冷却，加氢氧化钠溶液调节ph至10，得沉淀，丙酮洗涤沉淀，真空干燥得丙烯酰胺改性壳聚糖。

产物红外光谱检测显示1670cm^-1(-conh2)、1415cm^-1(-nh)、1574cm^-1(-nh2)的特征吸收峰，表明丙烯酰胺已枝接在壳聚糖上。

实施例3牙槽骨修复材料的制备及其基本性能

牙槽骨修复材料的羟基磷灰石、烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、以及bmp-2多肽成分(质量比5000：2000：1500：300)未使用时分别4℃冷藏保存。使用前，将bmp-2多肽与钙基质混合均匀，将改性壳聚糖和羟丙基甲基纤维素以40％的质量/体积浓度溶于ph5的pbs缓冲液，将bmp-2多肽与钙基质的混合物加入改性壳聚糖和羟丙基甲基纤维素溶液中，混合均匀即得牙槽骨修复材料。材料制备后需要在约15min的时间内塑型植入。

新制备的成品材料的压缩强度约177mpa，弯曲强度约250mpa，弹性模量月19gpa。

按照试剂盒说明书进行的cck-8细胞增殖毒性实验显示该材料的细胞毒性为cts0-i级，初步证实了其安全性。

另制备对照牙槽骨修复材料，其中使用壳聚糖替代改性壳聚糖，其他过程和成分不变。

实施例4材料的bmp-2体外释放实验

按照实施例3的方法配制骨修复材料和对照骨修复材料各3g(含bmp-265mg)，将其置于透析袋中，透析袋置于20ml含0.2％叠氮化钠的，ph7.0的pbs缓冲液中。静置于37℃下，在12h、24h、120h、240h、480h、720h、960h、1200h分别取样1ml(随后补充含0.2％叠氮化钠的，ph7.0的pbs缓冲液1ml)，按照试剂盒的说明以elisa法测定bmp-2浓度，换算计算累计释放百分数。结果如下表所示。

表1，bmp-2累计释放百分数。

对照材料中的bmp-2在240h内基本释放完成(同时材料中的壳聚糖基本消失，钙磷晶体状结构暴露)，而改性壳聚糖材料的药物释放时间延长至960h(40日)左右(同时材料中的壳聚糖基本消失，钙磷晶体状结构暴露)，基本与牙槽骨修复中的生长初期相对应，不亚于现有文献中提供的很多聚合物微球类材料，并且可以避免聚合物微球降解时的酸性环境和过敏问题。

实施例5壳聚糖过敏实验

选取体重约400g的hartley雄豚鼠30只，平均分为3组。在实验的第1、4日三组分别腹腔注射含2.0mg烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖、丙烯酰胺改性壳聚糖和未改性壳聚糖的水悬液，在实验的第7日三组分别注射含3.0mg烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖、丙烯酰胺改性壳聚糖和未改性壳聚糖的水悬液。在实验1、4、10日称量豚鼠体重。在实验第7-10日观察过敏反应情况，评价指标包括过敏反应阴性(正常)，过敏反应弱阳性(躁动、颤抖、搔鼻)，过敏反应阳性(喷嚏、呼吸急促、排尿粪、流泪)，过敏反应强阳性(呼吸困难、哮鸣音、紫癜、步态不稳、痉挛、旋转)，过敏反应极强阳性(死亡)。

表2壳聚糖过敏实验

结果显示，三组豚鼠平均体重变化情况基本一致(到第10日均增重约30-35g)；三组豚鼠中均未出现强过敏反应，但未改性壳聚糖组较高比例的豚鼠出现了弱过敏症状(与先前文献研究结果类似)，两种改性壳聚糖过敏情况明显优于未改性壳聚糖，其中烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖完全未观察到过敏情况.显示两种改性壳聚糖在致敏性上也取得了明显的改善。

实施例6牙槽骨实际修复实验

缺损构建

选取体重约4kg的新西兰大耳白兔6只，平均分为3组。麻醉、拔除上颌右侧中切牙。材料植入

缺损构建同时制备两种改性壳聚糖的材料和对照材料，简单塑型后植入缺损处，褥式加间断缝合。

效果观察

实验动物给予三日抗生素治疗；正常饲养90日后处死，分离上颌骨，10％福尔马林固定24h，骨组织磨片，goldner三色染色观察。

附图1的结果表明(灰度图无法显示蓝色、黄色部分)植入三种材料缺陷处均可见大量浅蓝色新生骨组织，但两种改性壳聚糖的材料的修复效果明显好于对照材料——新生骨组织填充多，深蓝色成骨细胞数量多，板层骨多，有梁小骨成熟，基本无肌肉组织浸润(肌肉组织浸润方面，丙烯酰胺改性壳聚糖材料组效果最佳)。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>浙江瑞谷生物科技有限公司

<120>含bmp-2的牙槽骨修复材料及其制备方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>348

<212>dna

<213>骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2)

<400>1

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<210>2

<211>115

<212>prt

<213>骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2)

<400>2

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