含烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷的组合物及其应用的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，具体而言，本发明提供了一种含烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷的组合物，用于抑制脂肪细胞生长和/或促进胰岛细胞活力。发明背景人体糖脂代谢紊乱引起胰岛细胞损伤及胰岛素抵抗，促进脂肪细胞生长和脂肪堆积，进而导致肥胖症、高血脂、高血糖症以及血管硬化等心血管疾病。因此，有效控制脂肪细胞繁殖、生长及胰岛细胞损伤对肥胖症、高血脂、高血糖症乃致心血管疾病乃至寿命长短有着重要的健康意义。目前市场上有数以千计的针对肥胖症、高血脂和高血糖症等的化合物和提取物及相应的药物和保健食品。β-烟酰胺单核苷酸(简称为nmn)，是辅酶i(nad+)最直接的前体。虽有报道称nmn有促进葡萄糖诱导的胰岛素分泌，然而，它却无明显促进胰岛细胞生长或抵抗胰岛细胞损伤的作用(spinnlerr.等，plosonejanuary2013，2.7)。中国专利申请cn106715455a和cn106536535a转而研究制备了烟酰胺核苷的类似物，用于治疗受益于增加nad水平的疾病，包括线粒体疾病、胰岛素抗性、代谢综合征、糖尿病和肥胖等。另外，nmn制造成本高(市场价2百元-2万元/克)，目前确认的抗衰老的起效用量大(0.6-2克/人/天)，使用成本每人每年高达数万至数百万，直接影响了推广应用。罗汉果苷(简称为mg)近年来主要是被用作蔗糖的替代品。中国专利申请cn105640971a公开了未成熟罗汉果提取物中的总皂苷在制备辅助降血糖药物方面的应用，其中，罗汉果苷ⅱ、罗汉果苷ⅲ及其组合能在体外和体内抑制α-葡萄糖苷酶活性，能够降低ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖和餐后血糖水平，降低胰岛素抵抗指数；而中国专利申请cn108201546a公开了罗汉果制剂在制备用于治疗脂肪肝药物中的应用，其中，罗汉果水提取物及罗汉果苷v(简称为mgv)可以通过降低内质网应激相关蛋白及脂肪合成相关基因的表达量，达到有效的降低肝脏甘油三酯的堆积，用于治疗脂肪肝。然而，也有报道认为，罗汉果苷通过抗氧化作用对胰岛细胞有一些保护作用，但效果甚弱，对抑制脂肪细胞生长及细胞内负调控脂肪堆积亦无明确证据(陈善源等，chinapharmacy2012,vol.23no.23)。所以，现有技术对烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷各自在抑制脂肪细胞生长和促进胰岛细胞活力等方面的效果还存在一定的争议，难以从数以千计的针对肥胖症、高血脂和高血糖症等的化合物和提取物中确定研究这两者。然而，凭借长期研究积累的经验，本发明人将nmn与mg合在一起使用，令人意外地发现了，这两者的组合物在血糖控制、保护胰岛细胞、抑制脂肪细胞生长及脂肪堆积等方面有着无法预料的协同效果。而且，本发明的组合物中可以用成本较低的mg代替相当部分的价格高昂的nmn以取得相同或相似的效果，从而显著降低了成本，更适宜推广。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于提供新的药物或保健食品组合物，用于抑制脂肪细胞生长和/或促进胰岛细胞活力。本发明还提供了该药物制剂或保健食品组合物的制备方法、相应的药物制剂或保健食品以及应用等。具体而言，在第一方面，本发明提供了药物组合物或保健食品组合物，其包含烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷。即，本发明提供了药物组合物，其包含烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷；或者，本发明提供了保健食品组合物，其包含烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷。在本文中，药物组合物指的是用于配制成药物或药品的具有医疗活性的组合物。在本文中，保健食品组合物指的是用于配制成保健食品的具有保健功能的组合物。在本发明的具体实施方式中，本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物仅以烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷为药物活性或保健活性成分，所以优选本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物由烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷组成。优选在本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物中，烟酰胺单核苷酸:罗汉果苷的摩尔量比例为1～100:0.1～1000，优选为1～10:0.1～100，更优选为1～5:1～30；例如，1～2:1～5。本发明人发现，主要是罗汉果苷中的罗汉果苷v起作用，所以优选在本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物中，罗汉果苷是罗汉果苷v。但是，本发明人发现，高罗汉果苷v含量的罗汉果提取物也基本能替代罗汉果苷v使用，从而节约成本，所以也优选在本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物中，罗汉果苷是包含罗汉果苷v的罗汉果提取物，优选所述提取物中罗汉果苷v的含量不小于30％(w/w)，更优选不小于60％(w/w)。当罗汉果苷是包含罗汉果苷v的罗汉果提取物的时候，优选罗汉果苷的提取方法包括如下步骤：(1)用水加热提取罗汉果，过滤；(2)步骤(1)获得的滤液用d101大孔树脂层析柱纯化，收集35～45％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液，浓缩；和(3)步骤(2)获得的浓缩液用ads-7大孔树脂层析柱纯化，收集25～35％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液，浓缩干燥。在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物的制备方法，其包括将烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷混合的步骤。当罗汉果苷是包含罗汉果苷v的罗汉果提取物的时候，优选本发明第二方面的制备方法包括罗汉果苷的提取方法，所述提取方法在将烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷混合的步骤之前实施。更优选在本发明第二方面的制备方法中，所述提取方法包括如下步骤：(1)用水加热提取罗汉果，过滤；(2)步骤(1)获得的滤液用d101大孔树脂层析柱纯化，收集35～45％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液，浓缩；和(3)步骤(2)获得的浓缩液用ads-7大孔树脂层析柱纯化，收集25～35％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液，浓缩干燥。在第三方面，本发明提供了药物制剂或保健食品，其包括本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物，以及药学上或食品上可接受的辅料。即，本发明提供了药物制剂，其包括本发明第一方面的药物组合物，以及药学上可接受的辅料；或者，本发明提供了保健食品，其包括本发明第一方面的保健食品组合物，以及食品上可接受的辅料。在本文中，术语“药学上可接受的辅料”包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与药物活性成分相容。运用药学上可接受的辅料制备药物制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的药物制剂包含本发明第一方面的药物组合物作为活性成分，将该组合物和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液等剂型以及各种缓释剂型，优选以口服给药形式。在本文中，术语“食品上可接受的辅料”包括食品上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、调味剂、着色剂、增香剂等，它们与食品保健活性成分相容。本发明第一方面的保健食品组合物可以直接构成食品或者食品原料，也可以加入食品或者食品原料中，例如可以涂敷其他食品的表面，也可以与其他食品混合。优选本发明第三方面的药物制剂或保健食品为奶制品、饮料、饼干或颗粒剂。其中，前三者通常为保健食品的具体食品形式，后者通常为药物制剂的具体制剂形式。在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物在制备用于降低血糖、促进胰岛细胞生长和修复、防治高血糖症、和/或防治糖尿病的药物制剂或保健食品中的应用。相应地，在第五方面，本发明提供了用于降低血糖、促进胰岛细胞生长和修复、防治高血糖症、和/或防治糖尿病的方法，其包括将本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物给予有需要的个体服用。在第六方面，本发明提供了本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物在制备用于控制脂肪堆积及体重、防治高血脂症、和/或防治心血管疾病的药物制剂或保健食品中的应用。相应地，在第七方面，本发明提供了用于控制脂肪堆积及体重、防治高血脂症、和/或防治心血管疾病的方法，其包括将本发明第一方面的药物组合物或保健食品组合物给予有需要的个体服用。在本发明的具体实施方式中，用于人体控制血糖、体重时，以烟酰胺单核苷酸计的剂量通常为100～300mg/天，远小于现有单独使用烟酰胺单核苷酸的量(500～2000mg/天)。本发明的有益效果在于，发现了nmn与mg的组合能协同增效地有利于血糖控制、保护胰岛细胞、抑制脂肪细胞生长及脂肪堆积等方面，而且用成本较低的mg代替相当部分的价格高昂的nmn以取得相同或相似的效果，从而显著降低了成本，更适宜推广。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。附图说明图1显示了四氧嘧啶细胞损伤模型的建立结果，其中，△p<0.05，△△p<0.01与阴性对照组比较。图2显示了gx999对四氧嘧啶损伤胰岛细胞存活率的影响，其中，△p<0.05，△△p<0.01与阴性对照组比较；*p<0.05，**p<0.01与四氧嘧啶损伤组比较。图3显示了gx999对四氧嘧啶的联合指数ci值，其中，1：gx9990.5mm；2：gx9991mm；3：gx9995mm；4：gx99910mm。图4显示了gx008a对四氧嘧啶损伤胰岛细胞存活率的影响，其中，△p<0.05，△△p<0.01与阴性对照组比较；*p<0.05，**p<0.01与四氧嘧啶损伤组比较。图5显示了gx008a对四氧嘧啶的联合指数ci值，其中，1：gx008a0.5mm；2：gx008a1mm；3：gx008a5mm；4：gx008a10mm。图6显示了gx9991mm联合gx008a对四氧嘧啶损伤胰岛细胞存活率的影响，其中，△p<0.05，△△p<0.01与阴性对照组比较；*p<0.05，**p<0.01与四氧嘧啶损伤组比较。图7显示了gx008a/gx999对四氧嘧啶的联合指数ci值，其中，1：gx008a0.5mm+gx9991mm；2：gx008a1mm+gx9991mm；3：gx008a5mm+gx9991mm；4：gx008a10mm+gx9991mm。图8显示了gx999对3t3l1细胞生存率的影响，其中，*p<0.05，**p<0.01与阴性对照组比较。图9显示了gx008a对3t3l1细胞生存率的影响，其中，*p<0.05，**p<0.01与阴性对照组比较。图10显示了gx008a/gx999联合对3t3l1细胞生存率的影响，其中，*p<0.05，**p<0.01与阴性对照组比较；#p<0.05，##p<0.01与10mmgx999组间比较；△p<0.05与gx008a单药组间比较。图11显示了gx008a/gx999联合指数ci值，其中，1：5mmgx008a+10mmgx999，2：10mmgx008a+10mmgx999，3：30mmgx008a+10mmgx999，4：50mmgx008a+10mmgx999。图12显示了gx999/gx008a对3t3l1细胞分化的影响。图13显示了gx008a/gx999对3t3l1细胞分化的影响，其中，*p<0.05，**p<0.01与分化组比较；△p<0.05与gx999/gx008a单用组间比较。具体实施方式以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参考相应仪器和试剂的厂商说明书等。制备实施例.罗汉果苷提取物(60％mgv)的制备经高温蒸汽处理的罗汉果鲜果(mgv含量在1.2％左右)15kg，用粉碎机破碎后，加水80l后，加热煮沸，过滤，滤液备用，滤渣加水60l后，加热煮沸，过滤，合并两次滤液；合并的滤液上样于用去离子水平衡的d101大孔树脂层析柱，先用去离子水和20％(v/v)乙醇依次洗脱至无色，然后用6倍柱体积的40％(v/v)乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至无醇味；然后将浓缩液上样于用去离子水平衡的ads-7大孔树脂层析柱，先用8倍柱体积的去离子水洗脱，然后用5倍柱体积30％(v/v)乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥后，即得本发明的罗汉果苷提取物(简称为60％mgv)。多批次重复上述制备过程，mgv含量在60.2～62.5％之间，成分稳定，均大于60％。实施例1.mg(gx008a)和nmn(gx999)对四氧嘧啶诱导的β细胞损伤的保护作用及两化合物的联用效应本实施例试验分别单用gx999或gx008a，及联用gx999和gx008a来评价gx999和gx008a对四氧嘧啶诱导的β细胞损伤的保护作用进行了分析，实验结果显示，gx999和gx008a单药在一定浓度范围对损伤细胞有保护作用，以1mmgx999联合不同浓度gx008a时对损伤细胞起到明显保护作用，并且联合应用起到了协同保护作用。一、实验目的利用体外实验研究gx008a和gx999对四氧嘧啶所致的胰岛β细胞损伤的保护作用，并探讨两者的联用的效应。二、材料和方法2.1材料2.1.1供试品名称：罗汉果苷v，编号gx008a，mw:1287.44；烟酰胺单核苷酸，编号：gx999，mw：334.22。来源：gx008a由北京慧宝源生物技术股份有限公司提供；gx999购自邦泰生物工程(深圳)有限公司。保存条件：干燥，避光，4℃保存。2.1.2细胞系大鼠胰岛素瘤细胞(rinm5f)：购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。2.1.3实验试剂胎牛血清(fbs)、rpmi1640基础培养基购于美国gbico公司；四甲基偶氮唑盐(mtt)，二甲基亚砜(dmso)，四氧嘧啶购自北京索莱宝科技有限公司。2.2试验方法2.2.1细胞培养rinm5f细胞接种于含有青霉素、链霉素、10％灭活胎牛血清的rpmi1640培养液中，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况。待细胞生长至铺满瓶壁的80％-90％后，传代。2.2.2分组及处理培养rinm5f细胞至对数生长期，以5×104/ml的细胞密度接种于96孔培养板，培养24h后，加药处理。实验分为阴性对照组、四氧嘧啶损伤组(axn组)和保护组，axn组和保护组都加入终浓度为15mm的四氧嘧啶，保护组加入不同浓度的gx999和gx008a，预处理1h，实验设4个复孔，实验重复三次。将gx008a和gx999溶于培养基中，现配现用，配成终浓度为200mm和500mm。2.2.3实验步骤细胞存活率检测-mtt法：培养rinm5f细胞至对数生长期，以5×104/ml的细胞密度接种于96孔培养板，培养24h后，加药处理。实验分为阴性对照组、四氧嘧啶损伤组(axn组)和保护组，axn组和保护组都加入终浓度为15mm的四氧嘧啶，保护组加入不同浓度的gx999和gx008a，预处理1h，实验设4个复孔，置于二氧化碳培养箱中常规培养24h，每孔加入mtt20ul(5mg/ml)继续孵育4h。然后弃去培养基，每孔加入150uldmso震荡10min，酶标仪检测490nm处的光密度od值。药物合用指数ci分析：根据不同浓度的药物单用和联用抑制率，采用calcusyn软件对gx999和gx008a不同浓度单用抑制率及相应浓度联用抑制率等数据进行分析处理，得到合用指数(combinationindex，ci)值。根据合用指数定义判断药物协同作用，小于1.0协同作用，大于1.0为拮抗作用。2.2.4统计方法所有实验数据来自至少3次独立实验，以均数±标准差表示。统计分析使用spss16.0软件，两组之间的数据比较采用两独立样本的t检验，多组之间的数据比较采用单因素方差分析，p<0.05认为有统计学意义。三、实验结果四氧嘧啶细胞损伤模型建立实验设阴性对照组、四氧嘧啶不同浓度损伤组(浓度分别为4mm、7mm、10mm、15mm、20mm)作用24h后，设4个复孔，采用mtt法检测细胞生存率。结果如图1所示，随着药物浓度的增加，细胞损伤率随之增加，呈浓度依赖性抑制细胞增殖，与空白对照组比较，p值均小于0.01，差异有统计学意义。单用gx999对四氧嘧啶损伤的rinm5f细胞的保护作用mtt法检测gx999对四氧嘧啶损伤胰岛β细胞的细胞存活率影响。根据上述实验结果，四氧嘧啶浓度选用15mm，实验分为阴性对照组、四氧嘧啶损伤组(axn组)和gx999(0.5、1、5、10mm)保护组，结果如图2所示，相比于阴性对照组，axn组细胞存活率明显降低，差异具有统计学意义(p<0.01)；加入gx999处理后，可以明显提高细胞的存活率，并随着保护组浓度的增加细胞存活率逐渐上升，相比于axn组，当gx999浓度在5mm(p<0.05)、10mm(p<0.01)差异具有统计学意义。gx999对四氧嘧啶的作用分析使用calcusyn软件计算，结果如图3所示，gx999对四氧嘧啶的合用指数ci值均大于1.0，提示gx999对四氧嘧啶具有拮抗作用，即gx999拮抗四氧嘧啶损伤起到细胞保护作用。单用gx008a对四氧嘧啶损伤的rinm5f细胞的保护作用mtt法检测gx008a对四氧嘧啶损伤胰岛β细胞的细胞存活率影响。实验分为阴性对照组、四氧嘧啶损伤组(axn组)和gx008a(0.5、1、5、10mm)保护组，结果如图4所示，相比于阴性对照组，axn组细胞存活率明显降低，差异具有统计学意义(p<0.01)；加入gx008a处理后，可以明显提高细胞的存活率，并随着保护组浓度的增加细胞存活率逐渐上升，相比于axn组，当gx008a浓度在5mm(p<0.05)、10mm(p<0.01)差异具有统计学意义。gx008a对四氧嘧啶的作用分析使用calcusyn软件计算，结果如图5所示，gx008a对四氧嘧啶的合用指数ci值均大于1.0，提示gx008a对四氧嘧啶具有拮抗作用，即gx008a拮抗四氧嘧啶损伤起到细胞保护作用。gx008a/gx999联合应用对四氧嘧啶损伤的rinm5f细胞的保护作用mtt法检测gx008a/gx999联合应用对四氧嘧啶损伤胰岛β细胞的细胞存活率影响。实验分为阴性对照组、四氧嘧啶损伤组(axn组)和gx999(1mm)联合gx008a(0.5、1、5、10mm)保护组。结果如图6所示，相比于阴性对照组，axn组细胞存活率明显降低，差异具有统计学意义(p<0.01)；联合保护组可提高细胞的存活率，并随着浓度的增加细胞存活率逐渐上升，相比于axn组，gx999(1mm)联合gx008a1mm(p<0.05)、5mm和10mm(p<0.01)差异具有统计学意义。gx008a/gx999联合作用分析联合应用效率使用calcusyn软件计算，结果如图7所示，联合保护组与单药保护组相比，gx999(1mm)联合gx008a1mm、5mm药物联合指数ci<1.0，提示gx999和gx008a对四氧嘧啶损伤具有协同保护作用。四、实验结论实验结果显示，gx999、gx008a单药在一定浓度范围对损伤细胞有保护作用，以1mmgx999联合不同浓度gx008a时对损伤细胞起到明显保护作用，并且联合应用起到了协同保护作用。实施例2.罗汉果苷(mg,gx008a)和烟酰胺单核苷酸(nmn,gx999)对3t3-l1前脂肪细胞分化的影响及两化合物的联用效应本实施例试验分别单用gx999或gx008a，及连用gx999和gx008a来评价gx999和gx008a对前脂肪细胞增殖的影响，实验结果显示，gx999、gx008a可以抑制3t3l1脂肪细胞的增殖，存在浓度依赖性效应，两药联合应用可协同抑制细胞增殖；gx999、gx008a均能显著抑制脂肪细胞的脂肪生成，并且联合应用在一定程度上可协同抑制成脂，即联合应用对3t3l1前脂肪细胞的分化有协同抑制作用。一、实验目的研究gx008a和gx999对3t3-l1前脂肪细胞增殖分化的影响，并观察两者联用的效应。二、材料和方法2.1材料2.1.1供试品同实施例1.2.1.2细胞系3t3-l1细胞系：购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。2.1.3实验试剂小牛血清(cs)、胎牛血清(fbs)、dmem基础培养基购于美国gbico公司；ibmx、地塞米松、胰岛素购于美国sigma公司；油红o粉末、四甲基偶氮唑蓝(mtt)购自北京索莱宝科技有限公司。2.2试验方法2.2.1细胞培养将3t3l1细胞置于含10％小牛血清的dmem高糖培养基中，在37℃、5％co2的条件下培养，细胞融合到90％时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代，接种于96孔细胞培养板中。2.2.2分组及处理将gx008a和gx999溶于培养基中，现配现用，配成终浓度为200mm和500mm。2.2.3实验步骤细胞存活率检测-mtt法：取对数生长期细胞，以5×103cells/ml密度接种于96孔板，每组4个复孔。待细胞长至约40％～50％愈合后，更换新鲜含药培养基，分为单用gx999组、gx008a组和gx999+gx008a合用组。培养48h后，每孔加入mtt20ul(5mg/ml)继续孵育4h。然后弃去培养基，每孔加入150uldmso震荡10min，酶标仪检测490nm处的光密度od值，根据公式计算细胞存活率。药物协同作用分析：联合方式：10mmgx999联合gx008a(0、5、10、30、50mm)组。根据不同浓度的药物单用和联用抑制率，采用calcusyn软件对gx999和gx008a不同浓度单用抑制率及相应浓度联用抑制率等数据进行分析处理，得到合用指数(combinationindex,ci)值。根据合用指数定义判断药物协同作用，小于1.0协同作用，大于1.0为拮抗作用。脂肪细胞诱导分化实验：3t3-l1前脂肪细胞生长至完全融合后2天开始诱导分化。即将dmem完全培养液弃掉，换上含5ug/ml胰岛素、0.5mmibmx、1um地塞米松的dmem完全培养液培养，2天后再换用含5ug/ml胰岛素的dmem完全培养液培养2天。随后用dmem完全培养液继续培养2天。自分化第1日起，实验组分别给予含10mmgx999或10mmgx008a的培养液全程干预细胞分化过程，对照组加常规诱导剂。油红o染色：诱导分化8天后细胞经4％多聚甲醛固定30min后，用平衡盐溶液(pbs)洗涤3次，加入油红o染液孵育60min，吸弃液体用pbs漂洗3次，倒置显微镜下观察脂滴形成情况并摄像。加入异丙醇(每孔200ul)，5min后通过酶标仪测量a490nm处的吸光度值。2.2.4统计方法所有实验数据来自至少3次独立实验，以均数±标准差表示。统计分析使用spss16.0软件，两组之间的数据比较采用两独立样本的t检验，多组之间的数据比较采用单因素方差分析，p<0.05认为有统计学意义。三.实验结果gx999对3t3l1前脂肪细胞增殖的影响采用mtt法检测细胞生存率。结果如图8所示，单用gx999(0、10、20、40、60mm)作用3t3l1细胞48h时，随着药物浓度的增加，3t3l1细胞生存率随之减少，呈浓度依赖性抑制细胞增殖，与空白对照组比较，p值均小于0.01，差异有统计学意义。根据上述抑制率得出gx999的ic50为51.7±1.5mm。gx008a对3t3l1前脂肪细胞增殖的影响结果如图9所示，单用gx008a(0、5、10、30、50、100、200mm)作用3t3l1细胞48h时，随着药物浓度的增加，3t3l1细胞生存率随之减少，呈浓度依赖性抑制细胞增殖，与空白对照组比较，p值均小于0.01，差异有统计学意义。gx008a联合gx999对3t3l1前脂肪细胞增殖的影响gx008a、gx999单独作用时，随着给药浓度的增加，对3t3l1前脂肪细胞的生长抑制作用也逐渐增加，呈现明显的剂量依赖效应关系。10mmgx999与不同浓度gx008a(0、5、10、30、50mm)联用时，结果如图10所示(其中只列出部分图9所示的gx008a单药组的数据，以供直观比较)，随着gx008a浓度的增加，两者联合抑制作用呈增强的趋势；与单药组间相比，gx999联合gx008a10、30、50mm的抑制作用明显强于10mmgx999组(p＜0.01)、gx008a单药组(p＜0.05)。10mmgx999联合gx008a的协同作用分析：使用calcusyn软件计算，结果如图11所示，10mmgx999联合gx008a的ci值均小于1.0，提示两药合用具有协同效果。gx008a在一定程度上能够协同gx999抑制3t3l1前脂肪细胞的生长。gx999/gx008a对前脂肪细胞分化的影响根据上述联合应用实验结果，选定药物浓度及联合浓度。诱导分化过程中加入10mmgx999、10mmgx008a、10mmgx999+10mmgx008a处理8天，采用油红o染色，显微镜下观察并摄像，用异丙醇萃取油红o读取od值。图12显示了各组的示例性照片，图13显示了定量的脂滴含量，表明，gx999和gx008a单用或联合应用均可抑制成脂，与分化组比较细胞中脂滴含量明显下降(p<0.01)；gx008a/gx999联合组与单药组相比脂滴含量明显下降(p<0.05)。四、实验结论实验结果提示：gx999、gx008a可以抑制3t3l1脂肪细胞的增殖，存在浓度依赖性效应，两药联合应用可协同抑制细胞增殖；gx999、gx008a均能显著抑制脂肪细胞的脂肪生成，并且联合应用在一定程度上可协同抑制成脂，即联合应用对3t3l1前脂肪细胞的分化有协同抑制作用。实施例3.罗汉果苷(60％mgv)和烟酰胺单核苷酸(nmn,gx999)的降血糖效果一、试验样品的配制(1)nmnmg200的制备溶解20克nmn(纯度98％)和0.5克60％mgv(前述制备实施例制备)入100ml含甘油10％的水溶液中制成nmnmg200。(2)nmn200的制备溶解20克nmn(纯度98％)入100ml含甘油10％的水溶液中制成nmn200。(3)mg5的制备溶解0.5克60％mgv(前述制备实施例制备)入100ml含甘油10％的水溶液中制成mg5。二、上午餐前血糖效果检测选择早上餐前血糖>6.0的志愿者每天上午检测空腹血糖值(0m)后，分别服用实施例1制备的1mlnmnmg200，nmn200或mg5；服用方法：将1ml所述溶液放入100ml饮用水中，喝下，随后分别测30分钟(30min)，60分钟血糖值(60min)，结果见表1：表1服用不同样品的志愿者血糖值检测如上所述实验步骤所述，再选择早上餐前血糖常值>6.0的自愿者，检测早上餐前空腹血糖，服用nmnmg200的时间在每晚睡觉前约1小时，服用后检测血糖值。结果见表2：表2服用nmnmg200前后志愿者血糖值检测结果志愿者编号性别服用前服用后001男6.34.8002男6.55.4003男6.75.6004男6.65.2结果表明，罗汉果苷和烟酰胺单核苷酸联合使用具有降血糖的效果。当前第1页12