一种对耐药肿瘤选择性杀伤或nM水平高效杀伤的药物组合物及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种对耐药肿瘤选择性杀伤或nm水平高效杀伤的药物组合物及其应用。

背景技术：

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的重大疾病，并已成为当今疾病致死的主要原因之一。目前恶性肿瘤的主要治疗手段有手术治疗、放疗和化疗等。由于手术后肿瘤的复发和转移仍需要化疗，故化疗仍然是目前应对肿瘤的主要手段。临床医生通过调节用药剂量可以优化得到最大的疗效和最小的毒性，帮助患者延长生存时间和提高预后生活质量。然而，肿瘤细胞的耐药性的产生导致肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降，大大限制了化疗的治疗的效果(dean,m.,t.fojo,ands.bates,tumourstemcellsanddrugresistance.natrevcancer,2005.5(4):p.275-84.)。肿瘤细胞对某种药物产生耐药性之后，会对从未接触过的、结构不同、作用机制各异的多种化疗药物产生交叉耐药，这种现象称为肿瘤的多药耐药性(multipledrugresistance,mdr)。多药耐药的产生是当前肿瘤治疗的所面临的重大难题之一(h,l.,anoverviewofcancermultidrugresistance:astillunsolvedproblem.cell.mol.lifesci.,2008.65:p.3145–3167；mellor,h.r.andr.callaghan,resistancetochemotherapyincancer:acomplexandintegratedcellularresponse.pharmacology,2008.81(4):p.275-300；mimeault,m.,r.hauke,ands.batra,recentadvancesonthemolecularmechanismsinvolvedinthedrugresistanceofcancercellsandnoveltargetingtherapies.clinpharmacolther.,2008.83:p.673–691)。加大药物剂量不仅对mdr无效的，甚至还能产生更强的毒性和进一步诱导耐药的产生(akan,i.,etal.,n-acetylcysteineenhancesmultidrugresistance-associatedprotein1mediateddoxorubicinresistance.eurjclininvest,2004.34(10):p.683-9；akan,i.,etal.,multidrugresistance-associatedprotein1(mrp1)mediatedvincristineresistance:effectsofn-acetylcysteineandbuthioninesulfoximine.cancercellint,2005.5(1):p.22；choi,c.h.,abctransportersasmultidrugresistancemechanismsandthedevelopmentofchemosensitizersfortheirreversal.cancercellint,2005.5:p.30；liscovitch,m.andy.lavie,cancermultidrugresistance:areviewofrecentdrugdiscoveryresearch.idrugs,2002.5(4):p.349-55)。多数与mdr有关的药物都是疏水性或者两亲性的天然产物，如紫杉烷类、蒽环类抗生素、长春花生物碱类等。mdr的产生具有多种机制，包括细胞对一些水溶性药物摄取的减少，细胞周期的改变，dna修复功能的增强，抑制细胞的凋亡，药物在细胞内的代谢过程的改变，对疏水性药物和易于进入细胞的一些药物外排的增加等。肿瘤mdr的形成过程复杂，这些耐药机制常同时存在，但以一种机制为主，不同机制之间互相影响，可能单独或联合起作用(g.,etal.,targetingmultidrugresistanceincancer.natrevdrugdiscov,2006.5(3):p.219-34.)。

番荔枝(annonasquamosa)为番荔枝科(annonaceae)番荔枝属(annona)植物，原产美洲，为热带和亚热带地区著名水果，其果外形酷似荔枝，故名“番荔枝”，为岭南中药之一。全世界有番荔枝科植物130个属，我国广东等岭南地区分布24属、109种，资源十分丰富(李延辉.中国科学院中国植物志编委会(ed.),科学出版社,北京,1979,10-175；余竞光等,番荔枝种子化学成分研究,药学学报,29(1994))。自1976年从番荔枝科植物紫玉盘属uvariaaccuminata中分离得到了第一个番荔枝内酯varicinin，表明其具有较强的抗癌、杀虫和抗菌活性(c.jr,t.sj,w.rm,a.sk,b.rb,uvaretin,anewanti-tumoragentfromuvariaacuminata(annonaceae),jorgchem,41(1976)1852～1855)以来，番荔枝内酯类化合物(annonaceousacetogenins,aags)激发了国内外科学家们的广泛关注和研究。

目前关于番荔枝有效部位对耐药肿瘤细胞nm水平的生长抑制作用尚未见报道，关于番荔枝提取物、有效部位、单体化合物对耐药肿瘤细胞的选择性杀伤作用也未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对耐药肿瘤选择性杀伤或nm水平高效杀伤的药物组合物及其应用，能逆转肿瘤细胞的多药耐药特性，增强化疗药物对肿瘤多药耐药肿瘤细胞的治疗效果，同时还可解决总内酯的难溶和难给药问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种耐药肿瘤选择性杀伤或nm水平高效杀伤的药物组合物，包括以下有效成分：番荔枝种子提取物。

优选的，所述番荔枝种子提取物的形态还包括：番荔枝内酯有效部位或番荔枝内酯单体；所述番荔枝内酯单体包括squamocin、bullatacin或isoannonareticin；有效部位中的其他单体成分，包括squamostatin-a、squamostatin-b、cherimolin、desacetyluvaricin、motrilin和annonareticin。

优选的，所述耐药肿瘤的种类包括：乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌、结肠癌或胰腺癌。

优选的，所述耐药肿瘤的耐受药物包括：阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、herceptin单抗、喜树碱、羟基喜树碱或5-氟尿嘧啶。

优选的，所述番荔枝种子提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将番荔枝种子粉碎，得到颗粒物；

(2)将所述颗粒物与脱脂溶剂混合，脱脂后固液分离，得到滤渣；

(3)将所述滤渣与提取溶剂混合提取后固液分离，得到液相；

(4)去除所述液相中的溶剂，得到番荔枝种子提取物。

优选的，步骤(2)所述脱脂溶剂包括石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种；所述脱脂溶剂的体积与颗粒物的质量比为200～10000ml：20～250g；所述脱脂的时间为3～8h。

优选的，步骤(3)所述提取溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种；所述提取溶剂的体积与颗粒物的质量比为200～2000ml：20～250g。

优选的，所述番荔枝总内酯有效部位的制备方法，包括以下步骤：

①将所述番荔枝种子提取物与水混合，得到提取物的水悬浮液；

②将所述提取物的水悬浮液与乙酸乙酯混合，萃取，得到乙酸乙酯萃取液；

③去除所述乙酸乙酯萃取液中的溶剂，得到萃取物；

④将所述萃取物与硅胶混合拌样，上柱，依次用正己烷、体积比为5：95的丙酮-正己烷、体积比为15：85的丙酮-正己烷洗脱，收集体积比为15：85的丙酮-正己烷洗脱液，减压回收溶剂，得到有效部位。

本发明还提供了上述药物组合物在制备杀伤耐药肿瘤的药物中的应用。

优选的，所述药物的有效成分包括：所述药物组合物和/或所述耐药肿瘤的耐受化疗药物。

优选的，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊、颗粒、微囊、注射液、冻干粉针、凝胶、外用制剂或腔道给药制剂。

本发明提供了一种杀伤耐药肿瘤的药物组合物，包括以下有效成分：番荔枝种子提取物、番荔枝内酯有效部位或番荔枝内酯单体；所述番荔枝内酯单体包括squamocin、bullatacin或isoannonareticin；还包括总内酯有效部位中的其他成分，包括但不限于squamostatin-a、squamostatin-b、cherimolin、desacetyluvaricin、motrilin、annonareticin。在本发明实施例中，所述有效成分在中等剂量时对多种耐药性肿瘤具有很强的直接杀伤作用，该杀伤作用还显著强于对相应的不耐药肿瘤细胞，显示出对耐药肿瘤细胞的特殊选择性，具有良好的应用前景，可将其应用于制备杀伤耐药肿瘤的药物。

附图说明

图1为番荔枝总内酯acgs对人乳腺癌mcf-7细胞的生长抑制曲线；

图2为番荔枝总内酯acgs和三个单体化合物对耐阿霉素的乳腺癌细胞mcf-7/adr的生长抑制曲线；

图3为番荔枝总内酯acgs和三个单体化合物对耐herceptin的乳腺癌bt474-herdr细胞的生长抑制曲线；

图4为总内酯acgs三种不同纳米粒对耐herceptin的乳腺癌bt474-herdr细胞的生长抑制曲线；

图5为番荔枝总内酯acgs和三个单体化合物对耐阿霉素的乳腺癌细胞bt474-lapdr的生长抑制曲线；

图6为番荔枝总内酯acgs和三种纳米粒对耐紫杉醇的乳腺癌细胞mcf-7/ptx的生长抑制曲线；

图7为从番荔枝总内酯acgs中分离出来的两个单体化合物k16、k19对bt474-lapdr生长抑制曲线；

图8为番荔枝总内酯acgs对耐药性人乳腺癌细胞mcf-7/ptx半数抑制浓度曲线；

图9为本发明总内酯有效部位的hplc图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种杀伤耐药肿瘤的药物组合物，包括以下有效成分：番荔枝种子提取物。

本发明所述药物组合物的有效成分，包括番荔枝种子提取物，所述番荔枝种子提取物的形态优选还包括：番荔枝内酯有效部位或番荔枝内酯单体；所述番荔枝内酯单体包括squamocin、bullatacin或isoannonareticin；有效部位中的其他单体成分，包括squamostatin-a、squamostatin-b、cherimolin、desacetyluvaricin、motrilin和annonareticin。

本发明所述番荔枝种子提取物的制备方法，优选包括如下步骤：

(1)将番荔枝种子粉碎，得到颗粒物；

(2)将颗粒物与脱脂溶剂混合，脱脂后固液分离，得到滤渣；

(3)将滤渣与提取溶剂混合，提取后固液分离，得到液相；

(4)去除液相中的溶剂，得到番荔枝种子提取物。

本发明在制备所述番荔枝种子提取物时，将番荔枝种子粉碎，得到颗粒物，所述颗粒物的粒径优选为2～25目，更优选为10～18目。本发明所述番荔枝种子的种类包括但不限于番荔枝、圆滑番荔枝或刺果番荔枝。

本发明将颗粒物与脱脂溶剂混合，脱脂后固液分离，得到滤渣，所述脱脂溶剂优选包括石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种；所述脱脂溶剂的使用量与颗粒物的质量比为200～10000ml：20～250g。本发明所述脱脂的时间优选为3～8h。

本发明将滤渣与提取溶剂混合，提取后固液分离，得到液相，所述提取溶剂优选包括乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种；所述提取溶剂的使用量与颗粒物的质量比为200～2000ml：20～250g。本发明所述提取的方法优选包括超声提取法、闪式提取法或渗漉。本发明对所述提取方法的具体操作步骤并没有特殊限定，优选的在提取的全过程控制温度不至于过高，或者只能短时间受热。

本发明去除液相中的溶剂，得到番荔枝种子提取物。本发明对所述去除溶剂的方法并没有特殊限定，优选利用减压蒸馏。本发明对所述减压蒸馏的条件并没有特殊限定，优选温度不超过65℃，更优选为55～65℃，最优选为60℃。

本发明可利用所述番荔枝种子提取物制备有效部位，所述有效部位的制备方法，优选包括如下步骤：

①将所述番荔枝种子提取物与水混合，得到提取物的水悬浮液；

②将所述提取物的水悬浮液与乙酸乙酯混合，萃取，得到乙酸乙酯萃取液；

③去除乙酸乙酯萃取液中的溶剂，得到萃取物；

④将所述萃取物与硅胶混合拌样，上柱，依次用正己烷、体积比为5：95的丙酮-正己烷、体积比为15：85的丙酮-正己烷洗脱充分，收集体积比为15：85的丙酮-正己烷洗脱液，减压回收溶剂，得到有效部位。

本发明对所述番荔枝内酯单体的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述番荔枝内酯单体的分子结构如式i所示：

其中squamocin(k19)的分子结构如式ii所示：

bullatacin(k16)的分子结构如式iii所示：

isoannonareticin(k109)的分子结构如式iv所示：

在本发明中，所述有效成分优选以纳米粒形式存在，所述纳米粒的载体包括p188、tpgs或pcl2000-peg2000。本发明对所述纳米粒的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。

本发明所述耐药肿瘤的种类优选包括：乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌、结肠癌或胰腺癌。

本发明还提供了上述药物组合物在制备杀伤耐药肿瘤的药物中的应用。

本发明所述药物的有效成分优选包括：所述药物组合物和/或所述耐药肿瘤的耐受化疗药物，所述耐药肿瘤的耐受化疗药物优选包括：阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、herceptin单抗、喜树碱、羟基喜树碱、紫杉醇或5-氟尿嘧啶。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，优选包括液体、固体或半固体，更优选包括注射剂、冻干剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂、微丸、凝胶剂、口崩制剂、缓释制剂、控释制剂或各种微粒给药系统。本发明所述药物在制剂中可以以分子状态、纳米颗粒、脂质体、包合物、微米颗粒等形式存在。

下面结合实施例对本发明提供的杀伤耐药肿瘤的药物组合物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

圆滑番荔枝，乙醇超声提取(圆-乙醇超声提取物)

取干燥的圆滑番荔枝种子20g，粉碎成10-18目的颗粒，加正己烷浸泡脱脂2次(每次使用200ml正己烷，间歇振摇，时间5h)，滤纸抽滤，滤渣加入200ml无水乙醇，25℃和250w超声提取两次，每次30min，滤纸抽滤，合并两次滤液，55℃减压加热旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥，得乙醇超声提取物。

实施例2

番荔枝，乙醇超声提取(土-乙醇超声提取物)

取干燥的番荔枝种子20g，粉碎成10-18目的颗粒，加正己烷浸泡脱脂2次(每次使用200ml正己烷，间歇振摇，时间5h)，滤纸抽滤，滤渣加入200ml无水乙醇，25℃和250w超声提取两次，每次30min，滤纸抽滤，合并两次滤液，55℃减压加热旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥，得乙醇超声提取物。

实施例3

刺果番荔枝，乙醇超声提取(刺-乙醇超声提取物)

取干燥的刺果番荔枝种子20g，粉碎成10-18目的颗粒，加正己烷浸泡脱脂2次(每次使用200ml正己烷，间歇振摇，时间5h)，滤纸抽滤，滤渣加入200ml无水乙醇，25℃和250w超声提取两次，每次30min，滤纸抽滤，真空干燥，合并两次滤液，55℃减压加热旋转蒸发除去有机溶剂，得乙醇超声提取物。

实施例4

圆滑番荔枝，乙醇回流提取(圆-醇回流提取物)

取干燥的圆滑番荔枝种子185g，粉碎成10-18目的颗粒，加正己烷脱脂2次(每次使用7l正己烷，间歇振摇，时间5h)，滤纸抽滤，滤渣加入1400ml95％乙醇，70℃回流提取两次，每次30min，滤纸抽滤，合并两次滤液，60℃减压加热旋转蒸发除去有机溶剂，得95％醇回流提取物，-20℃冰箱预冻12h，-40℃和0.12pa冻干，得两部分样品，瓶底棕褐色浸膏，命名为“圆-醇回流提取物-固”；上层油状液体，命名为“圆-醇回流提取物-液”。

实施例5

圆滑番荔枝，组织破碎(闪式)动态提取取干燥的圆滑番荔枝种子200g，粉碎成15目的颗粒，放置在体积为2.5l的闪式提取器中，加1.5l正己烷脱脂3次(室温，转速5000rpm，时间15min，期间间歇3次)，5000rpm离心10min，沉淀再加1l正己烷同法脱脂，共脱脂三次；弃上清，沉淀加入1.0l95％乙醇闪式提取3次(室温，转速5000rpm，每次时间15min，每提取5min间歇2min，5000rpm离心10min，沉淀用于下一次继续提取)，合并三次提取液，60℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，得95％醇闪式提取物。

实施例6

番荔枝总内酯(acgs)，有效部位

将实施例5中的提取物，均匀分散在3倍重量的水中，得到水悬浮液，加入悬浮液2倍体积的乙酸乙酯振摇混匀，静置萃取3次。合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物，用萃取物1.3倍重量的硅胶拌样，加载在1倍重量(含样硅胶)的干净硅胶装填的柱子上，先用10倍柱床体积的正己烷洗脱(弃去洗脱液)，再用10倍柱床体积的丙酮-正己烷(5:95，v/v)洗脱(弃去洗脱液)，然后用40倍柱床体积的丙酮-正己烷(15:85，v/v)洗脱，收集这部分洗脱液，减压回收溶剂得总内酯有效部位(简称为acgs)。

实施例7番荔枝种子提取物和有效部位的色谱分析和含量测定

hplc色谱条件：waters高效液相色谱仪(waters2695型泵，waters2996检测器，empower工作站)；色谱柱为diamonsilc18(2)，5um，4.6*250mm；流动相为动相为：a乙腈，b为0.3磷酸水，梯度洗脱：0～10min29％～29％b,10～35min27％～27％b,35～45min25％～25％b,45～55min15％～15％b，55～70min29％～29％b；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：210nm；进样量：20μl。

精密称取k20(squamostatin-b)、k437(cherinolin)，k19(squamocin)，k16(bullatacin)、k109(isoannonareticin)对照品各1mg于5ml容量瓶中，用乙腈定容，从中依次取出0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，0.5ml置1ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度。得到质量浓度为1.6，4，8，20，40，60，100μg/ml的溶液，进样测定峰面积a，以番荔枝各指标成分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。

将实施例5中的番荔枝种子提取物、实施例6中的乙酸乙酯萃取物和得到的总内酯有效部位配制成适当浓度的甲醇溶液，按照hplc色谱条件进样获得色谱图，并根据得到的5个对照品的色谱峰和回归方式测定实施例5中的番荔枝种子提取物、实施例6中的乙酸乙酯萃取物和得到的总内酯有效部位中5个指标性成分的总含量。

结果如图9所示，其中图9-1为番荔枝种子乙醇提取物的hplc图谱(5个主化合物含量为8％)，图9-2为番荔枝种子醇提物的乙酸乙酯部分hplc图谱(5个主化合物含量为20％)，图9-3为番荔枝总内酯有效部位hplc图谱(5个主化合物含量为62％，其中k19和k16合计约51％)。有效部位中，5种指标性成分含量合计超过60％，两个主要成分k19和k16含量合计约50％。

实施例8

番荔枝，有效部位

取干燥的圆滑番荔枝种子200g，粉碎成10-18目的颗粒，加正己烷脱脂2次(每次使用8l正己烷，间歇振摇，时间5h)，滤纸抽滤，滤渣加入1500ml95％乙醇回流提取两次，每次1h，滤纸抽滤，合并两次滤液，50℃减压加热旋转蒸发除去有机溶剂，得95％醇回流提取物，然后均匀分散在3倍量水中，加入2倍体积的乙酸乙酯振摇混匀，静置萃取3次。合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，用1.3倍重量的硅胶拌样，加载在1倍重量的干净的硅胶装填的柱子上，先用10倍体积的正己烷洗脱(弃去洗脱液)，再用10倍体积的丙酮-正己烷(5:95，v/v)洗脱(弃去洗脱液)，然后用40倍体积丙酮-正己烷(15:85,v/v)洗脱，收集这部分洗脱液，减压回收溶剂得总内酯有效部位(简称为acgs)

实施例9

p188-acgs纳米粒

称取5mg番荔枝总内酯溶于0.5ml无水乙醇中，5mg泊洛沙姆p188溶于5ml去离子水中，常温在250hz超声条件下将上述乙醇溶液缓慢滴注至溶有p188的去离子水中。滴注完毕后，旋蒸除去乙醇，即得acgs纳米粒。动态光散射法测得平均粒径为169.8nm，多分散性指数(pdi)为0.108，电位值-17.8mv。

实施例10

tpgs-acgs纳米粒

称取5mg番荔枝总内酯、5mg维生素e聚乙二醇琥珀酸酯tpgs共溶于0.5ml无水乙醇中，常温在250hz超声条件下将上述乙醇溶液缓慢滴注至去5ml离子水中。滴注完毕后，旋蒸除去乙醇，即得acgs纳米粒。动态光散射法测得平均粒径为136.0nm，多分散性指数(pdi)为0.195，电位值-19.6mv。

实施例11

pcl-peg-acgs纳米粒

称取5mg番荔枝总内酯溶于0.5ml无水乙醇中，5mg聚乙二醇2000-聚己内酯2000peg2k-pcl2k溶于0.2ml丙酮中，两者混匀，常温在250hz超声条件下将上述混合溶液缓慢滴注至5ml去离子水中。滴注完毕后，旋蒸除去有机溶剂，即得acgs纳米粒。动态光散射法测得平均粒径为133.9nm，多分散性指数(pdi)为0.175，电位值-16.2mv。

实施例12

圆滑番荔枝种子乙醇超声提取物-p188纳米粒(p188-圆-乙醇超声提取物)

称取10mg圆滑番荔枝种子乙醇超声提取物溶于1ml无水乙醇中，10mg泊洛沙姆p188溶于10ml去离子水中，常温在250hz超声条件下将上述乙醇溶液缓慢滴注至溶有p188的去离子水中。滴注完毕后，旋蒸除去乙醇，即得acgs纳米粒。动态光散射法测得平均粒径为177.3nm，多分散性指数(pdi)为0.112，电位值-33.8mv。

实施例13

番荔枝种子乙醇超声提取物-p188纳米粒(p188-土-乙醇超声提取物)

称取5mg番荔枝种子乙醇超声提取物溶于0.5ml无水乙醇中，5mg泊洛沙姆p188溶于5ml去离子水中，常温在250hz超声条件下将上述乙醇溶液缓慢滴注至溶有p188的去离子水中。滴注完毕后，旋蒸除去乙醇，即得acgs纳米粒。动态光散射法测得平均粒径为177.9nm，多分散性指数(pdi)为0.128，电位值-12.8mv。

实施例14

“圆-醇回流提取物-固”-p188纳米粒(p188-圆-醇回流提取物-固)

称取10mg圆-醇回流冻干-固溶于1ml无水乙醇中，10mg泊洛沙姆p188溶于10ml去离子水中，常温在250hz超声条件下将上述乙醇溶液缓慢滴注至溶有p188的去离子水中。滴注完毕后，旋蒸除去乙醇，即得acgs纳米粒。动态光散射法测得平均粒径为197.3nm，多分散性指数(pdi)为0.286，电位值-24.6mv。

实施例15

“圆-醇回流提取物-液”-p188纳米粒(p188-圆-醇回流提取物-液)

称取10mg圆-醇回流冻干-液溶于1ml无水乙醇中，10mg泊洛沙姆p188溶于10ml去离子水中，常温在250hz超声条件下将上述乙醇溶液缓慢滴注至溶有p188的去离子水中。滴注完毕后，旋蒸除去乙醇，即得acgs纳米粒。动态光散射法测得平均粒径为279.6nm，多分散性指数(pdi)为0.370，电位值-19.6mv。

实验例1

对普通乳腺癌细胞mcf-7的体外生长抑制作用

实验方法：1)调整普通的乳腺癌细胞mcf-7生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)用dmso溶解实施例6制备的番荔枝种子有效部位acgs(平均分子量按照622估算)，配制100mm储液，用培养基对待测物稀释得到50μm、15.8μm、5μm、1.58μm、0.5μm、0.158μm、0.05μm、0.0158μm、0.005μm，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，以空白培养基为对照，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果如表1和图1所示，番荔枝总内酯对人乳腺癌细胞mcf-7生长抑制的半数抑制浓度ic50分别为12.45μm，显示出对人乳腺癌细胞的中等强度的杀伤作用。

表1番荔枝总内酯acgs和三个单体化合物对人乳腺癌mcf-7细胞和耐阿霉素的乳腺癌细胞mcf-7/adr的半数抑制浓度ic50值

实验例2

对耐阿霉素的乳腺癌细胞mcf-7/adr的体外生长抑制作用

实验方法：1)调整普通的乳腺癌细胞mcf-7/adr生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)用dmso溶解待测样品(番荔枝种子有效部位acgs(平均分子量按照622估算)，从番荔枝种子乙醇提取物中分离出来的单体化合物bullatacin(k16)、squamocin(k19)、isoannonareticin(k109)，配制100mm储液，用培养基对待测物稀释得到50μm、15.8μm、5μm、1.58μm、500nm、158nm、50nm、15.8nm、5nm系列浓度，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将不同浓度的药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，以空白培养基为对照，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果图表1和图2所示，番荔枝总内酯acgs对耐药性人乳腺癌细胞mcf-7/adr半数抑制浓度ic50为0.5242μm，不到对不耐药的人乳腺癌细胞mcf-7的ic50值(12.45μm)的1/23，显示出对耐药性肿瘤细胞的选择性。同时，从acgs中分离出来的三个单体化合物k16、k19、k109对mcf-7/adr的生长抑制与acgs处于同一水平，其ic50值分别为0.9501、0.5368和0.4615μm。因为k16、k19、k109在acgs中的含量总和不超过60％。

实验例3

总内酯和单体成分对耐herceptin的乳腺癌细胞bt474-herdr的生长抑制作用

实验方法：1)调整耐药的乳腺癌细bt474-herdr生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)用dmso溶解待测样品(番荔枝种子有效部位acgs(平均分子量按照622估算)、单体化合物bullatacin(k16)、squamocin(k19)、isoannonareticin(k109)，配制100mm储液，用培养基对待测物稀释得到50μm、15.8μm、5μm、1.58μm、500nm、158nm、50nm、15.8nm、5nm系列浓度，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将不同浓度的药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果，如表1和图3所示，其中番荔枝总内酯acgs和单体化合物k16对耐herceptin的人乳腺癌bt474-herdr细胞半数抑制浓度ic50的抑制曲线如图3-1所示，k19、k109的抑制曲线如图3-2所示，番荔枝总内酯acgs对耐herceptin的人乳腺癌bt474-herdr细胞半数抑制浓度ic50为2.132nm。同时，从acgs中分离出来的三个单体化合物k16、k19、k109对mcf-7/adr的生长抑制与acgs处于同一水平，其ic50值分别为0.2166、0.5419和0.7392nm。因为k16、k19、k109在acgs中的含量总和不超过60％。

实验例4

番荔枝总内酯(acgs)三种纳米粒对耐herceptin的乳腺癌细胞bt474-herdr的生长抑制作用

实验方法：1)调整耐药的乳腺癌细bt474-herdr生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)将分别用三种不同稳定剂(p188、pgs、pcl2000-mpeg2000)制备的番荔枝总内酯的纳米粒(实施例8、9、10)配制成100mm储液(总内酯分子量按照622折算)，用培养基对待测物稀释得到50μm、15.8μm、5μm、1.58μm、500nm、158nm、50nm、15.8nm、5nm系列浓度，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将不同浓度的药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果如表1和图4所示，番荔枝总内酯acgs分别用p188、tpgs、pcl2000-mpeg2000制备的三种纳米粒对耐herceptin的乳腺癌bt474-herdr的生长抑制与acgs处于同一水平，其ic50值分别为01.483、2.804和4.486nm。表-1和图-4的数据显示，将总内酯acgs制备成纳米粒之后，不但成功解决了总内酯的难溶和难给药问题，而且保留了acgs对耐药的bt747-herdr的强效杀伤作用。由于纳米粒静脉注射给药之后具有对肿瘤的靶向性，能提高药物在肿瘤部位的蓄积，故纳米粒有望成为acgs临床应用的合适剂型。

实验例5

总内酯和单体成分对耐herceptin的乳腺癌细胞bt474-herdr的生长抑制作用

实验方法：1)调整耐药的乳腺癌细bt474-herdr生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)用dmso溶解实施例1、2、4中的番荔枝种子提取物，配制100mm储液(以提取物的浓度计)，用培养基对待测物稀释得到375ng/ml、37.5ng/ml、11.87ng/ml、3.75ng/ml、1.187ng/ml、0.375ng/ml、0.1187ng/ml、0.0375ng/ml、0.01187ng/ml系列浓度，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将不同浓度的药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果，如图5和表2所示，其中番荔枝种子乙醇超声提取物对耐herceptin的人乳腺癌bt474-herdr细胞具有非常强的杀伤作用，两种种子提取物的半数抑制浓度ic50为1.164ng/ml和1.242ng/ml；圆滑番荔枝种子回流提取物冻干按照物理性质分成两部分，其中固体部分对bt474-herdr细胞的杀伤作用与超声提取物相近(ic50为2.322ng/ml)，而油状半流体对bt474-herdr细胞的杀伤作用相对弱一些，其ic50为9.265ng/ml。由于提取物制备工艺简单，易于工业化制备，且省去了富集总内酯的繁琐步骤，成本低廉，故提取物临床用于耐药肿瘤治疗的前景广阔，商业化价值很高。表2番荔枝种子乙醇提取物和纳米粒对耐herceptin的乳腺癌bt474-herdr

细胞生长的半数抑制浓度

实验例6

番荔枝总内酯(acgs)三种纳米粒对耐herceptin的乳腺癌细胞bt474-herdr的生长抑制作用

实验方法：1)调整耐药的乳腺癌细bt474-herdr生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)将实施例12、14、15中的三种提取物纳米粒配制成100mg/ml储液(按照提取物浓度计算算)，用培养基对待测物稀释得到375ng/ml、37.5ng/ml、11.87ng/ml、3.75ng/ml、1.187ng/ml、0.375ng/ml、0.1187ng/ml、0.0375ng/ml、0.01187ng/ml系列浓度，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将不同浓度的药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果如表2和图6所示，圆滑番荔枝种子乙醇超声提取物的p188纳米粒对耐herceptin的人乳腺癌bt474-herdr细胞具有很强的杀伤作用，半数抑制浓度ic50为2.942ng/ml；圆滑番荔枝种子回流提取物冻干按照物理性质分成两部分，其中固体部分对bt474-herdr细胞的杀伤作用与超声提取物相近(ic50为4.294ng/ml)，而油状半流体对bt474-herdr细胞的杀伤作用相对弱一些，其ic50为16.89ng/ml。与提取物相应的ic50相对照可知，将提取物制备成纳米粒之后，不但成功解决了提取物的难溶和难给药问题，而且保留了提取物对耐药的bt747-herdr的强效杀伤作用。由于提取物制备工艺简单，易于工业化制备，且省去了富集总内酯的繁琐步骤，成本低廉，故提取物临床用于耐药肿瘤治疗的前景广阔，商业化价值很高。纳米粒静脉注射给药之后具有对肿瘤的靶向性，能提高药物在肿瘤部位的蓄积，故纳米粒有望成为提取物临床应用的合适剂型。

实验例7

两个单体化合物对耐药乳腺癌细胞bt474-lapdr的杀伤

实验方法：1)调整耐药的乳腺癌细bt474-lapdr生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)用dmso溶解单体化合物bullatacin(k16)和squamocin(k19)，配制100mm储液，用培养基对待测物稀释得到50μm、5.8μm、5μm、1.58μm、500nm、158nm、50nm、15.8nm、5nm系列浓度，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将不同浓度的药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果如图7所示，从番荔枝总内酯acgs中分离出来的两个单体化合物k16、k19对bt474-lapdr生长抑制的ic50值分别为8.896和6.545μm，显示对于bt474-lapdr也具有一定的杀伤作用。

实验例8

总内酯acgs三种纳米粒对耐紫杉醇的乳腺癌mcf-7/ptx的高效杀伤实验方法：1)调整耐紫杉醇的乳腺癌细mcf-7/ptx生长状态，待细胞处于对数生长期时收获细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数；2)使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×10⁴个/ml；3)接种96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×10³个；4)将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)用dmso溶解有效部位acgs(平均分子量按照622估算)配制100mm储液，另将实施例8、9、10中三种不同的acgs纳米粒按照acgs含量配制成100mm储液，均用培养基对待测物稀释得到5815、1840、581.5、184、58.15、18.4、5.815、1.84、0.58nm，以空白培养基为对照；6)取出细胞培养板，将不同浓度的药物工作液加入到细胞培养板中，10μl/孔，每个浓度做三个复孔；7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72h；8)72h后，将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；9)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3h；10)使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(od值)；11)数据处理及分析，分别得到待测物的ic50值。

结果，如图8所示，番荔枝总内酯acgs对耐药性人乳腺癌细胞mcf-7/ptx半数抑制浓度ic50值<5nm，p188和tpgs为辅料或载体的acgs纳米粒到对mcf-7/ptx的ic50值均<0.58nm，pcl2000-mpeg2000为辅料或载体的acgs纳米粒到对mcf-7/ptx的ic50值为0.9708nm，均显示出对mcf-7/ptx耐药性肿瘤细胞的选择性高效杀伤作用。表1和图8的数据显示，将总内酯acgs制备成纳米粒之后，不但成功解决了总内酯的难溶和难给药问题，而且非常好地保留了acgs对耐药的mcf-7/ptx的强效杀伤作用。由于纳米粒静脉注射给药之后具有对肿瘤的靶向性，能提高药物在肿瘤部位的蓄积，故纳米粒有望成为acgs临床应用的合适剂型。

实验例9

番荔枝总内酯纳米粒(p188为载体)口服急性毒性实验研究。

纳米粒制备：参照实施例6中的方法，以p188为载体，分别制备药载比1：5、1：1、5：1的总内酯纳米粒(acgs-p188-nps)

给药方案：选体重20g的昆明小鼠，随机分成7组，每组10只小鼠，雌雄各半，适应性喂养2天后，给药前一天禁食不禁水12h，分别单次灌胃给予60、80、110、140、170和200mg/kg的按照实施例8制备的药载比为1:5的acgs-nsps(其配制采用等比稀释法)以及p188空白辅料(200mg/kg)。

选体重20g的昆明小鼠，随机分成7组，每组10只小鼠，雌雄各半，适应性喂养2天后，给药前一天禁食不禁水12h，分别单次灌胃给予60、80、110、140、170和200mg/kg的按照实施例8的制备的药载比为1:1的acgs-nsps(其配制采用等比稀释法)以及p188空白辅料(200mg/kg)。

同时选体重20g的昆明小鼠，随机分成7组，每组10只小鼠，雌雄各半，适应性喂养2天后，给药前一天禁食不禁水12h，分别单次灌胃给予30、40、60、80、110、140、170mg/kg的按照实施例8的制备的药载比为5:1中的acgs-nsps(其配制采用等比稀释法)以及p188空白辅料(200mg/kg)。

考察指标：观察给药后小鼠的生理状态和中毒反应情况，记录死亡时间与数量，每2天对小鼠体重进行检测，持续观察2周。

结果见表3～5：

表3药载比1:5的acgs-p188-nps小鼠急性毒性实验死亡率表(n＝10，mean±sd)

由表3可以看出，药载比1：5的acgs-p188-nps高剂量组在1h内出现中毒症状，小鼠行动逐渐迟缓、停止饮食，死亡前期表现出轻微抽搐，后期逐渐出现四肢僵硬等现象。但辅料组在200mg/kg的剂量下，小鼠未见有不良反应和异常表现。由表3中小鼠死亡率计算ld50值为36.86mg/kg，与番荔枝内酯原料药ld50值19.21mg/kg相比，提高1.9倍，是最高给药有效剂量(1mg/kg)的37倍。说明将番荔枝内酯制备成纳米粒在一定程度上降低药物毒性。

表4药载比1:1的acgs-p188-nsps小鼠急性毒性实验死亡率表(n＝10，mean±sd)

由表4可知，药载比1:1的p188-acgs纳米粒高剂量组也在1h内即出现中毒症状，小鼠行动逐渐迟缓、停止饮食、呼吸急促，死亡前期表现出轻微抽搐，后期逐渐出现四肢僵硬等现象。辅料组在200mg/kg的剂量下，小鼠同样未见有不良反应和异常表现。由表4小鼠死亡率计算ld50值为135.51mg/kg，与番荔枝内酯原料药ld50值19.21mg/kg相比，提高6.3倍。说明以p188制备的药载比1:1的纳米粒可以显著降低acgs的口服毒性。对比小鼠急毒实验的ld50数据可知，辅料相同、粒径相似的情况下，不同药载比的纳米粒，可能因为纳米粒结构、表面性质、与肠道上皮细胞的作用方式有异等原因，导致毒性也有较大差别。存活小鼠平均体重持续增长，提示较高剂量对小鼠的毒副作用持续时间较短。

表5药载比5:1的acgs-p188-nsps小鼠急性毒性实验死亡率表(n＝10，mean±sd)

由表5可知：死亡率与剂量成正相关，其中最高剂量组死亡率达90％，最低剂量组和辅料组无死亡。bliss软件计算acgs-p188-nps对小鼠的ld50值为125.51mg/kg，而本研究中acgs-p188-nps口服3mg/kg抑瘤率即超过60％，与ld50值相差超过44倍，说明以p188制备的药载比5:1的番荔枝内酯纳米粒，也显著扩展了治疗窗口。

在本实施例中，纳米粒均以泊洛沙姆p188为辅料，粒径也相似，只是因为药载比分别为1:5、1:1、5:1，导致小鼠口服ld50分别为36.86mg/kg、135.51mg/kg、121.51mg/kg。首次发现药载比不同会影响纳米粒口服急毒的ld50这一事实。

实验例10

以peg2000-pcl2000为辅料制备的番荔枝总内酯纳米粒(pcl-peg-acgs)口服急性毒性实验研究。

参照实施例10中的方法，取番荔枝总内酯acgs和相同重量的peg2000-pcl2000制备药载比1：1的pcl-peg/acgs纳米粒。

选体重20g的昆明小鼠，随机分成6组，每组10只小鼠，雌雄各半，适应性喂养2天后，给药前一天禁食不禁水12h，在预实验基础上分别单次灌胃给予15、26.15、37.5、48.75和60mg/kg的以peg2000-pcl2000为辅料的pcl-peg/acgs纳米粒(药载比1:1)(其配制采用等比稀释法)以及p188空白辅料(60mg/kg)。

考察指标：观察给药后小鼠的生理状态和中毒反应情况，记录死亡时间与数量，每2天对小鼠体重进行检测，持续观察2周。小鼠死亡率情况见表6。

表6以pcl2000-mpeg2000为辅料制备的番荔枝总内酯纳米粒小鼠急性毒性实验死亡率表

根据表5计算得知pcl-peg-acgs纳米粒的ld50值为58.25mg/kg。

实验例11

荷瘤鼠模型上对耐药肿瘤的生长抑制

于体外培养mcf-7/ptx细胞至对数生长期，用胰酶将贴壁细胞消化，用无菌pbs调整细胞悬浮液浓度至6×10⁷个/ml。皮下接种0.2ml上述细胞悬浮液于nu/nu裸鼠(6周龄，雌性)右侧腋下，待肿瘤体积达到100mm³左右时，筛选肿瘤大小相对一致的40只小鼠进行实验。

将筛选出来的荷瘤小鼠随机分成4组，每组10只，除正常饮食外，按照以下分组，阳性药组每2天静脉注射市售紫杉醇注射液10mg/kg，阴性对照组每天灌胃0.2ml生理盐水，实验组每天给药灌胃给予药载比1:1的总内酯-p188纳米粒(80μg/kg)和番荔枝种子乙醇回流提取物p188纳米粒(药载比1:1)(400μg/kg)，实验时长12天。每天观察小鼠有无异常及死亡情况；每两天测一次每组小鼠的体重和肿瘤体积(v＝ab²/2；a为长边，b为短边)。给药第12天脱颈椎处死小鼠，解剖小鼠获取各组肿瘤并按下式计算抑瘤率：

抑瘤率＝(1-给药组瘤重/生理盐水组瘤重)×100％

实验结果表明：相对于ptx只有29％的抑瘤率，总内酯纳米粒对mcf-7/ptx荷瘤鼠的抑瘤率达到69.2％，提取物纳米粒对人恶性胶质瘤u87-mg荷瘤鼠的抑瘤率达到67.5％，显示出对耐药的乳腺癌的高效抗肿瘤作用。同时，各组小时体重与生理盐水组相比没有差异，整个试验过程中实验组小鼠无一死亡，且状态良好，提示在给药剂量下，具有较好的安全性。

本发明提供了一种杀伤耐药肿瘤的药物组合物及其应用，所述组合物内的有效成分均对肿瘤细胞具有中等强度的杀伤作用，但是对于耐药的肿瘤具有强杀伤作用；而且将所述药物组合物制备成纳米粒之后，不但成功解决了总内酯的难溶和难给药问题，而且保留了acgs对耐药肿瘤的强效杀伤作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。