一种木兰脂素和SB590885联合组合物制备抗肝癌的药物的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种木兰脂素和sb590885联合组合物制备抗肝癌的药物及应用。

背景技术：

癌症，随着其发病率和死亡率的上升，是导致死亡的主要原因，已成为全球关注的问题。其中肝细胞癌是世界第五大常见肿瘤，第二大肿瘤相关死亡原因。传统治疗方法主要有：手术、放疗、化疗、肝移植等。虽然已有研究报道了肝细胞癌的分子表征，但是肝细胞癌的晚期诊断预后仍然很差。到目前为止，fda批准的抗肝癌药物极少，仅见索拉非尼(2007年)和瑞戈非尼(2017年)，而且临床疗效仍很有限，目前肝癌患者5年生存率不到20％。

另外，随着药物治疗期的延长，临床耐药性的也发展为常态，单药治疗已受限。因此，采用联合用药抑制肿瘤生长在临床上具有重要意义。联合用药能更有效地抑制癌症，从而更有效地治疗癌症患者。

从肿瘤细胞信号通路的角度上讲，当一种药物长期抑制某一信号通路的靶点蛋白后，肿瘤细胞可能会通过调节增强其它促进生长信号通路，使药物的疗效降低。如：raf/mek/erk信号通路上的某一靶点蛋白被抑制后，肿瘤细胞常常会调节pi3k/akt/mtor信号通路的增强，降低药效。因此，在抑制raf/mek/erk信号通路时，如果能同时抑制pi3k/akt/mtor信号通路的激活，有可能取得非常好的联用效果。

但是肿瘤发生发展的内在机制非常复杂，信号通路的强弱调节仅是抑制或促进肿瘤细胞生长的因素之一。简单的选用具有抑制raf/mek/erk信号通路和pi3k/akt/mtor信号通路的药物，几乎很难达到预期目的。因此，需要做大量的筛选实验，才能发现具有联合增效潜力的药物组合。另外，不同药物之间的用药比例选择，也是联合用药是否有成效的关键因素之一，同样需要大量的实验摸索。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有治疗药物的缺陷和不足，特别是针对与肝癌有效药物不多的现状，提供一种癌症治疗的药物组合物，该药物组合为木兰脂素和sb590885，能够显著提高sb590885治疗癌症的效果，尤其是治疗肝癌的效果。

本发明的第一个目的在于提供木兰脂素和sb590885联用在制备癌症治疗药物方面的应用。

本发明的第二个目的是提供一种包含木兰脂素和sb590885的治疗癌症的药物。

木兰脂素和sb590885联用在制备癌症治疗药物方面的应用。

优选地，所述癌症为肝癌。

木兰脂素和sb590885联用在制备抑制癌细胞的药物方面的应用。

优选地，所述癌细胞为肝癌细胞。

优选地，上述抑制癌细胞的药物为抑制癌细胞的生长的药物。

更优选地，所述肝癌细胞为肝癌细胞种bel-7402、sk-hep-1。

的治疗癌症的药物。

一种癌症治疗药物，所述药物包含木兰脂素和sb590885。

优选地，所述癌症为肝癌。

优选地，所述木兰脂素和sb590885的摩尔比为：木兰脂素25～125份，sb5908853～15份。

更优选地，所述木兰脂素和sb590885的摩尔比为：125:15。

更优选地，所述药物是抑制肝癌细胞生长。

为了寻找能够产生协同抗癌作用的药物组合。我们通过文献检索和研读，调研并购买了对raf/mek/erk信号通路有抑制作用报道的化合物共15个；以及对pi3k/akt/mtor信号通路有抑制作用报道的化合物共17个。

利用购买到的化合物设置了32个单药组，每个单药组包含至少5个浓度，作为对照实验；利用这些化合物设计了15×17＝255种药物联合配对方式，每种配对方式包含至少5种浓度组合。

以肝癌bel-7402细胞株为测试细胞株，利用cck-8法检测各种单药、药物组合抑制细胞增殖的效果。经过长期大量的筛选实验和分析研究后发现，其中的一个配对组合能够产生协同作用，显著增强抗癌效率。这对组合药物为：木兰脂素与sb590885。

木兰脂素，英文名称：magnolin，cas为31008-18-1，分子式c23h28o7，分子量416.47,结构式为：

sb590885，cas405554-55-4，分子式c27h27n5o2，分子量453.54，

结构式为：

紧接着，我们对木兰脂素与sb590885联合抑制肝癌bel-7402细胞进行了3次重复实验，三次实验均发现两种药物的确能够产生协同作用，显著增强抗癌效率。

进一步地，我们又在肝癌sk-hep-1细胞株上，对木兰脂素和sb590885联合方案进行了进一步验证，三次重复实验均发现木兰脂素与sb590885对肝癌sk-hep-1细胞的增殖，的确能够产生协同作用，显著增强抗癌效率。

除了增殖实验以外，我们还开展了克隆形成实验。实验结果显示：木兰脂素和sb590885两者单用时对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用不明显；但当木兰脂素与sb590885联用后肿瘤细胞的克隆形成率大大低于木兰脂素和sb590885单独使用，协同效果良好。

细胞凋亡实验也是评价药物疗效的指标之一。接下来我们又利用流式细胞凋亡检测的方法，检测了木兰脂素和sb590885联合用药对肝癌细胞凋亡的影响，结果发现木兰脂素与sb590885联用组的细胞凋亡率明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，协同诱发凋亡的效果良好。

为了确认流式细胞凋亡的检测结果，我们从细胞凋亡关键蛋白表达变化的角度进一步进行了确认。实验结果表明：相比于木兰脂素或sb590885单独用药，联合用药能明显降低抗凋亡蛋白bcl2的表达量，增加促凋亡蛋白bax的表达量；以及上调c-caspase-9和c-parp的表达量(注：c-caspase-9和c-parp为细胞发生凋亡的标志蛋白)。为了确定木兰脂素和sb590885联合增效的分子机制是否与我们的猜想一致，即该配对组合能同时协同抑制b-raf/erk/mapk和pi3k/akt/mtor两条信号通路。我们利用westernblot技术对这两条信号通路开展了蛋白水平的机制研究。

首先，我们开展了木兰脂素和sb590885联合用药调控b-raf/erk/mapk通路实验。实验结果显示，相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组的确能够显著抑制肝癌细胞mek和erk蛋白的磷酸化水平。具体表现为：在联合用药组中p-mek和p-erk两个蛋白的表达量明显低于单药组。该结果表明，木兰脂素和sb590885联合增效的机制之一是通过增强对b-raf/erk/mapk信号通路的抑制作用来实现的。

接下来，我们开展了木兰脂素和sb590885联合用药调控pi3k/akt/mtor信号通路的实验。实验结果显示，相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组能够显著抑制肝癌细胞akt和其下游蛋白p70s6k、s6的磷酸化水平。具体表现为：在联合用药组中p-akt，p-p70s6k，p-s6三个蛋白的表达量明显低于单药组。这些结果表明，木兰脂素和sb590885联合增效的机制之二是通过增强对pi3k/akt/mtor信号通路的抑制作用来实现的。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明联用药物可以显著提升抑制肝癌细胞生长的效果；而且抑制效果明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，且疗效明确，机制清楚，说明二者在本发明特定配比下配合实验后具有协同增效的作用，有很好的临床应用前景。

此外，由于木兰脂素是来源于中药辛夷的天然产物，毒性非常小，与sb590885联用时可以大大减少sb590885使用量，降低sb590885毒副作用，提高治疗安全指数。这种联用方案显示出协同增效的效果，具有弥补单药治疗的缺陷与不足，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1是bel-7402、sk-hep-1肝癌细胞经不同组处理后细胞增殖和细胞克隆形成结果。

图2是bel-7402、sk-hep-1肝癌细胞经不同组处理后流式细胞术检测细胞凋亡和westernblot实验检测细胞凋亡标志性蛋白结果。

图3是bel-7402、sk-hep-1肝癌细胞经不同组处理后westernblot实验检测raf/mek/erk信号通路关键蛋白结果。

图4是bel-7402、sk-hep-1肝癌细胞经不同组处理后westernblot实验检测pi3k/akt/mtor信号通路关键蛋白结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定，除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规试剂、设备和方法。

除非特别说明，本发明所用材料和试剂均为市售品。

实施例1木兰脂素和sb590885联合用药对肝癌bel-7402细胞生长的影响

本实施例共分为4组，对照组(不加药)，木兰脂素组(浓度：100μm)，sb590885组(浓度：12μm)，木兰脂素与sb590885联用组(浓度分别为100μm，12μm)。

细胞增殖采用cck-8法检测。将bel-7402细胞接种于96孔板中，接种密度为7×10³个，用含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基培养。37℃、5％co2环境下培养24h后，弃培养液，加入含药培养基，继续培养48h后，每孔加入10μlcck-8试剂，37℃孵育2h，用酶标仪检测450nm处的吸光度，并计算细胞存活率。

结果如图1a所示：木兰脂素组细胞的存活率为90％左右，sb590885组细胞的存活率为75％左右,两者单用对肝癌bel-7402细胞的抑制作用不明显。但当木兰脂素与sb590885联用后肝癌bel-7402细胞的存活率只有25％左右，明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，协同效果良好。

克隆形成实验。将bel-7402细胞接种于6孔板中，37℃、5％co2环境下培养10天后，用结晶紫染色液染色，显微镜下观察并计数。实施例结果如图1c所示：木兰脂素组的克隆形成率为95％左右，sb590885组细胞的克隆形成率为80％左右,两者单用对肝癌bel-7402细胞克隆形成的抑制作用不明显；但当木兰脂素与sb590885联用后肝癌bel-7402细胞的克隆形成率只有10％左右，明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，协同效果良好。

流式细胞凋亡实验。利用流式细胞凋亡检测的方法，检测了木兰脂素和sb590885联合用药对肝癌bel-7402细胞凋亡的影响，结果发现，如图2c和图2d所示：对照组的细胞凋亡率在5％左右，木兰脂素组的细胞凋亡率在7％左右，sb590885组的细胞凋亡率在10％左右，木兰脂素与sb590885联用组的细胞凋亡率在14％左右。将对照组的5％的凋亡率考虑计入后，发现相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，协同诱发凋亡的效果良好。

细胞凋亡关键蛋白实验。为了确定两种药物的确能诱发肝癌bel-7402细胞发生凋亡，我们采用westernblot法检测了与细胞凋亡相关的几个蛋白(bcl2，bax，c-parp，c-caspase-9)的表达变化情况，如图2a所示：相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组能明显降低抗凋亡蛋白bcl2的表达量，增加促凋亡蛋白bax的表达量。上调c-caspase-9和c-parp的表达量，c-caspase-9和c-parp的表达上调为细胞发生凋亡的标志蛋白。

为了确定木兰脂素和sb590885联合增效的分子机制是否与我们前期的猜想一致。即该配对组合能同时协同抑制肝癌bel-7402细胞中b-raf/erk/mapk和pi3k/akt/mtor两条信号通路。我们继续开展了如下实验。

木兰脂素和sb590885联合用药调控b-raferk/mapk通路实验。为了确定其协同增效的分子机制，我们研究了在肝癌bel-7402细胞中，木兰脂素和sb590885联合用药对b-raf/erk/mapk信号通路的影响。如图3a所示，相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组能够显著抑制bel-7402细胞mek和erk蛋白的磷酸化水平。具体表现为：在联合组中p-mek和p-erk两个蛋白的表达量明显低于单药组。这些结果表明，木兰脂素和sb590885联合增效的机制之一是通过协同增强对b-raf/erk/mapk信号通路的抑制作用来实现的。木兰脂素和sb590885联合用药调控pi3k/akt/mtor通路实验。为了进一步确定其协同增效的分子机制，我们研究了在肝癌bel-7402细胞中，木兰脂素和sb590885联合用药对pi3k/akt/mtor信号通路的影响。如图4a所示，相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组能够显著抑制bel-7402细胞akt和其下游蛋白p70s6k、s6的磷酸化水平。具体表现为：在联合组中p-akt，p-p70s6k，p-s6三个蛋白的表达量明显低于单药组。这些结果表明，木兰脂素和sb590885联合增效的机制之二是通过协同增强对pi3k/akt/mtor信号通路的抑制作用来实现的。

综上，本案例的研究结果发现：木兰脂素和sb590885联合用药能显著提升抑制肝癌bel-7402细胞生长；而且抑制效果明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，且疗效明确，机制清楚，说明二者在本发明特定配比下配合实验后具有协同增效的作用，有很好的临床应用前景。

实施例2木兰脂素和sb590885联合用药对肝癌sk-hep-1细胞生长的影响

本实施例共分为4组，对照组(不加药)，木兰脂素组(浓度：100μm)，sb590885组(浓度：12μm)，木兰脂素与sb590885联用组(浓度分别为100μm，12μm)。

细胞增殖采用cck-8法检测。将肝癌sk-hep-1细胞接种于96孔板中，接种密度为7×10³个，用含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基培养。37℃、5％co2环境下培养24h后，弃培养液，加入含药培养基，继续培养48h后，每孔加入10μlcck-8试剂，37℃孵育2h，用酶标仪检测450nm处的吸光度，并计算细胞存活率。

结果如图1b所示：木兰脂素组细胞的存活率为75％左右，sb590885组细胞的存活率为80％左右,两者单用对细胞的抑制作用不明显。但当木兰脂素与sb590885联用后肝癌sk-hep1细胞的存活率只有20％左右，明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，协同效果良好。克隆形成实验。将肝癌sk-hep-1细胞接种于6孔板中，37℃、5％co2环境下培养10天后，用结晶紫染色液染色，显微镜下观察并计数。实施例结果如图1d所示：木兰脂素组的克隆形成率为85％左右，sb590885组细胞的克隆形成率为70％左右,两者单用对肝癌sk-hep-1细胞克隆形成的抑制作用不明显；但当木兰脂素与sb590885联用后肿瘤细胞的克隆形成率只有5％左右，明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，协同效果良好。

流式细胞凋亡实验。利用流式细胞凋亡检测的方法，检测了木兰脂素和sb590885联合用药对肝癌sk-hep-1细胞凋亡的影响，结果发现，如图2c和图2d所示：对照组的细胞凋亡率在4％左右，木兰脂素组的细胞凋亡率在3％左右，sb590885组的细胞凋亡率在9％左右，木兰脂素与sb590885联用组的细胞凋亡率在14％左右。将对照组4％的凋亡率考虑计入后，发现相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，协同诱发凋亡的效果良好。

细胞凋亡关键蛋白实验。为了确定两种药物的确能诱发肝癌sk-hep-1细胞发生凋亡，我们采用westernblot法检测了与细胞凋亡相关的几个蛋白(bcl2，bax，c-parp，c-caspase-9)的表达变化情况。如图2b所示：相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组能明显降低抗凋亡蛋白bcl2的表达量，增加促凋亡蛋白bax的表达量。上调c-caspase-9和c-parp的表达量，c-caspase-9和c-parp的表达上调为细胞发生凋亡的标志蛋白。

为了确定木兰脂素和sb590885联合增效的分子机制是否与我们前期的猜想一致。即该配对组合能同时协同抑制肝癌sk-hep-1细胞中b-raf/erk/mapk和pi3k/akt/mtor两条信号通路。我们继续开展了如下实验。

木兰脂素和sb590885联合用药调控b-raf/erk/mapk通路实验。为了确定其协同增效的分子机制，我们研究了在肝癌sk-hep-1细胞中，木兰脂素和sb590885联合用药对b-raf/erk/mapk信号通路的影响。如图3b所示，相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组能够显著抑制肝癌sk-hep-1细胞mek和erk蛋白的磷酸化水平。具体表现为：在联合组中p-mek和p-erk两个蛋白的表达量明显低于单药组。这些结果表明，木兰脂素和sb590885联合增效的机制之一是通过协同增强对b-raf/erk/mapk信号通路的抑制作用来实现的。

木兰脂素和sb590885联合用药调控pi3k/akt/mtor通路实验。为了进一步确定其协同增效的分子机制，我们研究了在肝癌sk-hep-1细胞中，木兰脂素和sb590885联合用药对pi3k/akt/mtor信号通路的影响。如图4b所示，相比于木兰脂素和sb590885单药组，联合用药组能够显著抑制肝癌sk-hep-1细胞akt和其下游蛋白p70s6k、s6的磷酸化水平。具体表现为：在联合组中p-akt，p-p70s6k，p-s6三个蛋白的表达量明显低于单药组。这些结果表明，木兰脂素和sb590885联合增效的机制之二是通过协同增强对pi3k/akt/mtor信号通路的抑制作用来实现的。

综上，本案例的研究结果发现：木兰脂素和sb590885联合用药能显著提升抑制肝癌sk-hep-1细胞生长；而且抑制效果明显优于木兰脂素和sb590885单独使用，且疗效明确，机制清楚，说明二者在本发明特定配比下配合实验后具有协同增效的作用，有很好的临床应用前景。