本发明属于生物医药
技术领域：
：，具体涉及醋酸棉酚在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。
背景技术：
：：近年来，随着人口老龄化的加剧，神经退行性疾(neurodegenerativedisorders,ndd)的患病率也在不断攀升。ndd是一类由于神经元损伤，导致异常折叠的蛋白不能被及时清除，累积于神经元内产生毒性进而导致神经元细胞死亡，最终导致危害极大的脑部病变，如阿尔茨海默病（ad）、帕金森病（pd）、额颞叶痴呆（ftd）、亨廷顿病（hd）和肌萎缩侧索硬化症（als）等。由于该类疾病的广泛性以及缺少有效的治疗手段，所以在临床上依然面临着巨大的挑战。亨廷顿疾病（huntington’sdisease,hd）由于其遗传学特征明显，是一种研究神经退行性疾病的重要模型。hd的引发是由于亨廷顿基因（htt）突变，即hd病人的4号染色体上具备不稳定的cag重复扩增序列的htt基因，在健康状态下，htt基因通常包含6~35个cag核苷酸重复序列，而在hd患者中，cag核苷酸重复序列通常都超过了40个，最终导致亨廷顿蛋白(htt)氨基末端谷氨酰胺重复序列（polyglutamine,polyq）过度延长，这种polyq过长的突变亨廷顿蛋白（mhtt），在神经细胞内聚集沉淀而产生的细胞毒性是引发该疾病的关键。该病的临床表现为复杂的运动障碍性疾病，该疾病的典型特征包括运动障碍（舞蹈样地不自主动作）、认知功能障碍（如注意力等）以及精神障碍（进行性智能衰退，如淡漠）。本病较为少见，估计为4/10万～10/10万人，年轻发病者的症状一般较重，以肌强直为主，中年发病者以舞蹈症状为主，60岁以上发病者以意向性震颤为主。少年型的患者较少见，发病的年龄一般为中年，病程可长达数十年。患者病情呈现进行性恶化，一般在发病15~20年后会死亡，目前，临床上缺少有效的治疗手段。自噬是一种高度保守的细胞代谢过程，可以降解包括受损细胞器、错误折叠的蛋白质以及胞内聚集物等一系列影响细胞内稳态的物质。自噬对于维持细胞内各组分的周转以及稳定，保持细胞的内稳态是必要的。自噬开始于一个分离膜，也称为吞噬泡，它可能来自于内质网（er）、高尔基体或者核内体来源的脂质双层；该吞噬泡不断扩展，从而将细胞内的物质，如蛋白聚集物、受损细胞器及核糖体等，吞噬进入双层膜小泡，称为自噬体；负载的自噬体通过与溶酶体融合而成熟形成自噬溶酶体，促进溶酶体内的酸性蛋白酶降解自噬体的内容物；降解后的产物如氨基酸和其他降解的副产品可被输送回细胞质中重新用于生物大分子的构建以及新陈代谢。因此，自噬被认为是一个细胞的“循环工厂”。hd发生的原因之一就是因为mhtt毒性蛋白的积累而自噬溶酶体通路清除能力不足引起的。特异性激活自噬，促进mhtt蛋白降解，将是缓解和治疗hd疾病的有效手段之一。含缬酪肽蛋白（valosincontainingprotein,vcp）也称为p97，属于三磷酸腺苷酶超家族（atpasesassociatedwithvariouscellularactivities,aaa）成员，vcp能与多种不同辅助蛋白结合调控不同的生物学功能，比如参与内质网相关的蛋白降解（erad）、细胞自噬、凋亡、泛素相关的蛋白降解，核膜的形成，细胞周期调控，dna的损伤修复等重要活动。vcp在自噬相关的蛋白降解中起着非常重要的作用，发现和鉴定活性天然小分子，有效调控其在自噬过程中的功能，是潜在地清除累积的毒性蛋白进而缓解和治疗相关疾病的策略之一。棉酚（gossypol）是从棉花籽中提取出来的一种多酚类化合物，最初作为一种染料，但是它具有光不稳定性，见光易分解。随后的研究发现棉酚具有避孕的作用，但却存在低血钾以及不可逆避孕的副作用。随着对棉酚的研究进展，逐渐发现棉酚具有更多的生物学效应比如：抗病毒，抗肿瘤，抗氧化，抗寄生虫，抗菌等。研究表明棉酚具有激活细胞自噬的作用，其作用机制除了破坏bcl-2和beclin1复合体的形成外，是否还存在其它作用模式，这是本研究的重点所在。醋酸棉酚是棉酚的醋酸盐形式，具备更好的吸收性且作用时间更长，副作用更少，所以我们研究中选择了醋酸棉酚。本发明基于上述理论，探讨醋酸棉酚在激活自噬通路，治疗神经退行性疾病（包括亨廷顿疾病）中的应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供醋酸棉酚在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。本发明提供的醋酸棉酚在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途，是通过醋酸棉酚激活自噬通路发挥作用，具体包括：醋酸棉酚特异性结合vcp，提高vcp与lc3相互作用。lc3为微管相关蛋白轻链3。醋酸棉酚特异性结合vcp，提高vcp与mhtt相互作用。醋酸棉酚特异性结合vcp，促进vcp、lc3和mhtt复合体的形成，进而通过自噬体降解毒性蛋白mhtt。本发明还包括，醋酸棉酚在亨廷顿细胞模型和果蝇疾病模型中改善mhtt蛋白诱导的疾病表型的用途。所述醋酸棉酚的结构式，如下所示：实验表明：通过酶活性检测以及蛋白热稳定性迁移实验，发现醋酸棉酚靶向vcp的n端结构域与d1结构域形成的口袋中，在细胞内发现醋酸棉酚激活细胞自噬，降低q47细胞及sthdhq7/q111细胞（hd模型细胞）内的mhtt水平，同时可提高sthdhq7/q111细胞以及hd病人ips来源的神经元的存活率。同时利用体外表达纯化的带6个组氨酸残基标签的vcp蛋白以及带gst标签的微管相关蛋白轻链3以及带6个组氨酸残基标签的携带不同数目多聚谷氨酰胺链的htt蛋白（htt-q25/mhtt-q72），通过体外结合实验发现，醋酸棉酚通过结合vcp，分别促进了vcp与lc3以及vcp与mhtt-q72之间的相互作用，进而通过自噬体降解毒性蛋白mhtt。最后分别在细胞模型和果蝇疾病模型中验证了该化合物具有改善mhtt蛋白诱导的疾病表型的作用。本发明不但证明了vcp可以作为hd疾病新的干预靶标，而且通过阐述醋酸棉酚的作用机制，提供了醋酸棉酚在制备治疗神经退行性疾病（包括hd）药物中的用途，并为后续hd提供了候选小分子药物，同时其作用模式的独特性也为后续的药物研发提供了新的借鉴模式。附图说明图1出示了应用孔雀绿法测vcp蛋白的atp酶活性，筛选了约700多个天然小分子化合物库的情况。图1注释出示了对vcp酶活性抑制效率较高的9个化合物，其中醋酸棉酚对vcp酶活性的抑制效率达到80%-90%。图2出示了随着醋酸棉酚浓度增加，对vcp酶活性的抑制效率呈现剂量相关性，醋酸棉酚对6xhis-vcp酶活性的半抑制率为9.3±0.4µm。图3-4出示了醋酸棉酚对vcp蛋白结构的影响情况。图3出示了通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，醋酸棉酚与vcp结合后不影响该蛋白发挥功能的六聚体形成。图4出示了通过胰蛋白酶酶解实验检测，醋酸棉酚与vcp结合后影响了vcp单体的构象，导致胰蛋白酶酶解图谱存在差异（红色箭头），醋酸棉酚处理组蛋白更加趋向于稳定，同时醋酸棉酚与棉酚组的条带相似，nms873组蛋白条带更加稳定（nms-873是vcp的特异性的变构抑制剂，ic50为30nm，其作用机制研究表明，nms-873干扰自噬，从而诱导癌症细胞死亡）。图5出示了醋酸棉酚结合vcp的情况，其中，kd为6.9μm。图6-7出示了醋酸棉酚可提高vcp蛋白热稳定性。其中，在5μm醋酸棉酚的浓度下，不断提高蛋白降解温度，vcp蛋白的热稳定性tm值由64.2±0.1℃提高到了71.1±0.7℃。图8-12出示了醋酸棉酚可结合到vcp的n端结构域与d1结构域形成的口袋内。其中：图8-9出示了醋酸棉酚改变了vcp-n+d1片段蛋白的热稳定性，tm值由56.9±0.1℃提高到了62.3±1.6℃，但却对vcp-n/d2片段的热稳定性没有影响。图10出示了醋酸棉酚抑制了vcp全长蛋白以及vcp-n+d1片段蛋白的atp酶活性，但却不影响vcp-d1+d2片段蛋白的atp酶活性。图11出示了筛选过程中发现的除了醋酸棉酚之外的3个对vcp酶活性抑制效率位于前三的小分子对vcp全长以及截短体蛋白酶活性抑制的情况，这3个小分子只能抑制vcp全长蛋白的酶活性，不能抑制vcp-d1+d2的酶活性。图12出示了pdb编码的vcp晶体结构构建醋酸棉酚与vcp的结合模型，醋酸棉酚结合到vcp蛋白的n端结构域以及d1结构域形成的口袋内。**p<0.01。图13-17出示了醋酸棉酚在细胞内激活自噬的情况。其中：图13-14出示了醋酸棉酚处理细胞24小时，自噬底物nbr1/ncoa4/p62呈现降低趋势，并且lc3i型明显降低，lc3ii型增加的情况，同时免疫荧光共聚焦显示自噬底物（p62,ncoa4,ndp52)水平呈现降低趋势，随着醋酸棉酚浓度增加，分别代表p62/ncoa4/ndp52蛋白的红色荧光斑点逐渐减少。氯喹（氯喹）作为自噬抑制剂的一种，可以阻断自噬体与溶酶体的融合，致使自噬不能完成，导致自噬底物累积。图15出示了vcp其它抑制剂nms873，dbeq处理细胞24小时后，细胞自噬底物增加，细胞自噬受到抑制，同时细胞泛素化水平也高于醋酸棉酚。图16出示了醋酸棉酚对细胞自噬流的影响情况，醋酸棉酚、雷帕霉素、氯喹分别处理稳定表达mcherry-egfp-lc3的hela细胞系24小时，醋酸棉酚与雷帕霉素提高了细胞的自噬流水平，氯喹阻断了细胞自噬流的形成。图17出示了氯喹阻断了醋酸棉酚诱导的细胞自噬情况。图18-20出示了醋酸棉酚靶向vcp激活细胞自噬的情况。其中：图18出示了在hela细胞内vcp敲减后自噬发生抑制，自噬底物累积量增加，lc3ii增加，lc3i降低。图19出示了在hela细胞内敲低vcp的表达水平，再经过醋酸棉酚处理24小时，p62在敲低vcp组内没有明显的降低，同时没有vcp敲减的组内p62水平随着药物浓度增加呈现降低趋势，醋酸棉酚在细胞内通过结合vcp，激活了细胞自噬。图20出示了在hela细胞内敲低beclin1的表达水平，再经过醋酸棉酚处理24小时，p62在对照以及敲低beclin1组内都有降低，依然激活了细胞自噬。图21-25出示了醋酸棉酚降低了hd-q47细胞内htt蛋白水平的情况。其中：图21出示了醋酸棉酚在q47中的ic50约为13.2μm。图22出示了醋酸棉酚处理q47细胞24小时，随着药物浓度增加，htt蛋白呈现梯度降低趋势，mw1/2b7为抗体对，检测细胞内htt蛋白水平，mw1代表致病htt蛋白，2b7代表细胞内总htt蛋白，lc3i降低，lc3ii增加。图23出示了氯喹预处理细胞6小时，再经不同浓度醋酸棉酚处理，细胞自噬被阻断，htt蛋白不再通过自噬途径降解的情况。图24-25出示了htrf实验检测hd细胞经醋酸棉酚处理后htt蛋白水平的情况，其中hd-q47以及hd病人来源的多能诱导干细胞中htt蛋白水平均呈现降低趋势。*p<0.05，***p<0.001。图26-27出示了醋酸棉酚降低sthdhq7/q111细胞内htt蛋白水平提高细胞存活率。其中：图26出示了hd细胞对照组相对caspase3水平要明显高于hd细胞给药组，而hd细胞给药组与正常细胞组的casepase3水平相比，虽然给药组的信号水平也稍稍高于正常组，但都明显低于对照组的hd细胞组。图27出示了通过htrf技术检测醋酸棉酚处理sthdhq7/q111细胞后的htt蛋白水平降低的情况。***p<0.001。图28-30出示了醋酸棉酚提高ips分化的神经元的存活率降低htt蛋白水平的情况。其中：图28出示了醋酸棉酚处理ips分化的神经元48小时，神经元hd致病细胞给药组，hd致病细胞htt敲减组以及正常细胞组内的神经元数目要明显高于hd致病细胞的对照组(tuj1来检测活的神经细胞，红色荧光斑点代表tuj1)，并且上述三组的caspase3活性也明显低于hd致病细胞对照组(绿色荧光斑点代表caspase3）。图29-30出示了了醋酸棉酚处理ips分化的神经元48小时，ips-derived神经元hd致病细胞给药组，hd致病细胞htt敲减组以及正常细胞组内caspase3活性都要明显低于hd致病细胞对照组，同时神经元数目要高于hd致病细胞对照组。***p<0.001。图31-32出示了醋酸棉酚通过靶向vcp的n端结构域提高了vcp与lc3互作的情况。其中：图31出示了体外结合实验结果，在体外系统中，醋酸棉酚浓度达到饱和时，vcp与lc3的互作明显增加。图32出示了醋酸棉酚可以提高lc3与vcp蛋白全长（vcpfl)、vcp-n+d1片段的相互作用，但是却不能提高lc3与vcp-n片段的相互作用。图33-35出示了醋酸棉酚在体外可促进vcp，lc3，mhtt三者之间的相互作用情况。其中：图33出示了醋酸棉酚在体外促进了vcp与mhtt-q72的相互作用，但却不影响vcp与htt-q25的相互作用。图34出示了醋酸棉酚不影响mhtt-q72/htt-q25与lc3的相互作用。图35出示了醋酸棉酚在体外促进了vcp,lc3，mhtt三者之间的相互作用。图36-38出示了醋酸棉酚特异性提高vcp与lc3的相互作用的情况。其中：图36出示了醋酸棉酚提高了vcp与lc3的相互作用，但对vcp与p47的互作没有产生明显影响。图37出示了醋酸棉酚提高了vcp与lc3的互作，nms873以及dbeq对vcp与lc3的互作没有产生明显影响。图38出示了醋酸棉酚处理携带full-htt-128q或者exon1-htt-72q基因的hd果蝇，喂药2周后，与对照组比可以有效降低hd模型果蝇头部的htt蛋白水平的情况。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图39-42出示了醋酸棉酚提高了hd果蝇的存活期及运动能力的情况。其中：图39-40出示了醋酸棉酚提高了携带full-htt-128q基因hd果蝇的存活期及运动能力。图41-42出示了醋酸棉酚提高了携带exon1-htt-72q基因hd果蝇的存活期及运动能力。***p<0.001，****p<0.0001。图43-45出示了醋酸棉酚提高了ad小鼠的识别能力以及对环境适用能力的情况。其中：图43出示了醋酸棉酚提高了ad小鼠对新旧物体识别的能力，ad小鼠给药10个周后，对新物体的识别具有偏好性。图44-45出示了ad小鼠给药10周后，在矿场实验中更加趋向旷场中心移动，并且运动距离增加。*p<0.05，**p<0.01。具体实施方式材料和试剂1.1质粒、载体：pet-28a(+)，pcdna3.1-hisa，psg5-flag，pgex-6p-2。宿主菌：埃希氏大肠杆菌xl10、bl21、dh5α。细胞株实验所用细胞株：hela（子宫颈癌细胞），q47（成纤维细胞），sthdhq7/q111(ch00096-q7/q111)（小鼠神经前体细胞），stablemcherry-egfp-lc3hela（稳定表达mcherry和egfp荧光蛋白的lc3的人子宫颈癌细胞）sthdhq7/q111细胞培养在33℃，5%co2细胞恒温培养箱中，其它哺乳动物细胞系培养在37℃，5%co2的细胞恒温培养箱中。抗体实验所用抗体：抗gfptag单克隆抗体（clontech公司），抗6xhistag单克隆抗体（sentacruz公司），抗gfptag单克隆抗体（proteintech公司），抗gsttag单克隆抗体（sentacruz公司），抗flagtag单克隆抗体（sentacruz公司），抗vcp单克隆抗体（proteintech公司），抗nbr1单克隆抗体（sentacruz公司），抗ncoa4单克隆抗体（sentacruz公司），抗p62单克隆抗体（proteintech公司），抗lc3单克隆抗体（novus公司），抗lamp1单克隆抗体（sentacruz公司），抗ub单克隆抗体（abways公司），抗ndp52单克隆抗体（novus公司），抗beclin1单克隆抗体（proteintech公司），抗β-tubulin单克隆抗体（proteintech公司），抗gapdh单克隆抗体（sentacruz公司），抗tuj1单克隆抗体（covance公司）。实验所用二抗均购于jacksonimmunoresearch公司。实验所用小分子醋酸棉酚购于成都普菲德生物公司。实验试剂配制1.5.1质粒构建相关试剂（1）lb培养基配制配制的液体lb培养基，置于121℃高压湿热灭菌15min；配制的固体lb培养基，置于121℃高压湿热灭菌15min，待温度冷却到55℃（手可以触摸），按1:1000的比例加入已经配置好的抗生素，迅速混匀，在超净台内倒入无菌的培养皿中，待凝固后，至于4℃储存，一个月内使用。液体培养基（1l）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加去离子水定容至1l。固体培养基（1l）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，加去离子水定容至1l。（2）50×tae：取242gtris碱，用800ml去离子水溶解完全后，加入57.1ml冰醋酸，用100ml乙二胺四乙酸（0.5mol/l，ph8），定容至1l。细胞培养相关试剂(1)磷酸缓冲液（pbs）：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o3.58g，kh2po40.24g溶解于无菌的去离子水，定容至1l，ph7.4，高压湿热灭菌，4℃保存待用。(2)细胞完全培养基：500mldmem高糖培养基或者1640培养基加入10％体积比胎牛血清50ml，以及5ml100x双抗青链霉素混合液(penicillin-streptomycinsolution)，4℃保存待用。(3)g418（100mg/ml）：称取2gg418粉末，溶解于20mlpbs中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，于超净台内分装后，－20℃保存。(4)depc水配制：吸取1mldepc溶解于去离子水，充分混合均匀，置于通风橱内通风过夜，高压湿热灭菌，4℃保存待用。(5)0.1%alamarblue溶液：称取0.5mgalamarblue粉末，溶解于50mlpbs中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存。细胞裂解以及蛋白纯化相关试剂(1)pmsf:称取17.4mgpmsf粉末，充分溶解于1ml甲醇内，存储浓度为100mm，-20℃保存待用。(2)aprotinin：称取1mgaprotinin粉末，充分溶解于1ml水中，存储浓度为1mg/ml，-20℃保存待用。(3)leupeptin：称取1mgleupeptin粉末，溶解于2ml甲醇中，存储浓度为0.5mg/ml，-20℃保存待用。(4)pepstatina：称取1mgpepstatina粉末，溶解于2ml甲醇中，存储浓度为0.5mg/ml，-20℃保存待用。(5)ripa：称取8.76gnacl以及10g脱氧胆酸钠，溶解于10ml10%sds溶液以及10ml1mtris-hcl（ph7.2）中，加入1mltriton-x-100，10ml0.5medta，最后加无菌去离子水定容至1l，室温保存。(6)细菌裂解液：200mmtris-hclph8.0，50mmnacl，5mmmgcl2，10%体积比glycerol，2%triton-x-100，20mm咪唑，pmsf（1mm），裂菌时加入溶菌酶（1mg/ml）。(7)蛋白洗脱液：200mmtris-hclph8.0，50mmnacl，5mmmgcl2，10%体积比glycerol，20mm咪唑（根据所蛋白特性的不同，在对蛋白进行洗脱时，可调整咪唑的浓度）。(8)蛋白存储液：150mmtris-hclph8.0，100mmkcl，10%体积比glycerol。(9)1m咪唑：称取咪唑粉末，充分溶解于200mmtris-hclph8.0，50mmnacl，5mmmgcl2，10%体积比glycerol溶液中，置于4℃存储待用。(10)考马斯亮蓝染色液：称取2.5gcoomassiebrilliantbluer250溶解于450ml甲醇，加入100ml冰醋酸，最后用去离子水定容至1l。(11)脱色液：450ml甲醇，100ml乙酸，最后用去离子水定容至1l。聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳的相关试剂(1)30％丙烯酰胺凝胶存储液：称取290g丙烯酰胺和10gn,n’－亚甲基双丙烯酰胺粉末溶解于900ml去离子水中，过滤残渣，定容至1l，置于4℃避光保存。(2)10%过硫酸胺（aps）：称取1g过硫酸胺粉末，溶解于9ml去离子水中，溶解后定容至10ml，0.45μm微孔滤膜过滤，4℃保存。(3)1.5mol/ltris（ph=8.8）：称取181.6gtris粉末，溶解于900ml去离子水中，ph8.8，定容至1l，置于室温保存。(4)1.0mol/ltris（ph=6.8）：121.1gtris粉末溶解于900ml去离子水中，ph6.8，定容至1l，置于室温保存。(5)10％sds：称取10gsds粉末，待完全溶解于90ml去离子水中，消泡后定容至100ml，置于室温保存。(6)sds-page胶配制：将配蛋白胶的玻璃板，样品梳洗干净，待玻璃板晾干后，将两块玻璃板装到配胶架上，按照下表中各试剂比例，先将水，30%聚丙烯酰胺溶液，tris-hcl以及sds混合均匀，最后用移液枪加入10%aps以及temed，充分混合，向玻璃板中间灌入分离胶，大概距离顶部1.5cm左右时，停止灌注，立即向玻璃板内加入1ml去离子水，约20min后分离胶便可聚合完成。此时，继续按照下表配制4%的上层浓缩胶，先弃掉分离胶上层的水，并用吸水纸吸干，注入上层胶液体，立即将样品梳插入上层胶内，置于室温约20min便可凝结，配制好的sds-page胶可保存于4℃一周内可用。(7)xtris-glycinesds-page凝胶电泳缓冲液：称取15.15gtris，94gglycine，溶解于800ml无菌去离子水中，加入50ml10％sds溶液，定容至1l，室温保存。(8)sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳的半干转膜缓冲溶液：称取14.4gglycine，3.03gtris碱，溶解于800ml去离子水中，加200ml甲醇，定容至1l，室温保存。(9)bn-page凝胶电泳阴极液（10x）：500mmtricine，150mmtris-hclph7.0，0.2%考马斯亮蓝g250；无色阴极液：500mmtricine，150mmtris-hclph7.0。(10)bn-page凝胶电泳阳极液（10x）：500mmbis-tris-hclph7.0。(11)bn-pageloadingbuffer：750mmε-氨基己酸，5%（w/v）考马斯亮蓝g250。(12)丽春红染色液：称取0.5g丽春红粉末，加入1ml乙酸溶解，加无菌去离子水定容至100ml，置于室温保存，可回收使用。(13)10xpbs存储液：称取121.2gtris-base，90gnacl溶解于900ml灭菌去离子水中，ph调至7.4，定容至1l，室温保存。(14)1xpbst：将10xpbs用去离子水稀释成1xpbs，1:1000加入tween20，充分混匀，室温保存。(15)westernblot封闭液（5%脱脂牛奶溶液）：称取2.5g脱脂奶粉溶解于50ml1xpbst中，4℃保存，当天备用。(16)5%bsa：0.5gbsa粉末溶解于10ml1xpbst中，4℃保存，当天备用。(17)25%/75%乙醇溶液：量取250/750ml无水乙醇，加入无菌去离子水定容至1l，室温保存。(18)6xsds-page上样缓冲液：称取25gsds以及30mg溴酚蓝，溶解于87.5ml1mtris-hcl（ph6.8）中，加入100ml甘油，在通风橱内加入12.5mlβ-巯基乙醇，最后加无菌去离子水定容至250ml，室温保存。(19)strippingbuffer：量取20ml10%sds溶液，加入6.2ml1mtris-hcl（ph6.8），并在通风橱内加入0.7mlβ-巯基乙醇，最后加入无菌去离子水定容至100ml，室温保存。小分子试剂配制(1)醋酸棉酚储存液（50mm）：称取2.9mg醋酸棉酚粉末，充分溶解于100μldmso，储存浓度为50mm，-20℃保存。(2)氯喹（chloroquin,氯喹,100mm）：称取氯喹粉末，溶解于灭菌的去离子水，用0.22μm滤膜来滤以除菌，储存浓度为100mm，-20℃保存。(3)nms873（20mm）：称取10.4mgnms873粉末，溶解于1mldmso中，储存浓度为20mm，-20℃保存。(4)dbeq（20mm）：称取6.8mgdbeq粉末，溶解于1mldmso中，储存浓度为20mm，-20℃保存。(5)雷帕霉素（rapamycin,50mm）：称取45.7mgrapamycin粉末，溶解于1mldmso中，储存浓度为50mm，-20℃保存。(6)卡那霉素（kanamycin，50mg/ml）：称取1gkanamycin，溶解于20ml去离子水，用0.22μm滤膜过滤来除菌，储存浓度为50mg/ml，用1.5ml灭菌的ep管分装，－20℃保存。过滤与抗生素分装的过程在超净台内完成。(7)氨苄青霉素（ampicillin，100mg/ml）：称取1gampicillin，溶解于10ml去离子水，0.22μm滤膜过滤除菌，储存浓度为100mg/ml，用1.5ml灭菌的ep管分装，－20℃保存。过滤与抗生素分装的过程在超净台内完成。(8)异丙基硫代-β-d-半乳糖苷（iptg,1m）：称取2.38giptg，溶解于10ml灭菌去离子水，0.22μm滤膜过滤除菌，储存浓度为1m，用1.5ml灭菌的ep管分装，－20℃保存。过滤与分装过程在超净台内完成。(9)g418（100mg/ml）：称取2gg418粉末，溶解于20mlpbs中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌ep管，－20℃保存。(10)edta溶液（1m）：称取37.2gedta加入70ml无菌去离子水，搅拌均匀，使用naoh将ph值调至8.0。最后用无菌去离子水定容至100ml。室温保存。免疫荧光相关试剂配制(1)透化液：100mmtris-hcl，ph7.5，50mmnacl，1%tritonx-100(2)冷甲醇：将甲醇预先放入-20℃预冷5小时。酶活性检测的相关试剂配制(1)孔雀绿工作液：分别预先配制孔雀绿存储液0.081%w/v溶液于无菌去离子水中，聚乙烯醇存储液2.3%w/v溶解于无菌去离子水中，四水合钼酸铵存储液5.7%w/v溶解于6molhcl中；以上三种存储液与无菌去离子水按照2：1：1：2的比例配制孔雀绿工作液，保存于4℃，注意孔雀绿工作液配制使用最好提前一天，切勿现配现用。(2)atp酶活性检测体系1xbuffer：0.017%tritonx-100，100mmtris–hclph7.4，20mmkcl，6mmmgcl2。(3)磷酸氢钾溶液（50mm）：称取0.34g无水磷酸氢钾粉末，溶解于50ml无菌去离子水，室温保存。(4)柠檬酸三钠终止液：34%w/v，称取柠檬酸三钠粉末，溶解于无菌去离子水中。(5)atp-mg存储液（100mm）：称取atp粉末，溶解于1.7.7（2）中的1xbuffer。(6)atp-mg工作液：用1.7.7（2）中1xbuffer稀释100mmatp-mg存储液至2.5mm，作为工作液。计算机分析软件2.1生物信息学途径ncbi:http://www.ncbi.nlm.nih.gov；获取基因信息。blat:http://ucsc.genome.edu/blat；序列比对。rcsb:http://www.pdb.org/pdb/home/home.do；蛋白质结构信息。计算机分析软件2.2.1生物电泳凝胶成像及扫描分析软件smartview3.0；uvpgelworksidadvancedversion2.51。引物设计及序列比对软件cedesignv1.04;serialcloner;genesnap。图像处理软件adobephotoshopcs2；powerpointimagej1.46r2.2.4数据分析及统计软件microsoftoffice系列软件word，excel，powerpoint；graphpadprism63实验方法3.1构建vcp表达质粒3.1.1获得目的基因利用cedesignv1.04软件设计pet28a(+)-vcp重组引物，以psg5-flag-vcp为模板，通过基因编辑将vcp克隆入原核表达质粒载体pet28a(+)中。首先通过pcr反应，获得vcp目的基因。pcr反应体系：template(50ng/μl)1μl，上游引物（10mm）1μl，下游引物（10mm）1μl，pcr酶1μl，10x缓冲溶液5μl，最后加无菌去离子水补齐至50μl。pcr反应步骤：95℃预变性30sec；95℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸1min；12℃冷却。酶切获得pet28a(+)载体酶切反应体系：pet28a(+)(4μg)，ecorienzyme1μl，bamhienzyme1μl，10x缓冲溶液5μl，最后加无菌去离子水补齐至50μl。将该酶切体系至于37℃，孵育30min，后根据载体片段大小，选择合适浓度的琼脂糖凝胶，进行琼脂糖凝胶电泳。一般情况下，使用较低浓度的琼脂糖凝胶来分离相对分子质量高的dna片段，而用高浓度的琼脂糖凝胶来分离相对分子质量低的dna片段。小于0.5kb的dna片段，可以用1.2-1.5%的琼脂糖凝胶来分离；大于10kb的dna片段，可以用0.3-0.7%的凝胶；当dna片段介于两者之间时，可以使用0.8-1.0%的琼脂糖凝胶。用天平称取1g琼脂糖固体，放入500ml玻璃瓶，加100ml1xtae，置于微波炉中高火加热至沸腾，待完全融解混匀，冷却至50℃~60℃，按照使用比例（1：40000）添加gelred染料，充分混合均匀，仔细倒入插有梳齿的胶板中，大约40分钟，琼脂糖凝胶凝固后，放入已经倒有1x的电泳缓冲液的的电泳槽内进行点样。在待上样的样品中加入10xloadingbuffer，混合均匀开始点样，上样完成后，调整电泳仪参数进行电泳。采用恒压电泳，小号电泳仪使用50v，中号使用100v，大号电泳仪使用150v。样品的电泳结束后，在凝胶成像系统中观察酶切的结果。酶切的产物回收，根据多功能琼脂糖凝胶回收试剂盒的方法，回收所需的目的条带，用nanodrop2000超微量分光光度计检测浓度。注意配好的琼脂糖凝胶需当天使用。目的基因与载体的重组连接重组反应体系：酶切后载体，pcr产物，fusionenzyme1μl，2x缓冲溶液5μl，最终加入无菌去离子水补齐至10μl。酶切后胶回收的载体与pcr产物按照1：3的比例（载体与pcr产物的质量比）加入新的无菌1.5mlep管中，置于37℃，连接30min。结束后，连接产物静置在冰上，等候下一步的转化。连接产物转化先用1.5ml灭菌ep管取50μl感受态细胞dh5α置于冰上，加入1μl上述的连接产物，混匀，冰上孵育30min，42℃热激90sec，置于冰上1min，然后加入400μllb。置于飘板，放到37℃摇床，1小时后离心，3000rpm，5min，弃200μ上清，剩余菌液混匀后涂于具有相应抗性的lb平板，在37℃恒温细菌培养箱中培养。待20小时左右，看单克隆生长情况。待菌株的相应单克隆长大，挑单克隆放入3ml相应抗性的lb培养基中，置于37℃摇床，摇菌约15小时后，5000rpm离心5min，收菌，使用质粒的小量抽提试剂盒提取质粒，nanodrop2000检测浓度，外送质粒样品进行测序，以确保质粒的正确序列。构建表达vcp截短体蛋白的原核表达质粒3.2.1获取目的基因设计vcp突变体的引物，以pet28a(+)-vcp野生型为模板，按照以下步骤构建vcp原核表达突变体。获得目的质粒，pcr反应体系：template(50ng/μl)1μl，上游引物（10mm）1μl，下游引物（10mm）1μl，pcr酶1μl，10x缓冲溶液5μl，最后加无菌去离子水补齐至50μl。pcr反应步骤：95℃预变性30sec；95℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸1min；12℃冷却。pcr结束后，根据多功能胶回收试剂盒的步骤，对pcr产物进行回收。nanodrop2000测核酸浓度。酶切pcr产物dpni酶切反应体系：pcr回收产物2μg，dpnienzyme1μl，10x缓冲溶液5μl，最后加入无菌去离子水补齐至50μl。该酶切体系至于37℃，孵育30min，dpni酶切结束后，酶切产物置于冰上，待转化。dpni的识别且剪切的是dna双螺旋链中腺嘌呤n6位甲基化（n6-methyladenine）的gatc序列。pcr中的模板质粒是从大肠杆菌dh5α中抽提而来，所以，模板质粒具有dpni的识别位点，而在pcr过程中产生的质粒理论上不具备甲基化，所以在pcr结束后加dpni，酶切模板质粒，而剩余新合成目的产物。酶切产物转化上述的酶切后产物，吸取1ul转化。先用1.5ml灭菌ep管取50μldh5α细胞，放置到冰上，加入1μl酶切后产物，混匀，冰上孵育30min，42℃热激90sec，置于冰上1min，然后加入400μllb。置于飘板，放到37℃摇床，1小时后离心，3000rpm，5min，弃200μl上清，剩余的菌液混合均匀涂lb平板，37℃恒温细菌培养箱培养。待20小时左右，看单克隆生长情况。待菌株的单克隆肉眼可见，挑取合适大小的单克隆菌株放入3ml相应抗性的lb培养基中，至于37℃摇床，摇菌约15小时，5000rpm离心5min，收菌，参照质粒的小量抽提试剂盒步骤提取质粒，检测测质粒浓度，样品送测序，以保障质粒序列无误。构建pet28a(+)-flag-vcp原核表达质粒3.3.1获取目的基因设计重组引物，以pet28a(+)-vcp的野生型为模板，按照以下步骤构建vcp的原核表达质粒。获得目的质粒，pcr反应体系：template(50ng/μl)1μl，上游引物（10mm）1μl，下游引物（10mm）1μl，pcr酶1μl，10x缓冲溶液5μl，最后加无菌去离子水补齐至50μl。酶切获得pet28a(+)且切除6xhis序列的载体酶切反应体系：pet28a(+)(4μg)，xholenzyme1μl，bamhienzyme1μl，10x缓冲溶液5μl，最后加水补齐至50μl。琼脂糖凝胶电泳以及胶回收，详见实验方法3.1.2。重组与产物连接目的基因与酶切后载体的重组连接以及连接产物的转化步骤，详见实验方3.1.3以及3.1.4。构建pgex-6p-2-p47原核表达质粒以pgex-6p-2为载体设计重组引物，以psg5-flag-p47野生型为模板，按照以下步骤：目的质粒的获取，载体的酶切，目的基因与酶切载体的连接，质粒的转化，逐步构建pgex-6p-2-p47原核表达质粒。步骤详见实验方法3.2。所有引物见表1。蛋白纯化3.5.1质粒转化以及菌体蛋白诱导将pet28a(+)-vcp原核表达质粒转化到bl21感受态细胞内（专用于蛋白表达的原核表达菌株），转化步骤详见实验方法3.1.4。挑取单克隆菌株置于具备相应抗生素的lb液体培养基，摇菌，od值达到0.8~1时，在超净台内加入0.5mmiptg，18℃诱导20小时，5000rpm离心10min，收菌。蛋白纯化菌体裂解，加入裂解液，充分吹打至菌体完全吹散。冰上放置，裂解半小时（裂解液：100mmtris-hcl,ph7.5,500mmkcl,5mmmgcl2,2%triton-x-100,10%glycerol，裂菌时加入溶菌酶1mg/ml以及pmsf）。超声破碎仪充分裂菌（参数是功率200w，超声5s，间歇5s，循环30次左右，待裂解液变的不再粘稠或者变澄清或者半透明，根据菌株的不同，菌体的量或者菌体的冻存情况，适当延长或者缩短超声裂解的时间）。裂解过程不能过度，否则裂解过度产生的白色泡沫会使蛋白变性。裂解结束后，10000rpm，4℃，离心30min，注意配平。此时所需的蛋白均在上清中，将上清样加入已用裂解液预洗过的ni-ntaresin中，4℃孵育1小时，先用含有30mm咪唑的洗脱液（100mmtris-hcl,ph7.5,500mmkcl,5mmmgcl2,10%glycerol)洗涤ni-ntaresin3次，4℃，2000rpm离心3min，弃上清以去除非特异性结合的杂蛋白。最后分别用含有50/75/150/200mm咪唑的洗脱液将目的蛋白从ni-ntaresin上洗脱下来。考马斯亮蓝染色(cbs)sds-page凝胶电泳，检测目的蛋白是否被洗脱下来。分别取50ul洗脱样品，每份样品中加入10ul6x上样缓冲液，100℃水浴10min，用上样针把已经准备好的蛋白样品小心加入sds-page胶的孔槽内，90v恒压电泳约30min，蛋白样品均进到下层的分离胶内，后将电压下调至120v继续恒压电泳，至溴酚蓝完全从分离胶中跑出，电泳结束。当蛋白电泳结束后，蛋白胶放入染色液中—考马斯亮蓝染色液，开始染色，置于水平摇床，室温1小时，弃染色液，去离子水洗涤，加入脱色液，置于摇床，室温1小时，弃脱色液，加入新脱色液（已配置好的脱色液与去离子水按体积比1：1混匀），脱色过夜，第二天可见清晰条带。蛋白脱盐，浓缩以及保存根据蛋白胶脱色情况，选取蛋白洗脱浓度高以及比较纯净的洗脱组分，进行蛋白脱盐。按照蛋白脱盐柱说明书实验步骤，对蛋白脱盐，去除溶液中过多的咪唑。先把蛋白脱盐柱用25ml去离子水清洗，再用25ml蛋白存储液洗涤，待脱盐柱内的液体完全流干净后，加入2.5ml待脱盐的蛋白样品，待样品完全流干净，立刻向柱子内加入蛋白存储液，此时开始收集脱盐柱流出的液体3.5ml，蛋白便在该3.5ml溶液内。为了提高所需蛋白的浓度，使用超离浓缩柱，5000rpm，4℃，离心（离心时间长短，根据蛋白浓缩体积确定，适当延长或者缩短），收集离心管内剩余的样品。使用bca试剂盒检测蛋白浓度，分装蛋白于1.5mlep管内，保存于50mmtris-hclph7.5,100mmkcl,10%glycerol溶液中，置于-80℃，待用。蛋白脱盐的过程要在冷库进行，防止蛋白在纯化的过程中出现降解。再生ni-ntareasin可以反复回收再生，该过程需要用多种不同溶液洗涤beads，具体步骤如下：用2倍柱体积的再生溶液（6m盐酸胍，0.2m乙酸）洗涤beads；用5倍柱体积的水洗涤；用3倍柱体积的2％sds洗涤；用3倍柱体积的2％sds溶液洗涤；用1倍柱体积的25％乙醇溶液洗涤；用1倍柱体积的50％乙醇洗涤；用1倍柱体积的75％乙醇洗涤；用5倍柱体积的100％乙醇洗涤；用1倍柱体积的75％乙醇洗涤；用1倍柱体积的50％乙醇洗涤；用1倍柱体积的25％乙醇洗涤；用1倍柱体积的水洗涤；用5倍柱体积的100mmedta，ph8.0洗涤10min（鳌合除去多余的ni离子）；用5倍柱体积的水洗涤；用2倍柱体积的100mmniso4室温结合30min（该步骤结束后，beads可放置于4℃，待下次使用）。超离浓缩管回收先用去离子水洗涤超滤离管2次，再加入5ml去离子水，室温5000rpm离心5min，离心结束后向超离管内加满50%乙醇，可保存于4℃冰箱，待下次使用。蛋白脱盐柱回收蛋白脱盐结束后，先用25ml去离子水洗涤脱盐柱，再用20ml25%乙醇洗涤脱盐柱，在脱盐柱内灌满25%乙醇，保存于4℃，可循环使用。蛋白纯化从中国科学院上海药物所获得gst-lc3原核表达质粒，bl21蛋白表达菌株转化，诱导，裂解步骤详见2.1，在该蛋白纯化过程中值得注意的是，用gst-beads抓取裂解液中的gst-lc3蛋白，4℃孵育1小时。最终用含有20mm谷胱甘肽的洗脱液从gst-beads上洗脱gst-lc3蛋白，将洗脱下来的蛋白脱盐，浓缩，bca测蛋白浓度，步骤详见实验方法2.4.5。蛋白保存于50mmtris-hclph7.5,100mmkcl,10%glycerol溶液中，置于-80℃，待用。蛋白纯化htt-q25/mhtt-q72原核表达质粒，bl21蛋白表达菌株转化，诱导，裂解步骤详见3.5.2，用his-beads抓取裂解液中的his-htt-q25/mhtt-q72蛋白，最终用200mm咪唑的洗脱液（100mmtris-hclph7.5,500mmkcl,5mmmgcl2,10%glycerol)将目的蛋白从ni-ntaresin洗脱下来。蛋白脱盐，浓缩，bca测蛋白浓度，步骤详见2.4.5。保存于50mmtris-hclph7.5,100mmkcl,10%glycerol溶液中，置于-80℃，待用。蛋白纯化将构建所得pet28a（+）-flag-vcp的原核表达质粒（载体切除表达6xhis的核酸片段），转化入bl21感受态细胞。质粒转化，诱导，裂解，步骤详见实验方法3.5，flag-beads抓取裂解液中的flag-vcp蛋白，含有10mm多肽的洗脱液从flagbeads上洗脱flag-vcp蛋白，将洗脱下来的蛋白脱盐，浓缩，bca测蛋白浓度，步骤详见实验方法3.5.4，保存于50mmtris-hclph7.5,100mmkcl,10%glycerol溶液中，置于-80℃，待用。蛋白纯化构建所得的pgex-6p-2-p47原核表达质粒，转化入bl21感受态细胞。质粒转化，诱导，裂解，步骤详见实验方法3.5.2，用gst-beads抓取裂解液中的gst-p47蛋白，最后用含有20mm谷胱甘肽的洗脱液从gst-beads上洗脱gst-lc3蛋白，将洗脱下来的蛋白脱盐，浓缩，bca测蛋白浓度，步骤详见实验方法3.5.4。蛋白保存于50mmtris-hclph7.5,100mmkcl,10%glycerol溶液中，置于-80℃，待用。的atp酶活筛选以及性检测方法vcp蛋白具有atp酶活性，可催化atp水解成adp和磷酸根离子，通过检测磷酸根的释放的情况，可计算出该蛋白的催化速率。磷酸根离子可以与钼酸铵形成磷钼杂多酸沉淀，在酸性条件下与孔雀绿分子络合形成可溶性的络合物，其最大吸收波长在620nm附近。vcp酶活的筛选与检测方法相同，都采用了孔雀绿比色法检测无机磷的释放速率。磷酸标准曲线绘制磷离子标准品梯度pi(μm)：0，1，5，10，20，50，100，200，300，500；磷离子标准品反应体系（25μl）：2x缓冲溶液12.5μl，磷离子标准品1μl，最后加入无菌无磷酸根离子水补齐至25ul。先配制一个高浓度的磷酸氢钾溶液（potassiumphosphatemonobasicanhydrous,50mm），按照表准备磷离子梯度标准品。使用孔雀绿工作液，检测不同磷离子浓度时的od620值，绘制相应磷离子标准曲线。酶活性筛选atp酶活性反应体系：2x缓冲溶液12.5μl，vcp蛋白1μl，小分子/dmso1μm，atp-mg工作液0.25μl，最后加入无菌无磷酸根离子水补齐至25ul。每个反应体系中含有40µm化合物、1µm6xhis-vcp野生型蛋白，溶液体系为atp酶活反应缓冲液，每个反应的体积为25µl，所有反应物除atp以外首先配成混合液，待所有准备工作完成后加入atp并混匀，立即用multidrop自动分液仪将反应液加入透明96孔板中，于冰上孵育30分钟，使得化合物与蛋白能够充分结合，然后置于37℃反应1.5小时。反应完成后用multidrop自动分液仪加入80µl/孔孔雀绿工作液，然后立即加入10µl34%柠檬酸钠，混匀，置于37℃反应15min后，在enspire多功能酶标仪上检测620nm波长处的吸光度。不含vcp蛋白的样品信号平均值作为背景值，dmso组样品信号平均值作为对照。酶活性检测酶活性检测的反应体系同3.10.2，先将小分子与蛋白于冰上共孵育30min，再加入atp-mg2+工作液于37℃共孵育1.5小时。之后加入80μl孔雀绿工作液，立刻加入10μl34%柠檬酸钠终止atp的水解反应，置于37℃孵育15min，enspire多功能酶标仪上检测620nm波长处的吸光度，最后用graphpadprism6进行数据分析。在此过程中所有试剂均无磷离子，否则影响磷离子检测。孔雀绿工作液不建议现配现用，最好至少提前一天配制，效果最佳。等温滴定量热法(isothermaltitrationcalorimetry,itc)实验开始前须将仪器进行清洗，配制1%洗涤清洗剂（500ml超纯水内加入5ml洗涤剂），用注射器清洗5遍。准备3l左右的去离子水，清洗样品池3次，用注射器清洗约50遍，在该实验中清洗干净与否对结果的影响很重要。接下来对样品，buffer，去离子水脱气10min，去除液体内的气泡。将样品加入仪器内，使用已经脱气的去离子水润洗参比池2次，注射器对准参比池沿右侧孔插入，轻碰底部后抬起约1mm，之后缓慢推入，用封闭针封闭参比池（一般情况下，需要每周换一次水，但是为了保证样品池与参比池液体体积相同，需要每次使用前均要进行液体的更换）。用已经脱气的去离子水仔细润洗样品池2次，用注射器吸取样品加入样品池内。空的注射针放入手柄内，置于仪器上，同时校准注射器量程。上样结束后，开始在设备上运行。本实验采用的一些参数为：一共滴20滴，25µl每滴，每两滴间隔400s；300μlvcp（14µm），50µl醋酸棉酚（700µm）。仪器运行结束后，将样品吸出，并按照实验开始时的仪器清洗步骤进行清洗，最后将样品池和参比池注入300μl去离子水，下次使用。蛋白热稳定性迁移实验(proteinthermalshift)3μg6xhis-vcp野生型或者vcp的截短突变体蛋白分别与5μm醋酸棉酚混匀于pcr管中，置于冰上，避光孵育30min（体外实验体系50μl：100mmtris-hclph7.5,150mmnacl），利用t100thermalcyclerpcr仪设定一组温度梯度（50/56.8/64.3/72.0/86.6/90℃），在温度梯度下，加热各组蛋白，thermalshift反应条件（50μl）：25℃2min，不同温度50/56.8/64.3/72/78.6/86.6/90℃各自加热3min，最后降温至12℃实验结束。加热结束后，12000rpm，4℃，离心2min，吸上清30μl加入新1.5mlep管内，之后向样品内加入6μl6x上样缓冲液，100℃煮样10min，进行sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，详细步骤参照实验方法3.5.3。条带的强弱由imagej软件进行灰度扫描获得，tm值利用graphpadprism6进行波尔兹曼拟合计算。细胞复苏为了保证细胞的最佳活力，要确保慢冻快溶的原则。从液氮罐中取出的冻存管置于37℃水浴，并讯速晃动使之快速融化。用移液枪把溶解的细胞悬液吸出，注入15ml的无菌离心管，添加10倍体积的新鲜培养基混匀，1000rpm，室温离心5min，弃上清。用1ml细胞完全培养基重悬细胞，并将其吸入合适大小的无菌培养皿中，置于37℃，5%co2无菌恒温细胞培养箱内，贴壁后及时更换培养基传代培养。细胞传代当细胞增殖达到90%汇合度时，进行传代。以10cm无菌培养皿为例，去掉细胞原来的培养基，用1ml无菌pbs，轻柔地清洗一遍，弃去，加入1.5ml胰蛋白酶消化液，充分覆盖所有细胞，培养皿置于37℃，5%co2无菌恒温细胞培养箱中消化1~5min左右（依据细胞贴壁性的差异，适度调整胰酶消化时间，显微镜下观察细胞形态开始变圆时，消化停止）。加入2ml完全培养基培养基来终止胰酶消化，充分轻柔地吹散细胞，待细胞完全分散后转入15ml无菌离心管内，1000rpm，室温离心5min弃上清，新鲜培养重悬细胞，按照合适的比例（依据细胞大小以及生长速度适度调整）将细胞传至无菌培养皿，置于37℃，5%co2无菌恒温细胞培养箱中。细胞冻存胰蛋白酶消化液消化正处于生长对数期的单层细胞（悬浮细胞直接移至15ml无菌离心管，1000rpm离心5mn，即可），转入15ml无菌离心管内，1000rpm，室温离心5min，离心弃上清，用现配制的包含10%dmso，20%胎牛血清的冻存培养液重悬细胞，调整密度至1×107细胞/ml左右，吸入无菌冻存管中，每管所加细胞悬浮液体积为1~1.5ml。注意在冻存管上标明细胞的称，冻存时间以及操作者；提前一天将细胞冻存盒置于室温的通风橱内，并检测冻存盒内的异丙醇是否还足够使用。把待冻存的细胞置于冻存盒中，-80℃放置，后移入液氮罐中保存。细胞瞬时转染3.16.1细胞铺板胰蛋白酶消化贴壁细胞并将细胞接种到合适大小的细胞培养皿中（以6cm培养皿为例），置于5%co2，37℃无菌恒温细胞培养箱，细胞铺板18小时，接种细胞贴壁并且汇合度达到70-80%后，可进行下一步转染操作。质粒转染细胞选取2个无菌的1.5mlep管分别标为a，b。a加200μl无血清dmem孵育15μlpei脂质体，b加200μl无血清dmem以及5μg质粒，混合均匀；后将a和b混匀，室温孵育30min。将混合液沿培养皿壁滴加入3.16.1步骤中待转染的细胞培内，24~48小时后便可检测转染质粒在细胞内的表达情况。如果使用毒性比较强的转染试剂比如lipo2000，为了维持细胞正常的生长，可在细胞转染结束后6小时更换新的细胞完全培养基。是否需要给细胞换液根据其生长情况，酌情而定。免疫共沉淀实验方法(ip)hek293t细胞铺板以及质粒转染实验参照实验方法2.4.16，真核表达质粒psg5-flag-vcp以及gfp-lc3共同转染细胞36小时后，在dmem完全培养基内加入不同浓度的醋酸棉酚处理细胞12小时。药物处理结束后，hek293t细胞用胰蛋白酶消化液消化下来，转入1.5mlep管，1xpbs洗2次，1000rpm室温离心5min。将细胞沉淀至于冰上，每管分别加入0.8ml裂解液（200mmtris-hcl,50mmnacl,1%tritonx-100,蛋白酶抑制剂），轻轻吹打10次，置于冰上裂解20min，待细胞完全裂解后，12000rpm，4℃离心15min留上清。分别从每管中各取50ul上清，作为input，剩余样品全部加入已加有预洗过flag-beads的1.5mlep管内，置于4℃转盘上，孵育3小时。后2000rpm，4℃，离心1min，弃上清；清洗液（200mmtris-hcl,50mmnacl,0.5%tritonx-100）洗flag-beads3次，2000rpm，4℃，离心1min。最后一次洗涤完成后，吸掉全部液体，每个ep管内分别加入2x上样缓冲液，100℃水浴煮沸10min，2000rpm，室温离心1min，上清吸入新的1.5mlep管内（切勿吸到beads）。样品制备完毕，上样进行sds-page凝胶电泳。样品可保存于-20℃。实验3.18.1vcp与lc3体外互作实验8μg6xhis-vcp蛋白与不同浓度的醋酸棉酚（体外实验体系0.5ml：50mmtris-hclph7.5,150mmnacl,1%tritonx-100），4℃孵育2小时，后加入4μggst-lc3蛋白，4℃孵育2小时。每管各吸取100μl样品，作为input。将每管剩余溶液全部吸入有已用裂解液预洗过的gst-beads的新的ep管内，4℃孵育1小时。离心弃上清，4℃，2000rpm，1min，用洗脱液（50mmtris.hclph7.5,150mmnacl,1%tritonx-100）洗涤四次，最后一次洗涤完成后将上清完全弃掉，再加2x上样缓冲液100μl，100℃煮样10min。最后4℃，2000rpm离心1min取上清，作为pulldown样品。取合适体积的样品，上样至10%蛋白凝胶，sds-page凝胶电泳。90v基层胶的电泳，120v分离胶的电泳，直至目的条带分散开来，在bio-rad半干转膜仪器中转膜，一块胶的半干转膜条件为0.25ma，60min（可以根据蛋白大小适当调整转膜时间），转膜结束后，在1xpbst配制的5%的脱脂牛奶中，置于摇床，室温封闭1小时。与特异性的抗体孵育，置于4℃摇床过夜。次日，用pbst清洗nc膜，置于室温摇床5min，清洗三次，与相应二抗共孵育，置于室温摇床1小时，用pbst清洗三次，条件同一抗，使用ecl显色试剂盒以及化学发光仪，对蛋白条带曝光检测，保存结果。另取合适体积的样品，进行sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，详细步骤见实验方法3.5.3考染方法。与p47体外互作实验8μg6xhis-vcp蛋白与10μm醋酸棉酚以及dmso（体外实验体系0.5ml：50mmtris-hclph7.5,150mmnacl,1%tritonx-100），分别在4℃孵育2小时于1.5mlep管内，后分别加入4μggst-lc3或者4μggst-p47蛋白，4℃孵育2小时。每管各吸取100μl样品，作为input。将每管剩余溶液全部吸入有已用裂解液预洗过的gst-beads的新的ep管内，4℃孵育1小时。离心弃上清，4℃，2000rpm，1min，用洗脱液清洗四次，弃上清，最后加2x上样缓冲液100μl，100℃煮样10min。最后4℃，2000rpm离心1min取上清，作为pulldown样品。进行sds-page凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，详细步骤见实验方法2.4.5.3。与lc3以及mhtt-q72/htt-q25蛋白间体外互作实验8μg6xhis-vcp蛋白先与不同浓度的醋酸棉酚（体外实验体系0.5ml：50mmtris-hclph7.5,150mmnacl,1%tritonx-100），4℃孵育2小时，后加入4μggst-lc3蛋白以及6μgmhtt-q72/htt-q25蛋白，继续4℃孵育2小时。每管各吸取100μl样品，作为input。将每管剩余溶液全部吸入有已用裂解液预洗过的gst-beads的新的1.5mlep管内，4℃孵育1小时。离心弃上清，4℃，2000rpm，1min，用洗脱液洗涤四次，弃上清，最后加2x上样缓冲液100μl，100℃煮样10min。最后4℃，2000rpm离心1min取上清，作为pulldown样品。进行sds-page凝胶电泳，一块胶进行考马斯亮蓝染色，详细步骤见实验方法3.5.3，另一块胶进行westernblot检测。与mhtt-q72/htt-q25蛋白间体外互作实验5μgmhtt-q72/htt-q25蛋白与4μggst-lc3蛋白（体外实验体系0.5ml：50mmtris-hclph7.5,150mmnacl,1%tritonx-100）在10μm醋酸棉酚环境中（或者在1/10μgflag-vcp蛋白的环境中），4℃孵育2小时，dmso组作为对照。每管各吸取100μl样品，作为input。将每管剩余溶液，各吸取350μl加入有已用裂解液预洗过的gst-beads的新的1.5mlep管内，4℃孵育1小时。离心弃上清，4℃，2000rpm，1min，用洗脱液洗涤四次，弃上清，最后加2x上样缓冲液100μl，100℃煮样10min。最后4℃，2000rpm离心1min取上清，作为pulldown样品。进行sds-page凝胶电泳，一块胶进行考马斯亮蓝染色，详细步骤见实验方法3.5.3，另一块胶进行westernblot检测。蛋白样品制备以24孔板的贴壁细胞样品收集为例，将细胞培养皿从5%co2，37℃无菌恒温细胞培养箱中取出，在超净台内先将细胞培养基弃掉，1x灭菌pbs清洗一遍，每孔加200ul2x上样缓冲液，轻柔地吹打数次，冰上放置20min，用移液枪充分混匀并吸入1.5mlep管内，100℃煮样10min，蛋白样品制备完毕，可置于-20℃保存。电泳及抗体孵育用微量进样器小心地将已经准备好的蛋白样品加入配制好的合适浓度的sds-page胶的上样孔内（根据所要检测蛋白的大小选择合适浓度的蛋白胶，6%的胶的最佳分离范围为200~400kd；8%胶的最佳分离范围为100~200kd；10%胶的最佳分离范围为30~100kd；15%胶最佳的分离范围为小于30kd的蛋白），首先用90v恒压电泳30min，等蛋白样品均进入到分离胶内，然后下调电压至120v继续恒压电泳，至溴酚蓝完全从分离胶中跑出，蛋白电泳结束。接下来使用bio-rad半干转膜仪器，将蛋白从sds-page胶转移到硝酸纤维素膜（nc膜）。首先将sds-page胶，滤纸，nc膜完全浸泡于转膜缓冲液内，在转膜盒中从下往上顺序放置2层滤纸，nc膜，sds-page胶，两层滤纸。转膜条件为：恒流（0.25ma/每块胶），1小时（根据蛋白的大小可以适当调整转膜时间）。转膜完毕的nc膜转移到丽春红染色液中，预判蛋白转膜情况，之后将nc膜置于1xpbst配制的5%脱脂牛奶溶液中，室温，摇床上封闭1小时。倒掉封闭液，1xpbst清洗nc膜上的牛奶残迹，参照特异性抗体推荐使用比例，将特异性抗体分别加入5%bsa溶液中，nc膜完全浸润在配置好的特异性抗体溶液内，置于摇床4℃孵育过夜。次日，用1xpbst缓冲溶液清洗nc膜3次，每次均置于室温摇床5min，之后按照二抗推荐使用比例，将二抗加入5%脱脂牛奶溶液中，加到nc膜上，待nc膜全部浸润于二抗内，置于摇床室温孵育1小时。用pbst清洗三次，条件同一抗。nc膜洗涤完毕后准备显色，检测蛋白条带。显色反应利用ecl显色试剂盒以及chemiscope3400mini化学发光成像系统，对蛋白条带检测。按照ecl显色反应步骤，预先按照1：1等体积混匀显色液a与b，将混合物覆于nc膜，室温孵育1min，将nc膜置于化学曝光仪器中曝光显影，获取化学显色图片。保存结果。注意在westernblot过程中，nc膜不能干掉，否则影响实验结果。胰蛋白酶酶解实验胰蛋白酶解体系50μl:（20mmtris-hcl,ph7.5,80mmnacl,2.5mmmgcl2,1mmdtt,10%glycerol）6xhis-vcp蛋白（10μg）分别与不同的小分子化合物孵育，4℃，1小时，dmso做为对照组，后加入胰蛋白酶（promegav5111,50μg/ml），于37℃恒温培养箱共孵育1小时。加入6x上样缓冲液10μl，100℃煮沸10min，终止反应。酶解产物上样至10%sds-page蛋白凝胶，进行电泳，考马斯亮蓝染色检测酶解条带，步骤详见实验方法3.5.3考染方法。细胞活力检测实验第一天接种5000个q47细胞到96孔板细胞培养板中，每空加入190μl培养基，5%co2，37℃细胞恒温培养箱。次日，细胞完全贴壁后，每孔分别加入10μl梯度稀释的小分子醋酸棉酚（终浓度由高到低，最高浓度为50μm，两倍梯度稀释9个浓度，另加dmso为对照组，每孔设置3个复孔），继续置于5%co2，37℃细胞恒温培养箱。72小时后，每孔加入20μl0.1%alamarblue溶液，置于细胞培养箱孵育4小时，在enspire多功能酶标仪上检测590nm波长处的吸光度，最后用graphpadprism6进行数据分析。果蝇实验3.22.1果蝇模型(1)神经系统驱动系elav-gal4，从印第安纳布卢明果蝇种子中心获得的uas-full-htt-128q（表达人类全长并且含有128q的htt与gal4系杂交）;(2)将puast-exon1-htt-72q载体注射到w1118果蝇的胚胎中，生产uas-exon1-htt-72q果蝇品系。与gal4品系杂交后，表达n端具备72q的人的htt片段，通过均相时间分辨荧光（htrf）以及westernblot验证其表达与否。行为实验实验还未开始前，需要对果蝇进行维持，大概四至五天将培养管内的果蝇移入新的培养管内，置于25℃恒温培养箱维持即可。用雌性elav-gal4果蝇和雄性uas-full-htt-16q，uas-full-htt-128q，uas-exon1-htt-25q，uas-htt-exon1-72q果蝇杂交（杂交组合为6雌4雄），置于25℃恒温培养箱，大约10天后，得到子代，挑选同一天的处女蝇，放入盛有干净食物的15ml管子中，每管15只为一组备用。按照标准方法配置食物，每管加400μl食物干燥后在食物表面加入液体化合物，放置于超净工作台通风过夜。(食物先在微波炉中溶解，加入离心管，待食物凝固后，再加化合物，待化合物完全渗入食物中便可饲养果蝇，每两天换一次食物和药）。挑选第二天的处女蝇放入加入药物的培养基中培养，从第二天开始，在每天同一时间敲管，保持室温一致。隔天敲一次，记录果蝇爬管情况（统计15秒爬到10cm高度的果蝇数目），记录每组实验中果蝇存活数目。计算分析爬管曲线以及果蝇存活曲线（周期为2周左右）。做三次生物学重复。果蝇头部htt蛋白含量水平测试实验将喂药6天后的果蝇处死（从处女蝇第二天开始喂药），在解剖镜下取其头部，加裂解液（1xpbs+1%tritonx-100，裂解时加入蛋白酶体抑制剂），将头部超声裂解，4℃，12000g，10min，留上清。使用bca蛋白定量试剂盒检测浓度，在384孔板中，每孔加入一定量蛋白，加入htt相应抗体对，使抗体对与蛋白样品体积比为3：2，4℃过夜。第二天，将384孔板放入读板机中，用激光激发，读取数值，测量htrf信号。免疫荧光共聚焦实验3.23.1醋酸棉酚处理hela细胞后的免疫荧光实验第一天接种2×104hela细胞到预先放置有盖玻片的24孔板细胞培养板中，5%co2，37℃细胞恒温培养箱。次日，细胞完全贴壁后，弃掉培养基，1xpbs洗1次，4%pfa于室温下固定10min，后透化液打孔室温10min，1xpbs洗3次每次5min。每孔内加500μl5%bsa溶液，室温封闭30min，依据相应特异性一抗的推荐使用比例，5%bsa配制一抗，将配置的一抗加入24孔板内，玻片完全浸润于一抗，置于4℃冰箱过夜。次日，pbst清洗玻片3次，后与相应荧光二抗共孵育（避光），室温1小时，pbst清洗3次，条件同一抗。把封片剂滴加到载玻片上（每片玻片使用7μl封片剂即可），小心将玻片倒扣于封片剂上，切勿产生空泡，否则会影响观察视野。封片后，避光晾干，至于标本盒，4℃保存，待荧光共聚焦显微镜检测结果，数据图片分析。细胞自噬流检测2×104稳定表达mcherry-egfp-lc3的hela细胞接种到预先放有盖玻片的24孔板中，置于5%co2，37℃细胞恒温培养箱，次日待细胞贴壁后，吸掉培养基，1xpbs清洗1次，冷甲醇固定打孔10min，1xpbs清洗3次，每次5min。加封片剂封片，避光晾干，置于标本盒内，4℃避光保存，待荧光共聚焦显微镜检测结果，数据图片分析。细胞内lc3与lamp1的共定位实验2×104hela细胞接种到预先放有盖玻片的24孔板细胞培养皿中，置于5%co2，37℃恒温培养箱，次日待细胞贴壁，吸掉培养基，1xpbs洗1次，4%pfa室温固定10min，加入透化液室温10min，1xpbs洗3次每次5min。每孔加500μlpbst配置的5%bsa,室温封闭30min，与相应的一抗孵育过夜。次日，pbst清洗玻片，室温5min，清洗3次，与相应荧光二抗共孵育（避光），室温1小时，1xpbst清洗3次，条件同一抗，加封片剂封片，避光晾干，于标本盒4℃避光保存，待荧光共聚焦显微镜检测结果，数据图片分析。非变性胶实验原核纯化蛋白6xhis-vcp(10μg)与不同浓度的醋酸棉酚（1/10/20μm）在50μl缓冲体系内（200mmtris-hcl,50mmnacl）4℃共孵育1小时，孵育结束后，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-page）。native-page电泳时不需要加入sds等变形剂，因此。该过程中的生物大分子可保持其天然形状以及电荷数，依据不同蛋白的电泳迁移速率不同以及凝胶分子筛的作用，从而对蛋白进行分离。native-page电泳与sds-page电泳在操作上基本相同，但要注意试剂的配制不需要加入变性剂，以及实验过程中样品维持4℃，在bn-page过程较长，可以加入冰块，放置温度过高影响结果。基因敲减实验3.25.1细胞铺板胰蛋白酶消化细胞后，细胞接种到合适大小的细胞培养皿中（以6孔板为例），约18小时待接种细胞的密度达到40-50%，可进行下一步转染操作。基因敲减转染取2个无菌rnasefree的1.5mlep管分别标为a，b。a，b分别加200μl无血清无双抗的dmem，a管加入6μllipofectaminernaimax，混合均匀；b管加入10μlsirna（10μm），混匀，于室温下静置5分钟，a和b混合后共孵育25min。将混合液加入上步骤中待转染的细胞培养皿内，48~72小时后，收裂解液进行htrf实验或者进行sds-page电泳检测蛋白敲减情况。在该过程中，确保使用rnasefree的耗材，防止sirna被降解而不发挥作用。检测htt蛋白水平的均相时间分辨荧光（htrf）实验用裂解液（1xpbs中含有0.4%tritonx-100以及蛋白酶抑制剂）裂解细胞，用相应的抗体进行检测，所有的样品都要用bca测量总蛋白的浓度来确保所加样品的蛋白水平一致。检测不同的蛋白浓度或者细胞数目保证荧光信号在线性范围内，空白样品作为背景信号。小鼠行为学实验小鼠在复旦大学实验动物中心spf级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12小时光暗循环。20周龄的c57品系的app/ps1小鼠，随机分成对照组和给药组，每组8只。实验期间，腹腔注射醋酸棉酚15mg/kg。每两天给药一次，给药持续10周。给药结束后，到小动物实验平台对小鼠进行行为学测试，包括旷场测试以及新旧物体识别测试。实验结束后，数据分析处理。小鼠购于北京中科泽晟公司。图1注释：对vcp酶活性抑制效率较高的9个化合物的抑制效率。其中醋酸棉酚对vcp酶活性的抑制效率达到80%-90%。9个化合物的抑制效率分别为：醋酸棉酚88.99%，丹酚酸a87.61%，杨梅素79.14%，棉酚78.79%，蟛蜞菊内酯78.79%，黄芩素73.74%，丹酚酸c73.64%，儿茶素没食子酸盐72.5%，根皮素70%。。序列表<110>复旦大学<120>醋酸棉酚在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用<130>001<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>70<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1taagaaggagatataccatggattacaaggatgacgatgacaagagccagatggcttctg60gagccgattc70<210>2<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttgtcgacggagctcgaattcttagccatacaggtcatcatcattg46<210>3<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3acgataaggtacctaggatccatggcttctggagccgattc41<210>4<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgctggatatctgcagaattcttagccatacaggtcatcatcattg46<210>5<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cagcaaatgggtcgcggatccatggcttctggagccgattc41<210>6<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ttgtcgacggagctcgaattcctgatgggttactctggctcaagg45<210>7<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cagcaaatgggtcgcggatccatggcttctggagccgattc41<210>8<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ttgtcgacggagctcgaattcctccccttcgcagtggatc40<210>9<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cagcaaatgggtcgcggatccggcctagaggatgtcaaacgtg43<210>10<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttgtcgacggagctcgaattcttagccatacaggtcatcatcattg46<210>11<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cagcaaatgggtcgcggatcctgcaggaagcagctagctcag42<210>12<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ttgtcgacggagctcgaattctgatgggttactctggctcaagg44<210>13<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13acagcaaatgggtcgggatcccctatcaaacgagaggatgagga44<210>14<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ttgtcgacggagctcgaattcttagccatacaggtcatcatcattg46<210>15<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ttccaggggcccctgggatccatggcggcggagcgacag39<210>16<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ctcgagtcgacccgggaattcttatgttaaccgctgcacgatg43当前第1页12当前第1页12