伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用。

背景技术：

子宫颈癌作为女性肿瘤疾病发病率前几名的恶性肿瘤疾病，我国子宫颈癌发病情况存在较大的地理分布差异,大多数患者分布在中部地区，全国子宫颈癌死亡率最高地区是山西,依次是内蒙古、陕西、湖北、湖南、新疆等地。通常年龄小于30岁的已婚女性发生子宫颈癌的人数少，30岁后便随之年龄增加而发病率升高,发病年龄高峰为35岁-39岁/60岁-64岁,65岁以下女性患子宫颈癌的几率逐渐降低。近年来患子宫颈癌的女性年龄趋于年轻化（阮和云.宫颈癌高危因素及预防筛查的研究进展[j].世界最新医学信息文摘,2015,15(35):28-38）。子宫颈癌是一种常见的恶性肿瘤，对妇女、特别是发展中国家的妇女造成重大的健康负担。每年确诊的宫颈癌新病例有近52.9万例。宫颈癌的发生与国家的经济发展密切相关，发展中国家及相对落后的国家发病率较高。自然杀伤细胞(nk)是先天性免疫应答的一个组成部分，在抗肿瘤免疫应答中起着重要作用。nk细胞的抗肿瘤免疫应答依赖于其表面蛋白nkg2d介导的细胞杀伤作用。细胞mhci类分子相关蛋白a/b(mica/b)是最早被发现的能和nkg2d结合的配体，该蛋白与肿瘤免疫监视逃逸密切相关；因此，上调肿瘤细胞表面mica/b表达，是克服肿瘤免疫逃逸的重要策略。

目前，对于宫颈癌的治疗方法主要有手术、化疗、放疗以及免疫治疗。大多数子宫颈癌患者采取化疗和放疗相结合的方法，抑制肿瘤的生长。与单纯放疗相比，化疗结合放疗更有利于抑制肿瘤细胞的增殖及提高患者生存率。大部分患者难以承受术后相应的序贯疗法，特别是放、化疗过程中出现的毒副反应，如骨髓抑制等。另外，癌症的基因治疗费用较高，且可能改变基因的正常功能，具有潜在不可预知的副作用。免疫疗法主要为疫苗治疗子宫颈癌对年龄有要求，随着年龄的增大疫苗所起到的作用也有所下降，hpv疫苗并不能对宫颈癌患者产生治疗作用。因此，开发新的抗肿瘤药物及治疗方法，提高宫颈癌的治疗效果对提高宫颈癌患者的总体生存和生活质量具有重要的临床意义。

组蛋白脱乙酰酶抑制剂（hdaci），例如伏立诺他和丙戊酸，在治疗人类恶性肿瘤的临床试验中显示出一定的潜力。2007年伏立诺他（vorinostat）是被fda批准的第一个用于肿瘤治疗的组蛋白脱乙酰酶抑制剂，用于治疗皮肤t细胞淋巴瘤（ctcl）。但临床ⅰ期和ⅱ期试验的结果暂未证实伏立诺他对于实体瘤的治疗效果，因此，伏立诺他并未被批准用于实体肿瘤的治疗。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂（hdaci）除了直接对肿瘤细胞生长的有影响作用外，还能上调mhcⅰ类相关链分子a和b(mica和micb)，增强肿瘤细胞对自然杀伤细胞介导细胞溶解的敏感性,与激活不同类型肿瘤的不同信号信号通路,并针对恶性肿瘤细胞有关。mica是一种重要的nkg2dls，可以有效激活nkg2d受体，从而诱导nk细胞介导的细胞杀伤。此外，mica的弱表达与肿瘤的弱分化和更多的淋巴侵袭有关。最近有报道称，pi3k/akt信号通路参与了hdaci诱导的人胰腺癌中mica上调。我们预测伏立诺他可下调pi3k(p110ɑ)蛋白表达，增强nk细胞对子宫颈癌细胞的免疫作用。伏立诺他作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，目前还没有关于其对人类子宫颈癌的影响和相关作用机制的报道。

分子谱的最新进展表明pi3k/akt/mtor通路介导了多种细胞功能。pi3k/akt信号通路的激活对许多实体瘤的肿瘤细胞生长和存活至关重要。pi3k在许多癌症中都有高表达，尤其是子宫颈癌。因此，针对pi3k/akt信号通路的几种药物被开发出来用于治疗人类子宫颈癌。pi3k抑制剂ly294002已被证实在体外和体内多种肿瘤类型中具有抗癌作用。

可见，现有技术还有待改进和提高。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供伏立诺他在制备宫颈癌药物中的应用，提高宫颈癌的治疗效果，解决现有技术中宫颈癌的治疗方法难以被大部分患者接受、具有潜在不可预知的副作用、费用高；宫颈癌的免疫疫苗适用性低，对已发病的患者不具有治疗作用的问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用。

所述的伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用中，所述伏立诺他为伏立诺他及其衍生物。

所述的伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用中，所述宫颈癌的癌细胞为siha、hela细胞。

所述的伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用中，所述药物为伏立诺他、伏立诺他的衍生物、含有伏立诺他的组合物或含有伏立诺他的衍生的组合物中的一种。

所述的伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用中，所述药物的给药方式为口服或注射。

所述的伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用中，所述药物的剂型为片剂、糖衣丸、明胶胶囊、可注射制剂、可饮用混悬剂或可崩解糊剂中的一种或几种。

有益效果：

本发明提供了伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用，通过伏立诺他下调pi3k(p110α)蛋白表达，增强nk细胞对子宫颈癌的癌细胞siha和hela的免疫作用，达到治疗和预防宫颈癌的目的;所述药物副作用小，价格低廉，具有良好的开发前景。

附图说明

图1为本发明提供的伏立诺他抑制宫颈癌细胞增殖情况图。

图2为伏立诺他激活宫颈癌细胞表面mica表达图，

其中，a为mrna水平；b为蛋白水平。

图3为伏立诺他激活宫颈癌细胞表面mica表达与pi3k/akt信号通路关系图。

图4为伏立诺他与顺铂药物对裸鼠宫颈异种移植瘤生长的抑制对比图。

具体实施方式

本发明提供伏立诺他在制备抗宫颈癌药物中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

值得说明的是，以下实施例所涉及的人类宫颈癌细胞株（siha和hela）分别来自佛山市妇幼保健院科研实验室，并在培养基（dmem）中添加10%胎牛血清（invitrogen,carlsbad,ca,usa）和1%青霉素链霉素（sigma,stlouis,mo,usa）；nk-92细胞系（nk细胞白血病）取自佛山市妇幼保健院科研实验室。实验动物24只雌性裸鼠(balb/c,4-5周龄)，取自广东省动物中心。所述动物被安置在制定的无菌室控制空气条件下（温度20-25°c,湿度50-65%）和自由进食无菌食物和水。

一、细胞增殖实验

将宫颈癌细胞置于96孔板中，细胞浓度1x10⁴细胞/孔，伏立诺他(0～400μm)于37℃，含5%二氧化碳的细胞培养箱培养48h。为了评估细胞活力，使用cck8(细胞计数kit-8,dojindo分子技术)，48小时后,加10μlcck-8培养4小时，使用酶标仪测定吸光度，其测定结果如图1所示。伏立诺他抑制宫颈癌细胞siha和hela细胞增殖的ic50值分别为28.5±6.7μm和3.7±1.2μm。

二、rna提取和rt-pcr

子宫颈癌细胞加入含脱氧核糖核酸酶ⅰ的细胞裂解液25μl后，于室温下孵育8分钟。然后,加入2.5μl终止液终止裂解反应。每个rt-pcr反应混合物包含1.5μl10xrt缓冲液,0.15μldntp混合物,0.19μlrna酶抑制剂，1μlmultiscribe(tm)rt，4.16μlnuclease-free水，3μlrt逆转录引物，5μlcells-to-ct样品溶解产物。除非另有说明，所有使用的试剂均购自abi(应用生物系统)。rt进行热循环(geneamppcr系统9700)如下:16℃维持30分钟,42℃维持30分钟,85℃维持5分钟,最后维持在4℃。对包括阴性对照的qrt-pcr反应进行重复。实时pcr检测microrna的杂交探针实验使用2×taqmanmastermix和taqmanmicrorna。将单个细胞逆转录后的cdna反应混合物重复三次，评价rt-pcr在单细胞水平上的可重复性。每个pcr反应混合物包含10μl2×taqmanmastermix，1μltaqmanmicrorna，7.67μlnuclease-free水（不含核酸酶的水）,1.33μl逆转录产物。反应是在热循环中运行(abi7500实时pcr)如下:95℃维持10分钟,其次是95℃下循环40次，维持10秒，58℃维持60秒。采用细胞数量归一化的相对量化方法。计算方程:δct=ct(校准器)-ct(测试)。将第一个样本的ct值设置为默认校准值。这个变化用公式计算:比值(测试/校准)=2ct(校准)-ct(测试)，结果如图2a所示，伏立诺他促进宫颈癌细胞表面micamrna表达。

三、流式细胞术分析

肿瘤细胞系中mica蛋白的表达由以下流式细胞术进行分析。试剂：抗mica人和鼠源性抗体（mbl,am01，日本）、clearblack（人fc受体阻断剂，mbl；mtg-001，日本）、fitc抗鼠igg(poly4060,biolegend,sandiego,ca)。给药（伏立诺他0μm/2μm/5μm/10μm）于37℃，含5%二氧化碳的细胞培养箱培养48h，两天后用trypsin-edta溶液(biosharpbl501a)收取肿瘤细胞，用pbs洗涤缓冲液冲洗细胞3次[pbs含有2%胎牛血清(fcs)和0.1%nan3]，测定mica蛋白表达，结果如图2b所示，伏立诺他促进宫颈癌细胞表面mica蛋白表达。

四、细胞免疫荧光染色

用t-bst清洗后，将宫颈癌siha和hela细胞在12孔板上的盖玻片上固定和透化。用pi3k抗体（proteintech,chicago,il）和免疫荧光标记的二次抗体（细胞信号技术，danvers，ma）、小分子化合物ly29004（sigma,usa）孵育细胞，最后用共聚焦显微镜观察图像。结果如图3所示，伏立诺他激活宫颈癌细胞表面mica表达与pi3k/akt信号通路相关。当采用ly29004阻断pi3k/akt信号通路，伏立诺他对宫颈癌细胞表面mica表达影响降低。

五、ldh细胞毒性实验

使用皮尔斯ldh细胞毒性检测试剂盒（thermo，编号：88953）。1×10⁴细胞/孔并设置三个副孔，加不同数量的nk细胞（效应器细胞为nk细胞，靶细胞为siha及hela细胞，效应器细胞：靶细胞=2.5:1、2.5:5、2.5:10）孵育48小时。最后的体积是100μl/孔。孵化靶细胞前，nk细胞加入500iu/ml白介素2，在37℃含5%二氧化碳的培养箱中孵育48小时。伏立诺他浓度分别为10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0μm。如表1、表2所示，伏立诺他促进nk细胞对siha和hela细胞的杀伤能力。

表1伏立诺他促进nk细胞对siha细胞的杀伤作用

表2伏立诺他促进nk细胞对hela细胞的杀伤作用

六、肿瘤异种移植实验

3-4周大的雌性balb/c裸鼠在spf室中饲养，该spf室来自广东省实验动物中心。将1x10⁷个细胞注射到裸鼠距腋窝1-2cm的皮下组织中。分别建立模型组、伏立诺他组和顺铂对照组。所述模型组不给药，自然生成长；肿瘤生长至2-3mm后，伏立诺他组每天从腹腔注射伏立诺他，浓度为0.54mg/kg/d，顺铂对照组给予顺铂2mg/kg，每3天给药一次。每天测量小鼠的肿瘤大小和体重，用公式：0.5×长×宽²计算肿瘤体积。给药30天后，小鼠颈椎脱位处死，并测量肿瘤大小。如图4所示，结果显示，伏立诺他能够抑制裸鼠宫颈异种移植瘤的生长。

综上所述，伏立诺他可以下调pi3k(p110ɑ)蛋白表达，增强nk细胞对子宫颈癌细胞的免疫作用，抑制宫颈癌细胞siha及hela的生长，起到预防和治疗宫颈癌的目的。所述药物比顺铂药物的副作用小，价格相对于宫颈癌疫苗要低廉，且对已发病的病人有治疗作用，具有广大的开发前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。