磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的应用的制作方法

本发明涉及纳米生物材料的应用，具体涉及一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶在用于制备抗对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤药物中的应用。

背景技术：

药物性肝损伤是指在使用某种或几种药物后，由药物本身或其代谢产物引起的肝脏损伤。药物性肝损伤可表现为目前所知的任何类型急性或慢性肝脏疾病，但以急性肝损伤最常见，约占报告病例数的90％以上，少数患者可发生威胁生命的暴发性或重症肝功能衰竭，是药物肝毒性临床监测和防治的重点。

对乙酰氨基酚是一种温和解热镇痛药，治疗剂量下无毒性，但对于易感者，或在日剂量大于4g(成人)或150mg/kg(儿童)时，则可成为强肝毒性物质，引起肝组织细胞的病变和损伤。对乙酰氨基酚(apap)导致的毒性关键机制是细胞色素p450催化的apap代谢活化，其产生活性代谢物n-乙酰基-对苯醌亚胺的90％(napqi)在啮齿动物和人类中引发毒性。apap过量后代谢产生过量的napqi形成耗尽细胞谷胱甘肽(gsh)，加合蛋白质包括线粒体蛋白质，并诱导线粒体氧化应激和功能障碍。这导致核dna片段化和坏死细胞死亡以及随后的炎症反应，包括促炎细胞因子的释放和免疫细胞的活化。

近年来，线粒体逐渐被认为是apap过量后氧化应激的主要来源。已经确定apap过量后过量的napqi形成耗尽gsh并与细胞蛋白的巯基结合。虽然蛋白质加合物不足以导致直接细胞死亡，但细胞蛋白结合，特别是线粒体蛋白质加合物，会损害线粒体呼吸并引起氧化应激反应。同时，已知它们会干扰线粒体电子传递链(etc)，从而导致电子从链中泄漏，最后导致ros形成。

随着纳米技术的快速发展，为治疗apap导致的急性肝损伤带来了新的希望。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的应用，对apap导致的急性肝损伤起到保护和治疗作用。

本发明所提供的技术方案为：

一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶在用于制备抗对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤药物中的应用。

本发明中的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶能够产生多种抗氧化模拟酶活性，能够有效降低体内过高测ros水平，缓解炎症反应，对apap导致的急性肝损伤起到保护和治疗作用。其中，超小型氧化铈纳米晶能够平衡细胞内升高的ros，进而减少ros造成的氧化应激损伤，达到治疗作用；其次，磷脂聚乙二醇无毒无刺激性，具有很高的生物安全性，可以提高超小型氧化铈纳米晶的生物相容性。

本发明中所述超小型氧化铈纳米晶的尺寸为0.1～10nm。尺寸介于0.1～10nm超小型氧化铈纳米晶能够产生较多的氧空缺，使其表面存在大量的三价铈离子ce³⁺，且其具有萤石结构使得ce³⁺与四价铈离子ce⁴⁺的相互快速转变，产生多种抗氧化模拟酶活性，能够有效降低体内过高的ros水平，从而缓解炎症反应。

本发明中所述磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的尺寸为10～50nm。

本发明中所述磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的制备方法包括：

1)将醋酸铈和油胺加入到二甲苯中反应，经不良溶剂沉淀，得到超小型氧化铈纳米晶；

2)将磷脂聚乙二醇溶于氯仿中，加入超小型氧化铈纳米晶后超声处理，旋蒸除去氯仿，并加入良溶剂水化，得到磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶。

作为优选，所述步骤1)中将醋酸铈和油胺加入到二甲苯中搅拌，将上述混合物升温至85-95℃，保持温度搅拌2-6小时，形成络合物，经不良溶剂沉淀，得到超小型氧化铈纳米晶。

本发明中所述步骤1)中不良溶剂选自无水乙醚、乙醇、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和丙酮中的一种或多种。

本发明中所述步骤1)中醋酸铈与油胺的质量比为1:7～9。

作为优选，所述步骤2)中超声处理的时间为1-30min。

作为优选，所述步骤2)中旋蒸的温度为45-55℃，旋蒸时间为1-3h。

本发明中所述步骤2)中磷脂聚乙二醇与超小型氧化铈纳米晶的质量比为4～6:1。

本发明中所述步骤2)中磷脂聚乙二醇的分子量范围为1000～10000。

本发明中所述步骤2)中良溶剂选自去离子水、磷酸盐缓冲液、细胞培养基中的一种或多种。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明中的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶具有极好的形态结构，粒径均一可控。

(2)本发明中的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶具有良好的清除细胞中ros的性能，并能显著抑制对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤。

附图说明

图1为实施例1中制备的超小型氧化铈纳米晶的tem图；

图2为实施例1中制备的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的tem图；

图3为实施例1中制备的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的动态光散射粒度分布图；

图4为含浓度不同的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶对正常肝细胞株(hl7702)生物相容性的磺酰罗丹明b比色法(sulforhodamineb，srb)细胞活性定量分析结果图；

图5为磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶抑制对乙酰氨基酚诱导的hl7702细胞死亡的srb细胞活性定量分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)超小型氧化铈纳米晶的合成：

将0.4g醋酸铈水合物和3.2g油胺加入到15ml二甲苯中搅拌，以2摄氏度每分钟的升温速度升至90摄氏度，共搅拌4小时形成络合物；将1ml去离子水注射到惰性气体保护反应体系中，老化三小时，无水乙醚沉淀，离心得到超小型氧化铈纳米晶。

对超小型氧化铈纳米晶用透射电镜进行形貌表征，如图1所示，粒径约为0.1～10nm。

(2)磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的合成：

将0.01g磷酸聚乙二醇(分子量为2000)和2mg超小型氧化铈纳米晶加入到5ml氯仿，于水浴超声锅中超声3min。将上述混合液50摄氏度旋蒸2小时后，加入1ml去离子水水化，得到磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶。

对磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶进行形貌表征，如图2所示，粒径约为10～50nm，对其通过动态光散射进行粒径测定，如图3所示，粒径约为10～50nm。

实施例2

(1)超小型氧化铈纳米晶的合成：

将0.4g醋酸铈水合物和3.2g油胺加入到15ml二甲苯中搅拌，以2摄氏度每分钟的升温速度升至95摄氏度，共搅拌6小时形成络合物；将1ml去离子水注射到惰性气体保护反应体系中，老化三小时，无水乙醚沉淀，离心得到超小型氧化铈纳米晶。

(2)磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的合成：

将0.01g磷酸聚乙二醇(分子量为2000)和2mg超小型氧化铈纳米晶加入到5ml氯仿，于水浴超声锅中超声5min。将上述混合液50摄氏度旋蒸1.5小时后，加入1ml去离子水水化，得到磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶。

实施例3

(1)超小型氧化铈纳米晶的合成：

将0.4g醋酸铈水合物和3.2g油胺加入到15ml二甲苯中搅拌，以2摄氏度每分钟的升温速度升至85摄氏度，共搅拌3小时形成络合物；将1ml去离子水注射到惰性气体保护反应体系中，老化三小时，无水乙醚沉淀，离心得到超小型氧化铈纳米晶。

(2)磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的合成：

将0.01g磷酸聚乙二醇(分子量为2000)和2mg超小型氧化铈纳米晶加入到5ml氯仿，于水浴超声锅中超声30min。将上述混合液50摄氏度旋蒸2.5小时后，加入1ml去离子水水化，得到磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶。

性能试验

(1)体外生物相容性评价

不同浓度药物的制备：选用实施例1制备得到的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶分散到水溶液中，得到最终超小型氧化铈纳米晶浓度为8323μg/ml。

选择人正常肝细胞株(hl7702)考察不同浓度的氧化铈的体外生物相容性。用不同体积的细胞培液重新分散得到浓度分别为0.064μm、0.32μm、1.6μm、8μm、200μm、1mm的药物。

hl7702细胞活性定量分析结果如图4所示，空白对照组(con)表示只用细胞培养液进行孵育，浓度为200μm以下细胞成活率均在90％以上，表明修饰后的超小型氧化铈纳米晶具有良好的体外生物相容性。

(2)抑制肝细胞死亡

药物的制备：选用实施例1制备得到的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶分散到水溶液中，得到最终超小型氧化铈纳米晶浓度为8323μg/ml。细胞模型建立：在hl7702细胞中加入含对乙酰氨基酚(acetaminophen，apap)的细胞培养液，用细胞培液重新分散得到浓度为8mm的药物。

治疗组：在hl7702细胞中加入对apap的同时加入含8mm的氧化铈的细胞培养液并使之终浓度为8μm。

阳性对照组：在hl7702细胞中仅加入含对乙酰氨基酚(acetaminophen，apap)的细胞培养液。

空白对照组：正常细胞给予新鲜的培养液。

24小时后，用srb定量细胞活性，氧化铈抑制apap诱导的肝细胞死亡的结果如图5所示，apap具有明显的促进肝细胞死亡的作用，细胞活性仅为57.9％。给予氧化铈后肝细胞死亡有所抑制，细胞活性超过91.7％，证明其具有抑制apap诱导的肝细胞死亡的作用。

以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。