一种食源性益生菌胞内荧光标记方法及其体内应用与流程

本发明属于食源性益生菌的研究领域，涉及一种食源性益生菌胞内荧光标记方法及其体内应用。

背景技术：

联合国粮农组织和世界卫生组织指出益生菌是一类活的微生物，当以一定数量摄入益生菌后，对宿主健康产生有益影响。研究表明，益生菌可抵御病原菌侵入，抑制病原菌繁殖，改善肠上皮细胞屏障功能、维持胃肠道内环境稳态，重建肠道菌群稳定。益生菌发挥益生作用主要通过产生优势菌群、生物夺氧和生物拮抗，且通过产生有益物质和抗菌物质(如有机酸、过氧化氢和细菌素等)来调节宿主机体免疫功能。研究表明通过益生菌来调节胃肠道菌群首先通过在胃肠道粘膜表面和表皮细胞的粘附和定植，这样阻止了病原菌在肠道中的定植和增长，常见的可作为益生菌的菌株有双歧杆菌(如长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌)、乳酸菌(嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌)、芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)、酵母菌(酿酒酵母)等。

传统的监测益生菌在动物胃肠道定植及饲喂益生菌在胃肠道存活情况的方法主要是通过采集粪便样品进行分析益生菌数量，或是通过在不同时间点宰杀实验动物，解剖动物胃肠道器官，对胃肠道部位内容物进行益生菌计数。然而粪便中益生菌的数量并不能真正反映该菌在动物胃肠道中的真正细菌增殖数，而且通过解剖动物的方法也不能动态监测整个动物体内胃肠道益生菌移动和数量的变化和发展。而且最重要的一点是，粪便中益生菌数量的检测无法辨别此菌是由动物饲喂摄入的还是来自于宿主本身胃肠道微生物定植的益生菌。而且对于益生菌发挥益生作用的机制还不清楚，摄入后在胃肠道中如何粘附和定植，其在体内的菌群数量变化规律是什么，是否增殖为优势菌群，在胃肠道各个不同肠段部位中的分布情况是什么，而且又对肠道内微生态产生怎么样的影响，随着时间的变化有着怎么样的规律，是否会在肠道内膜和上皮细胞上粘附和定植，是否进入小肠固有层和肠系膜淋巴结等，这些相关问题微生物学家一直以来在不断地探讨和研究，尚未得到解答。

随着现代分析技术的发展，光学成像已成为对活体进行实时监测的重要手段，生物发光作为光学成像的一种，该发光反应的本质是酶促反应，在一定条件下，荧光素酶催化荧光素反应，并发出可见光，发射光波可被高度敏感的电荷耦合ccd相机所检测在，该技术已被广泛应用于示踪干酪乳杆菌，植物乳杆菌，乳酸乳球菌等益生菌。荧光蛋白也是光学成像的一种，通过不同颜色的荧光蛋白标记益生菌达到示踪目的。但是这两种方法仍存在灵敏度低，发射波长短等问题，应用于体内成像有一定的局限性。

长余辉纳米发光材料(persistentluminescentnanophosphors，plnps)是一种被高能激发(可见光、紫外光、x射线、γ射线、电子束等)后可产生可见或者近红外区域长时间发光的特殊纳米材料。相比于传统的纳米发光材料，plnps作为生物成像造影剂具备以下优点：(1)长余辉发光纳米材料毒性较低，表面修饰之后更适用于活体生物的体内研究；(2)长余辉纳米材料的光化学稳定性较好，可以避免光漂白现象的发生；(3)长余辉纳米材料可以体外激发进行光学成像，这样可以有效的避免生物体的自发光和激发光源的背景光对成像效果的影响；(4)长余辉纳米材料的发光可以通过改变合成条件和元素组成调控至近红外区域，能够增加检测光的生物组织穿透，提高光学成像的灵敏度。纵观所有潜在的荧光探针，只有近红外长余辉发光材料能够很好的满足现代光学生物成像的需要。因此，借助长余辉纳米探针对益生菌进行荧光标记，即可通过生物成像实现对益生菌在生物体内的代谢分布状况进行实时监控，为食品营养与健康研究开拓新的研究理念。

技术实现要素：

通过光学生物成像技术将具有近红外(nir)发光的cr³⁺掺杂的镓锗酸锌长余辉纳米粒子(zggoplnps)作为光学探针引入食源性益生菌在生物体内分布的研究中。采用的cr³⁺掺杂的镓锗酸锌长余辉纳米粒子具有优异的余辉性能、低毒、良好的分散性、光学稳定性和生物相容性，能够作为一种示踪剂通过特定序列的dna包覆，电转至益生菌，对目标益生菌进行标记，标记后菌体的活力仍能够保持在80％以上，达到对益生菌的长期可视化监测。通过口服进入小鼠体内后，借助长余辉体外激发的光学生物成像技术，实时的研究标记后菌体在机体胃肠道内的吸收和分布状况。dna包覆的zggo:cr³⁺纳米探针能够有效且成功的标记益生菌，并用于实时的、非损伤的监测摄入有机体的益生菌的生物分布状况。

本发明提供的具体技术方案是：

一种食源性益生菌胞内荧光标记方法，包括如下步骤：

(a)通过dna修饰长余辉纳米发光材料；

(b)制备益生菌感受态；

(c)将dna包覆的纳米荧光探针电转至益生菌；

(d)口服进入小鼠体内成像。

进一步，所述步骤(a)通过dna修饰长余辉纳米发光材料的过程如下：

(1)dna与10mlpbs混合；

(2)轻轻搅拌步骤(1)中的混合液，并加入edc和nhs；

(3)步骤(2)所述的混合液在室温条件下反应；

(4)向步骤(3)的混合液中加入长余辉纳米探针(zggoplnps)，

混合液反应30min；

(5)用pbs清洗步骤(4)的溶液，并避光保存。

进一步，所述步骤(1)中添加dna的量为40mg；

进一步，所述步骤(2)中添加edc和nhs的量均为40mg；

进一步，所述步骤(3)的反应时间为30min；

进一步，所述步骤(4)中添加的长余辉纳米探针的量为10mg。

进一步，所述步骤(b)制备益生菌感受态的过程如下：

(1)过夜培养益生菌；

(2)转接25ml过夜培养的益生菌至100ml含甘氨酸的mrs培养基中。

(3)培养至对数期(od600＝0.6)；

(4)5℃，使用3000g离心力，离心5min，收集菌体，冰上放置10min；

(5)用预冷的10mmmgcl2清洗一次；

(6)用预冷的3.5mmmgcl2(包含浓度为925mm的蔗糖)溶液清洗2次；

(7)最后将处理后的益生菌重新分散在水中并分装冷冻至-80℃保存。

进一步，步骤(1)和步骤(3)所培养的温度为37℃。

进一步，所述步骤(2)mrs培养基中甘氨酸的含量为1％。

进一步，步骤(5)和步骤(6)所用的清洗液的体积是100ml。

进一步，所述步骤(c)通过转化dna包覆的纳米探针至益生菌，达到标记益生菌的过程如下：

(1)步骤(c)得到的益生菌感受态与步骤(b)得到的dna包覆的长余辉荧光纳米探针混合；

(2)将步骤(1)的混合液转到2mm电击杯中，进行电转；

(3)电转之后，加1ml的mrs培养基重悬，并放置培养箱中静置培养。

进一步，所述步骤(1)添加的益生菌和dna包覆的长余辉荧光纳米探针的量分别为60μl和40μl；

进一步，所述步骤(2)的电转条件为：电压2.5kvcm^-1，电容25μf，电阻400ω；

进一步，所述步骤(3)的培养温度和时间分别为37℃和1h。

优选的，步骤(b)所述的益生菌是乳双歧杆菌v9、罗伊氏乳杆菌或嗜酸乳杆菌。

一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法的体内应用，通过口服进入生物体内，借助长余辉纳米探针体外激发的光学生物成像技术，实时监控益生菌在体内的代谢分布过程。

本发明的应用为通过口服进入生物体内，借助长余辉体外激发的光学生物成像技术，实时监控益生菌在体内的代谢分布过程。

常规的荧光标记材料，比如有机染料、荧光蛋白、半导体量子点等，分别存在荧光稳定性差、荧光生物成像信噪比低、毒性高等缺陷，其应用性受限。本发明所制备的近红外长余辉纳米材料，具有发光效率高、荧光寿命长、毒性较低、光化学稳定性好、合成可控等优势，并且可体外激发进行光学成像，可以有效的避免生物体的自发光和激发光源的背景光对成像效果的影响，提高光学成像的灵敏度，因此非常适合用于益生菌的荧光标记，从而进一步实现益生菌在生物体内行为的实时监控和探究。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次实现了发光纳米材料用于益生菌胞内荧光标记的方法，无需复杂的荧光材料表面功能化和抗体修饰，步骤简便，成本较低，相比于表面标记具有更好的稳定性和标记重现性。

(2)本发明所开发的近红外荧光标记益生菌体内生物成像技术，可以借助菌体内部的长余辉纳米发光性质，实现原位无损的实时监控益生菌体在生物体内的代谢行为和分布状况，为食源性益生菌的功能位点及营养学提供了创新研究手段。

附图说明：

图1：镓锗酸锌长余辉纳米探针的透射电镜图

图2：dna包覆的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的生物相容性

图3：dna包覆的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的低毒性：(a)细胞毒性；图4：dna包覆的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的低毒性：(b)活体毒性图5：胞内荧光标记益生菌的透射电镜图

具体实施方式

为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。

以下实施例中所用到的材料edc、nhs、zggoplnps等都是购买的市场上的普通产品。

实施例1

一种食源性益生菌的胞内荧光标记方法

(1)制备dna包覆的长余辉荧光纳米探针。

40mgdna与10mlpbs混合轻轻搅拌并加入40mgedc和40mgnhs，搅拌均匀后，室温条件下反应30分钟，准确称量，加入10mg长余辉纳米探针(zggoplnps)，室温反应30分钟，最后用pbs清洗纯化，避光保存。

(2)制备易摄取和容纳外来dna的益生菌感受态。

37℃过夜培养益生菌，转接25ml到100ml含1％甘氨酸的mrs培养基中，培养至对数期(od600＝0.6)，4℃，使用3000g离心力，离心5min，收集菌体，冰上放置10min，用100ml预冷的10mmmgcl2清洗一次，然后用预冷的3.5mmmgcl2(包含浓度为925mm的蔗糖)溶液清洗2次，最后重悬水中并分装冷冻至-80℃保存。

(3)转化dna包覆的纳米探针至益生菌，实现对于目标益生菌的胞内荧光标记。

将60μl的益生菌感受态与40μldna包覆的长余辉荧光纳米探针混合，移到2mm电击杯中，在电压2.5kvcm^-1，电容25μf，电阻400ω的条件下进行电转，电转之后，加1ml的mrs培养基重悬，并放置培养箱中37℃静置培养1h。

(4)将标记后的益生菌液通过口服注射给小鼠，进行荧光成像实验。

实施例2

一种食源性益生菌的胞内荧光标记方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于益生菌为乳双歧杆菌v9，相应得到荧光标记的乳双歧杆菌v9。

实施例3

一种食源性益生菌的胞内荧光标记方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于益生菌为罗伊氏乳杆菌，相应得到荧光标记的罗伊氏乳杆菌。

实施例4

一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于益生菌为嗜酸乳杆菌，相应得到荧光标记的嗜酸乳杆菌。

图1为镓锗酸锌长余辉纳米粒子的透射电镜图，表明制备的荧光纳米探针具有良好的粒径均一度，尺寸在50nm左右，适合用于生物标记(a为研磨前，b为研磨后)。

图2为dna包覆的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的生物相容性考察，常见的生物大分子对其荧光性质均没有显著的影响，表明制备的荧光纳米探针具有良好的生物相容性，适合用于活体成像研究。

图3为dna包覆的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的毒性考察，纳米探针对三种细胞株均没有明显的毒性，通过小鼠对照组和实验组体重监控，证明探针也不具有显著的生物毒性，最终表明纳米探针毒性较低。

图4为荧光标记益生菌的透射电镜图，表明dna包覆的纳米荧光探针成功进入菌体内部(a为无dna包覆的荧光探针标记益生菌横切面视图；d为无dna包覆的荧光探针标记益生菌的纵切面视图；b和c为dna包覆的荧光探针标记益生菌横切面视图，e和f为dna包覆的荧光探针标记益生菌的纵切面视图)。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。