本发明属于医药技术领域，具体涉及2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸在抑制蛋白糖基化、神经细胞保护和防治神经退行性疾病药物中的应用。
背景技术：
神经退行性疾病(neurodegenerativedisease)是一类慢性神经元进行性病变，是一种由大脑和脊髓神经元丧失而导致的疾病状态。大脑和脊髓神经元一般不会再生，所以这些神经元的过度损害可能导致毁灭性的、不可逆转的病变。神经退行性疾主要包括：老年痴呆症(阿尔茨海默病alzheimer’sdiseasead)，帕金森病(parkinson’sdiseasepd)，亨廷顿病(huntington’sdiseasehd)以及可传播性海绵样脑病(creutzfeldt-jakob’sdiseasecjd)等。
随着我国人口老龄化的加剧，神经退行性疾病患病率逐渐提高，为病人和家属带来极大痛苦；不仅使患者的生活质量严重下降，而且患者的药物治疗费用和护理费给社会带来了沉重的负担。虽然目前有一些治疗神经退行性疾病的药物，但是治疗效果不好，只能在一定程度缓解神经退行性疾病的进一步恶化，不能从根本上治疗这些疾病，使病人损伤的神经元恢复到正常水平。因此亟待开发有效防治神经退行性疾病的药物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能够有效防治神经退行性疾病的化合物，及其在防治神经退行性疾病药物中的应用。
为实现上述目的，本发明提供一种2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸在抑制蛋白糖基化、神经细胞保护和防治神经退行性疾病药物中的应用，用于防治衰老和退行性疾病，如老年痴呆症，帕金森病等。本发明的2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸可单独，也可与其他的药物搭配使用以防治神经退行性疾病。
较佳地，所述2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸中单糖基为葡萄糖基、半乳糖基、山梨糖基、甘露糖基、鼠李糖基、阿拉伯糖基、岩藻糖基、来苏糖基、核糖基、木糖基中的一种。
较佳地，所述2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸的制备方法包括：
(1)3-o-苄基-5,6-o-异丙叉基抗坏血酸与四乙酰基溴代单糖发生糖苷化反应得到2-o-β-d-四乙酰单糖基-3-o-苄基-l-抗坏血酸；
(2)依次在催化氢化条件下脱除苄基、乙酸水溶液中脱除异丙叉基、碳酸钾脱除乙酰基；
(3)用酸性阳离子交换树脂酸分离纯化得到所述2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸。
较佳地，所述2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸为2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸，所述2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的化学式为：
较佳地，所述2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸来源于枸杞提取物。
本发明还提供一种防治神经退行性疾病药物，包括2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-半乳糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-山梨糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-甘露糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-鼠李糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-阿拉伯糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-岩藻糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-来苏糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-核糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-木糖基-l-抗坏血酸中的一种或多种。
本发明提供的2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸对age诱导的神经细胞凋亡具有明显的抑制作用，对受损的神经细胞具有一定的保护作用，可作为预防和治疗神经退行性疾病的药物开发应用。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
本发明提供的2-o-β-d-单糖基-l-抗坏血酸中单糖基为葡萄糖基、半乳糖基、山梨糖基、甘露糖基、鼠李糖基、阿拉伯糖基、岩藻糖基、来苏糖基、核糖基、木糖基中的一种。接下来以2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸为例，具体说明2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法及其在抑制蛋白糖基化和神经细胞保护中的应用。2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸可从枸杞干果中提取，或通过化学方法合成，其余的单糖基合成方法可参照2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸。
实施例1：富含2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的枸杞提取制备
枸杞粉末，按固液比1：15加入80％乙醇，加热回流提取1h，离心去除残渣，上清低温旋转蒸发至干，再加5倍量水溶解，离心取上清，真空浓缩、干燥，得枸杞提取物，hplc测定2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸含量为3.2％。
实施例2：2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的合成
(1)3-o-苄基-5,6-o-异丙叉基抗坏血酸与四乙酰基溴代葡萄糖发生糖苷化反应得到2-o-β-d-四乙酰葡萄糖基-3-o-苄基-l-抗坏血酸
a、四乙酰基溴代葡萄糖的制备
将15gd-葡萄糖溶解在100ml的乙酸酐中，然后加入碘单质423mg，常温下搅拌反应8h。反应完后加入硫代硫酸钠饱和溶液20ml，再小心加入碳酸氢钠150ml中和反应中的酸。二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗后合并有机相，无水硫酸钠干燥30min后旋干有机溶剂，得产物，无需纯化直接做下一步。
将上一步旋干溶剂得到的乙酰基保护的产物在低压下抽干溶剂后，溶解在150ml干燥的二氯甲烷溶液中，氮气保护，0℃条件下搅拌15min。用注射器缓慢往反应中加入氢溴酸(33％乙酸溶液)37ml，0℃条件下继续搅拌1h后，升到常温，搅拌反应12h。反应结束后，加入120ml碳酸氢钠饱和溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗两次(100mlx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后得到粗产物。最后用硅胶色谱柱分离纯化得到白色固体产物a。
b、3-o-苄基-5,6-o-异丙叉基抗坏血酸的制备
将22gl-抗坏血酸溶解在200ml的丙酮中，然后加入乙酰氯8.8ml，常温下搅拌反应3h，生成白色固体从溶液中析出。反应完后，将反应瓶放入-20℃冰箱中冷冻5h。5h后拿出，立即过滤产物，用冷的正己烷(200mmol)和丙酮(100mmol)依次滤洗后得白色絮状固体产物。
将上一步所得到的白色絮状固体产物溶解在200ml的二甲基亚砜(dmso)溶液中，随后加入碳酸钾固体15.5g，常温条件下搅拌5min。然后缓慢加入溴化苄8.2ml，在50℃条件下搅拌4h。反应结束后，加入80ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后得到粗产物。最后用硅胶色谱柱分离纯化得到白色固体产物b。
c、2-o-β-d-四乙酰葡萄糖基-3-o-苄基-5,6-o-异丙叉基抗坏血酸的将白色固体产物a9g溶解在100ml氯仿(chcl3)溶液中，随后加入碳酸钾水溶液50ml，常温条件下搅拌5min。然后依次加入苄基三乙基氯化铵(tebac)4.0g和白色固体产物b4.5g，反应先在常温下搅拌30min，然后升到50℃条件下搅拌反应13h。反应结束后，加入50ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗两次(50ml×2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后得到粗产物。最后用硅胶色谱柱分离纯化得到白色固体产物c。
(2)2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备
依次在催化氢化条件下脱除苄基、乙酸水溶液中脱除异丙叉基、碳酸钾脱除乙酰基。
将白色固体产物c4.2g溶解在50ml乙酸乙酯溶液中，随后加入钯碳固体(1％w/w)，接上氢气球，置换空气两次，常温条件下搅拌1h。反应结束后，用硅胶滤掉钯碳，旋干溶剂得脱苄基保护产物。
上述旋干的产物瓶中依次加入乙酸50ml和水50ml。50℃条件下搅拌反应4h。反应结束后取出搅拌子，直接旋干溶剂，得粗产物。产物瓶中再加入少量乙酸乙酯，80℃加热条件下，逐步加入更多的乙酸乙酯，直至固体物全部溶解。然后关闭加热，加入10ml左右的正己烷，即有少量白色固体物析出。溶液自然降到常温，产物大部分析出，过滤得脱异丙叉基白色晶体产物。
上面的白色晶体抽干后得固体，加入甲醇溶液50ml搅拌溶解，再加入碳酸钾水溶液5ml，常温下搅拌反应4h后。
(3)用酸性阳离子交换树脂酸分离纯化得到所述2-o-β-d-葡糖糖基-l-抗坏血酸
加入活化的阳离子树脂(ir-120,h+)中和反应中的碱，最后滤掉树脂，得产物的甲醇溶液，旋干溶剂后，冷冻干燥得白色固体产物2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-2βg)。2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的化学式为：
利用化学合成知识，应用类似方法还可分别制备3-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-3βg)和4-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-4βg)。
实施例3：2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸在抑制蛋白糖基化中的应用
糖基化终末产物(ages)是蛋白质、脂肪酸和核酸等大分子物质的非酶糖基化产物，目前研究表明ages可直接或与其受体相互作用加速人体的衰老和导致糖尿病、阿尔茨海默病(ad)、动脉粥样硬化(as)等慢性退化性疾病的发生和发展。本实施例中以2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸在抑制晚期糖基化终产物(age)形成中的应用为例。
牛血清蛋白-葡萄糖(bsa-glucose)模拟体系的建立参照文献方法[胡徽祥，等.中国食品学报，2013，13：15-20]。用pbs缓冲液(0.2mol/l，ph7.2)溶解牛血清蛋白(bsa)和葡萄糖，使其浓度分别为10mg/ml，300mmol/l，加入终质量分数为0.02％的叠氮化钠。试验组包括2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(浓度梯度依次为25、50、100μg/ml)和枸杞提取物(浓度梯度依次为25、50、100mg/ml)，以未添加受试样品的为空白对照组。将各反应液用微孔滤膜(0.45μm)过滤后于无菌条件下分装试管(5ml)中，置70℃下恒温反应60h。根据ages荧光特性，采用荧光分光光法测定ages的荧光强度，测定条件为激发波长370nm，发射波长440nm，分别测定反应体系培养60h的荧光强度，以荧光强度au表示ages含量。按下列公式计算受试物对ages形成的抑制率。
抑制率(％)＝(f0-f1)/f1×100％
式中，f0—空白对照组的荧光强度；f1—试验组的荧光强度。
结果表明：2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸和枸杞提取物均有不同程度抑制晚期糖基化终产物(age)形成作用，见下表：
实施例4：2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸在神经细胞保护中的应用
2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸等抗坏血酸类似物对age诱导pc12细胞损伤的保护作用。
1)细胞及培养
pc12细胞以10％胎牛血清和10％马血清的dmem为培养基，再加入谷氨酸钠2mmol·l-1，链霉素和青霉素各100μl，于37℃，5％co2饱和二氧化碳细胞培养箱中培养。pc12细胞每隔三天进行传代培养，实验所用的细胞存活率均在95％以上。
2)实验分组及处理
pc12细胞的初始溶度为1×109cell·l-1。实验分组如下:(1)age处理组:在培养体系中分别加入0-300mg·l-1age，未给予aa-2βg处理；(2)aa-2βg预处理组：先加入0.5mmol·l-1aa-2βg，预处理24h后，再加入不同浓度的age；(3)枸杞提取物预处理组：先加入100mg枸杞提取物，预处理24h后，再加入不同浓度的age。细胞继续培养24h后弃去培养液，用预冷的0.01mol·l-1磷酸缓冲液清洗，0.25％的胰蛋白酶消化1min，洗涤后备用。各组设3个平行对照，mtt检测结果。
aa-2βg预处理对age诱导的pc12细胞凋亡的影响见下表：
如表中所示，经过aa-2βg和枸杞提取物预处理过后，pc12细胞的凋亡率有明显下降，提示aa-2βg对age诱导的pc12细胞凋亡有明显的保护作用。
在本发明中，2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-2βg)对age诱导的神经细胞凋亡具有明显的抑制作用，对受损的神经细胞具有一定的保护作用，含2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的枸杞提取物有同样作用，可作为预防和治疗神经退行性疾病的药物开发应用。另外，2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸是作为食品的枸杞中的提取成分，安全性高，应用前景十分广阔。
其余的单糖基合成方法可参照2-o-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸。具体可参照实施例2方法，将葡萄糖分别替换为半乳糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、来苏糖、核糖和木糖等，则可分别获得相应的2-o-β-d-半乳糖基-l-抗坏血酸(aa-2βgal)、2-o-β-d-山梨糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-甘露糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-鼠李糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-阿拉伯糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-岩藻糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-来苏糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-核糖基-l-抗坏血酸、2-o-β-d-木糖基-l-抗坏血酸等。且这些物质对age诱导的神经细胞凋亡具有明显的抑制作用，对受损的神经细胞具有一定的保护作用，可作为预防和治疗神经退行性疾病的药物开发应用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。