九味羌活制剂在制备抗71型肠道病毒药物中的用途的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及一种中药制剂在制备抗71型肠道病毒药物中的用途。
背景技术：
：1969年，美国在中枢神经系统疾病婴儿的粪便标本中分离出71型肠道病毒。根据国际病毒分类委员会(ictv)的最新分类，人肠道病毒被分为a、b、c、d和新肠道病毒(未分型)五类)，其中71型肠道病毒(ev71)被归为人肠道病毒a型。ev71病毒主要引起手足口病，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统疾病。手足口病和中枢神经系统感染是ev71感染而引起的两大常见临床症状。ev71是手足口病的主要病原。手足口病病传染性强，患者以4～5岁以下小儿多见，大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，大多数为良性过程，多自愈，但可复发，有时伴发无菌性脑膜炎、心肌炎等，目前缺乏有效治疗药物主要对症治疗。ev71累及神经系统主要表现为无菌性脑膜炎、脑炎及瘫痪性疾病，多发生于5岁以下幼儿，1岁以下婴儿发病率最高。临床表现变化多样，病情轻重不一，一般表现为阵挛、呕吐、共济失调、意向性震颤、眼球震颤及情感淡漠等。头颅mri及脑电图检查有助于明确疾病的严重性。九味羌活制剂是由羌活、防风、苍术、细辛、川芎、白芷、黄芩、甘草、地黄等九味中药制成的制剂，具有疏风解表，散寒除湿的功效，用于外感风寒挟湿所致的感冒，症见恶寒、发热、无汗、头痛、口干、肢体酸痛等。但目前尚未有九味羌活制剂抗71型肠道病毒的报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供九味羌活制剂在制药中的新用途。九味羌活制剂在制药中的新用途是：九味羌活制剂在制备抗71型肠道病毒药物中的用途。所述九味羌活制剂包括如下重量份的原料药：羌活20-40份，防风20-40份，苍术20-40份，细辛5-15份，川芎10-30份，白芷10-30份，黄芩10-30份，甘草10-30份，地黄10-30份。优选的，所述九味羌活制剂包括如下重量份的原料药：羌活30份，防风30份，苍术30份，细辛10份，川芎20份，白芷20份，黄芩20份，甘草20份，地黄20份。所述九味羌活制剂的剂型包括丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液剂、喷雾剂。所述九味羌活制剂的剂型优选为喷雾剂。本发明所涉及的九味羌活制剂对71型肠道病毒具有明显的抑制作用，具有毒性小、作用强、安全有效等优点，为由71型肠道病毒引起的疾病的预防和治疗开辟了新的途径，具有重要的社会价值、经济价值。为了公众能更好的理解本发明的有益效果，下面将通过实施例和体外细胞实验进一步阐明。附图说明图1是九味羌活喷雾剂对细胞产生毒性作用前后的显微照片对比。图2是药物对ev71病毒体外抑制作用显微照片对比。具体实施方式下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。实施例1九味羌活喷雾剂制备受试药物：九味羌活喷雾剂(江西普正制药有限公司，批号：170701)。所述受试药物的具体制备方法由以下步骤组成：羌活300g、防风300g、苍术300g、细辛100g、川芎200g、白芷200g提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。药渣与黄芩200g、甘草200g、地黄200g加水煎煮二次，每次1小时；合并上述煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.08～1.13，加乙醇使含醇量达50％，静置，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约900ml，加入上述挥发油和药用辅料，混匀，加水调整总量至1000ml,即得。实施例2九味羌活喷雾剂体外抗病毒实验rd细胞冻存管从液氮罐取出，立即投入37℃～42℃温水中融化，超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，800r/min，5min，弃冻存液，加入5ml浓度10％的1640细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。将ev71病毒接种于己经长成单层的rd细胞上，加1640维持液5ml置37℃、5％co2病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现90％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，1000r/min，5min，离心，取上清液定量分装于ep管中，封口膜封口，放于-80℃冰箱冻存备用。病毒毒力的测定：将病毒用1640维持液做10倍比系列稀释不同浓度，纵向重复4孔，依次接种于己长成单层的rd细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％co2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察24h，加5mg/ml的mtt10μl，37℃、5％co2培养箱中4小时，吸弃染液，加dmso100μl，室温脱色l0min，用酶标仪在490nm波长测定od值。根据reed-muench公式计算病毒液的半数感染浓度tcid50。细胞存活率＝各组od值/正常细胞od值×100％细胞病变率＝1－细胞存活率细胞比距＝(高于50％病变率－50％)/(高于50％病变率－低于50％病变率)×100％tcid50＝antilg(ig高于50％cpe百分率病毒稀释度+比距×稀释对数间的差)测定结果显示ev71病毒tcid50为10-4.31。实验时用100个tcid50作为病毒液浓度，因此需将病毒原液稀释200倍用于实验。药物对细胞毒性测定：九味羌活喷雾剂用1640维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长成单层rd细胞的96孔板中，并设3个复孔及细胞对照孔；37℃、5％co2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，连续观察3d，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性，mtt染色，用酶标仪在490nm波长测定od值，应用reed-muench公式计算药物半数中毒浓度(tc50)，并确定最小无毒浓度(tc50)。tc50＝[antilog(log高于50％cpe百分率病毒稀释度+比距)]×c抗ev71病毒实验：九味羌活喷雾剂从无毒浓度起用1640二倍比系列稀释10个浓度，每孔100μl，接种于已长成单层rd细胞的96孔板中，每孔再加入100μl的ev71病毒液，同时设利巴韦林阳性对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每组3个复孔。5％co2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，mtt染色，用酶标仪在490nm波长测定od值，应用reed-muench公式计算药物半数有效浓度(ec50)和治疗指数(ti)。ec50＝[antilog(log高于50％cpe百分率药物稀释度的值-比距)]×cti＝半数毒性浓度(tc50)/半数有效浓度(ec50)具体结果如下：病毒感染24小时后病毒组开始出现病变，药物组也开始显现病变，细胞在无毒浓度范围内随着药物浓度的降低，ev71感染细胞表现明显，细胞间变圆、破碎、脱落，24小时病毒对照组90％病变，药物组几个浓度梯度孔被完全保护，细胞生长良好。各组药物的治疗指数如下：九味羌活喷雾剂利巴韦林ti指数44.776.6实施例3实验动物采用spe级1日龄icr乳鼠，环境温度控制为23±2℃，相对湿度为75±10％，照明时间12h/d(7:00-19:00)。实验动物随机分为正常组、病毒组、九味羌活喷雾剂低剂量组(病毒+九味羌活喷雾剂，10μl/kg/day)，九味羌活喷雾剂高剂量组(病毒+九味羌活喷雾剂，20μl/kg/day)，除空白组乳鼠5只外，实验各组使用动物为11-14只，除正常对照组外，其他组采用颅内注射ev71病毒液进行感染，20μl/只，同时空白对照组乳鼠注射同量的dmem，感染后立即给药，每天给药一次，连续给药7天。从感染病毒当天开始连续观察21天，并记录小鼠体重，死亡数目以及死亡时间。实验数据以mean±sd表示，所有实验数据均采用spss13.0软件进行统计分析，各组小鼠的组间参数用anova进行检验，p<0.05被认为有统计学意义。感染后21天期间各组小鼠的发病率和死亡率用graphpadprism5生存分析法进行数据统计分析。具体结果如下：九味羌活喷雾剂对ev71病毒感染乳鼠的发病率的影响组别发病率(％)平均发病时间(天)空白组0—病毒组100.03.7±1.5九味羌活喷雾剂低剂量组50.09.5±3.3九味羌活喷雾剂高剂量组28.613.2±4.6九味羌活喷雾剂对ev71病毒感染乳鼠的死亡率的影响组别死亡率(％)平均存活时间(天)空白组0—病毒组58.311.9±3.5九味羌活喷雾剂低剂量组25.016.2±5.5九味羌活喷雾剂高剂量组7.118.2±6.1当前第1页12