一种福建水仙茶提取物及其制备方法和在抑制牙周炎致病菌中的应用与流程

本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及一种福建水仙茶提取物及其制备方法和在抑制牙周炎致病菌中的应用。

背景技术：

福建水仙茶是福建乌龙茶类中的一种，为无性繁殖系品种，属小乔木型，原产于建阳县水吉的大湖，并逐步被外地引植。水仙茶树树势高大，主干明显，分枝稀，叶片呈水平状着生，叶片大而厚，色浓绿，叶柄粗扁，梗粗，节间长，芽叶含水量高。该品种育芽力和持嫩性较强，一芽三叶盛期在4月下旬，萌芽开采期较迟；抗逆性较强，扦插繁殖发根率较高，根系发达，吸肥力强，植株经济寿命长。

福建水仙茶制作一般包括萎凋、做青、揉捻、初焙、包揉、足火等道工序。由于水仙叶肉肥厚，做青时必须根据叶厚水多的特点，以“轻摇薄摊，摇做结合”的方法灵活操作。

水仙茶树在福建多地引种并扩大种植，按产地分为以下几类：

建瓯水仙，条索紧结壮实，色泽油润，香气高雅且冗长，兰花香极显，汤色金黄明亮清澈，叶底肥厚柔软，镶嵌“三红七绿”。

武夷水仙，色泽绿褐带宝色、条索肥壮，香气浓锐馥郁，兰花香优雅，汤色橙黄明亮，滋味醇厚甘爽显岩韵，叶底肥嫩软亮、叶缘朱砂红点鲜明，素有“醇不过水仙”的美誉。

闽南水仙，索紧结卷曲、色泽砂绿油润，香气清高带兰花型，滋味醇厚甘滑，汤色金黄清澈明亮，叶底肥厚软亮显红边。

漳平水仙，又名“纸包茶”，饼外形呈四方形，砂绿油润间蜜黄，红边明；汤色为金黄明亮。

目前，关于乌龙茶类提取物的研究报道不少，例如：1994年，ooshima等(ooshimat,minamit,aonow,etal.reductionofdentalplaquedepositioninhumansbyoolongteaextract[j].cariesres,1994,28(3):146-149)检验35名18-29岁志愿者，在每次进食前后与睡觉前使用溶于0.2％酒精的0.5mg/ml的乌龙茶提取物冲洗口腔一周后发现牙菌斑沉积量减少21％。matsumoto等(matsumotom,minamit,sasakih,etal.inhibitoryeffectsofoolongteaextractoncaries–inducingpropertiesofmutansstreptococci[j].cariesresearch,1999,33(6):441-445.)研究发现乌龙茶提取物在1mg/ml的浓度下减少远缘链球菌6715或变形链球菌mt8148r的产酸率及其粘附，认为乌龙茶可降低口腔链球菌的细胞表面的疏水性，并且可诱导变形链球菌，口腔链球菌，血链球菌和格氏链球菌的细胞聚集。

然而，对于福建水仙茶提取物的制备和应用却鲜有报道，尤其是在抑制牙周炎致病菌中用途，更无相关报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种福建水仙茶提取物及其制备方法和在抑制牙周炎致病菌中的应用，该福建水仙茶提取物具有抑制牙周炎致病菌的新用途，且抑菌效果好，为进一步制备各类抑制牙周炎致病菌产品提供了依据。

具体技术方案如下：

一种福建水仙茶提取物的制备方法，包括：

(1)取粉碎后的福建水仙茶，与体积分数为40～60％的乙醇水溶液混合，进行超声波浸提，过滤得到滤液，滤液经浓缩、过滤和离心后，冷冻干燥得到粗提物i；

福建水仙茶与乙醇水溶液的料液比为1：10～20；

(2)利用ab-8型大孔树脂对粗提物i进行静置吸附，并进行梯度洗脱，仅收集80％乙醇水溶液的洗脱组分，再经旋转蒸发和冷冻干燥，得到福建水仙茶提取物；

所述梯度洗脱的程序为：依次经水以及体积分数为20％，40％，60％和80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱；

或者，依次经水以及体积分数为50％，80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱。

本发明针对福建水仙茶采用特定的大孔树脂以及洗脱组分，得到了具有特殊功能的福建水仙茶提取物；在抑菌试验中，该提取物能够用于抑制牙周炎致病菌，即：牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)和具核梭杆菌(f.nucleatum)，尤其是具核梭杆菌(f.nucleatum)；说明福建水仙茶提取物具有抑制牙周炎致病菌的作用。

进一步地，步骤(2)中，粗提物i与ab-8型大孔树脂的质量比为1：20～30。

进一步地，步骤(2)中，水和乙醇水溶液的洗脱流速为1～1.5bv/h。

为探究福建水仙茶提取物抑制牙周炎致病菌的机理，本发明采用制备型高效液相色谱仪对福建水仙茶提取物进行两次分离，分离得到了单体化合物i(即：f1)和单体化合物ii(即：f2)；并通过利用质谱和核磁共振波谱等现代技术手段进行结构鉴定，得知：f1和f2分别是：

quercetin3-o-[(e)-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)][β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside)；

和kaempferol3-o-[(e)-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)][β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside。

其中，液相色谱的分离条件为：0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸乙腈流动相梯度洗脱，一次上样量100mg，流速10ml/min；二次制备后，两种单体化合物纯度分别达到98.77％和97.08％。

故，进一步地，本发明提供了一种福建水仙茶提取物，该福建水仙茶提取物中同时含有化合物i和化合物ii；两种化合物的结构式如下：

本发明提供了所述福建水仙茶提取物在抑制牙周炎致病菌中的应用。

进一步地，所述牙周炎致病菌为牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)和/或具核梭杆菌(f.nucleatum)。

进一步地，所述福建水仙茶提取物对牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)的有效抑菌浓度≥125μg/ml；对具核梭杆菌(f.nucleatum)的有效抑菌浓度≥62.5μg/ml。

本发明还提供了化合物i和化合物ii在抑制牙周炎致病菌中的应用。两种化合物的结构式如下：

进一步地，所述牙周炎致病菌为牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)和/或具核梭杆菌(f.nucleatum)。

本发明通过微量二倍稀释法测定了f1和f2对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的抑制作用，最低抑菌浓度在0.12-0.24mm范围内，显示两者对牙周炎致病菌均具有较强的抑制效果；尤其是，f2对具核梭杆菌的抑制作用更佳。并且，用结晶紫染色法证明了f2可以通过抑制细菌生长和生物膜形成及螯合铁离子等途径减少口腔疾病的发生；进一步反映了福建水仙茶提取物抑制牙周炎致病菌的机理。

进一步地，所述化合物i对牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)和具核梭杆菌(f.nucleatum)的有效抑菌浓度均≥0.24mm；所述化合物ii对牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)的有效抑菌浓度≥0.24mm，对具核梭杆菌(f.nucleatum)的有效抑菌浓度≥0.12mm。化合物在低于mic的浓度下虽然无法杀灭细菌，但会对其生物膜的形成和新陈代谢产生影响，从而抑制细菌对口腔的毒害。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过醇提、树脂纯化得到了福建水仙茶提取物，并通过抑菌实验证明福建水仙茶提取物具有抑制牙周炎致病菌的用途，且抑菌效果较好，为进一步制备各类抑制牙周炎致病菌产品提供了依据。

(2)本发明通过试验发现福建水仙茶提取物对牙周炎致病菌有极佳的抑菌效果，尤其是对具核梭杆菌(f.nucleatumatcc25586)的抑菌效果更佳，可通过抑制具核梭杆菌生物膜的形成和降低铁载体活性杀灭具核梭杆菌。

(3)本发明还通过试验从福建水仙茶提取物中提取出单体化合物i和单体化合物ii，单体化合物i和单体化合物ii对牙周炎致病菌有极佳的抑菌效果，其中单体化合物ii对具核梭杆菌(f.nucleatumatcc25586)的抑菌效果更佳，可通过抑制具核梭杆菌生物膜的形成和降低铁载体活性杀灭具核梭杆菌。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度的福建水仙茶提取物对p.gingivalis和f.nucleatum生物膜的抑制率。

图2为实施例1中不同浓度的福建水仙茶提取物的铁螯合活性图；

其中，negativecontrol表示阴性对照；ferrichrome表示阳性对照。

图3为实施例2中福建水仙茶提取物通过制备型高效液相色谱仪进行两次制备时第一次制备后的uplc图。

图4为图3中后峰8的hplc图。

图5为图3中后峰11的hplc图。

图6为实施例2中化合物f1的hplc-dad色谱图。

图7为实施例2中化合物f2的hplc-dad色谱图。

图8为实施例4中f1和f2对f.nucleatum生物膜的抑制率。

图9为实施例4中f2和山奈酚对f.nucleatum生物膜的抑制率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1福建水仙茶提取物的制备及抑菌试验

一、制备福建水仙茶提取物

1、粗提物i的制备

(1)取福建水仙茶的原料茶(即：建瓯水仙茶)与体积浓度为50％的乙醇水溶液按1:15的料液比，投料至多功能超声波提取机组，超声提取2h，趁热抽滤，得到滤液；

(2)滤液经旋转蒸发挥干乙醇和部分水，得到浓缩液，过滤离心后，冷冻干燥，获得粗提物i。

2、大孔树脂的纯化

大孔树脂的预处理与装柱：将ab-8型大孔树脂采用体积分数95％乙醇水溶液浸泡24h过后，使其充分溶胀，将漂在上面的一些杂物，树脂碎片去除。采用湿法装柱，装好过后，采用体积分数95％乙醇进行清洗，直至流出液没有白色浑浊为止，然后再用去离子水将乙醇洗脱，直至无味，此时即可准备上样。

粗提物i(浓度为40.85g/l)与ab-8型大孔树脂按照1：25比例进行静置吸附，经水洗2个柱体积(2bv)后，用不同体积浓度的乙醇(20％，40％，60％，80％)进行梯度洗脱各1个柱体积(1bv)，流速控制在1.5bv/h，最后，以95％乙醇冲洗层析柱以备下次使用。

分步收集各梯度洗脱液，每隔5管收集洗脱液进行uplc检测。通过目标化合物的相对峰面积比较，选取目标化合物富集的部分，合并、旋转蒸发和真空冷冻干燥，获得纯化的粗黄酮样品ii，即：福建水仙茶提取物。

二、抑菌试验

1、实验菌株

牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalisatcc33277)，具核羧杆菌(f.nucleatumatcc25586)，上述2个菌株购自上海市微生物菌种保藏中心。

2、培养基的配制

bhi液体培养基：在锥形瓶中加入脑心浸出液肉汤粉3.7g，酵母提取物0.5g，l-半胱氨酸50mg，溶于100ml沸水中，121℃高压灭菌。在培养基使用之前，要添加绵羊血清5ml，氯化血红素0.2ml和维生素k0.1ml。

tsa固体培养基：血琼脂基础培养基粉末4g，倒入100ml蒸馏水，水浴加热溶解，121℃高压灭菌，冷却至50～55℃后添加无菌脱纤维羊血，使其终浓度为5％，充分混匀，倒平板。

3、细菌的传代及培养

将牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复苏，经革兰氏染色鉴定为纯培养物后，接种于血琼脂培养基，在37℃恒温厌氧环境(80％n2，10％co2，10％h2)培养5-7天，注意观察平皿表面生长菌落的大小、形态、颜色以及气味等。待培养基表面长出深灰色菌落后挑取直径约1mm的菌落在新的平板上划线增菌。培养时要注意培养箱中温度的变化并及时调整，保证细菌始终处于合适的厌氧培养环境。整个操作过程要求迅速简洁，并保证始终处于厌氧和无菌的环境。

4、最低抑菌浓度(mic)的测定(采用微量二倍稀释法)

(1)药液配制

称取本实施例制得的福建水仙茶提取物粉末(简称fla)，先溶于dmso中，用蒸馏水稀释100倍使dmso浓度低于1％，备用。将fla的初始浓度折算为摩尔浓度，

如表1所示，之后再进行倍比稀释。

表196孔板二倍稀释后各孔浓度

(2)实验菌悬液的配制

在血平板上挑取生长良好的单个菌落于bhi液体培养基中培养，置于厌氧环境下37℃恒温培养48h后，吸取1ml菌液至离心管中，10000rpm条件下离心2min，弃去上清液取下层菌体，用pbs调菌悬液浓度为10^9cfu/ml(分光光度计比色a600＝1.0)，用液体培养基稀释50倍，备用。

(3)微量二倍稀释法

无菌96孔板，第2-8列各孔中加100μl营养肉汤液体培养基，第1行孔中各加入1mg/ml各浓度的溶液的100μl，采用二倍稀释法，依次稀释至第2-8行孔内，然后将稀释好的菌液依次加入各孔，每孔100μl，另作阴性对照组(100μl培养基+100μl菌液)，生化培养箱37℃恒温静置培养48h，取出以肉眼观察，孔内清亮即无细菌生长，得出最低抑菌浓度。

结果如表2所示。

表2fla的抑菌活性

5、fla对p.gingivalis和f.nucleatum生物膜影响的实验

采用96孔聚氯乙烯微孔板结晶紫染色方法，具体如下：

培养方法同本实施例第三部分，将细菌经0.03mm，0.06mm，0.12mm，0.24mm四个浓度的药物处理，培养48h后将bhi培养基吸出，每孔加入100μl无菌pbs缓冲液清洗96孔板1次，以去除悬浮的细菌，去除pbs后在通风口处风干。每孔加入100μl甲醇固定15min，在滴加甲醇时要对着管壁滴加，以免冲散已逐渐形成的生物膜。使用移液器去除甲醇，在通风口处风干。每孔加入100μl0.2％结晶紫溶液，室温下染色10min，无菌pbs缓冲液清洗3次。把培养板倒置在滤纸上以除去剩余的水，并在37℃温箱中烘干或室温凉干。完全干燥后，每孔加入100μl的33％乙酸溶液作用20min以溶解结晶紫。波长为570nm条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的od值。每次实验每种菌株做3个孔的重复，试验数值取3次数值的平均值，此实验重复三次以上以确保实验的准确性。

以未接种牙龈卟啉单胞菌的bhi培养液作为阴性对照。

生物膜抑制率＝(对照组od-处理组od)/对照组od*100％。

结果如图1所示，fla在15.6μg/ml～125μg/ml浓度范围内均能很好的抑制p.gingivalis和f.nucleatum的生物膜形成，在低浓度(15.6μg/ml)时对f.nucleatum就有明显的抑制作用。

6、铁载体活性的测定

使用schwyn和neils的通用铁载体测定法，测量各个药物(0.0075mm至0.12mm)的铁螯合活性。配制不同摩尔浓度的ferrichrome(sigma-aldrich)，一种由球形红细菌产生的铁载体，用作阳性对照。

取10mm十六烷基三甲基溴化铵(hdtma)溶液6.0ml加入100ml容量瓶内并用双蒸水适度稀释。将1.5ml的1mmfecl3溶液(10mmhcl)与7.5ml的2mm铬天青(cas)溶液混匀后，沿玻棒缓慢加入至上述容量瓶中。称取4.3079g无水双二甲胺(anhydrouspiperazine)溶解于约30ml双蒸水中,再小心加入6.25ml的12mhci，即得ph-pka-5.6缓冲液。将此溶液转入前述容量瓶中，并用双蒸水定容至100ml。

无菌96孔板，第2-8列各孔中加100μl双蒸水，第1列孔中各加入各浓度的药液或阳性对照ferrichrome200μl，采用二倍稀释法，依次稀释至第2-8列孔内，然后将稀释好的cas液依次加入各孔，每孔100μl，得药物各孔终浓度为0.0075mm，0.015mm，0.03mm，0.06mm，0.12mm。1h后在波长为630nm条件下，用酶标仪测定没孔的od值。每次实验做3个孔的重复，试验数值取3次数值的平均值，此实验重复三次以上以确保实验的准确性。

计算铁螯合率＝(1-处理组od/对照组od)/*100％。

结果如图2所示，fla与阳性对照物具有相似的规律，在高于1.95-62.5μg/ml浓度范围内可有效螯合铁离子，随浓度升高而作用加强。

实施例2福建水仙茶提取物中黄酮苷单体的提取和鉴定

一、福建水仙茶提取物的检测

采用uplc-ms检测福建水仙茶样品中的化合物并进行定性，分析一级质谱数据过程中发现两个分子量较大的化合物，峰8和峰11，通过深入分析二级质谱碎片推测可能是带有四个糖基的黄酮苷化合物，目前在茶叶中所报道的四糖苷黄酮苷较少，因此进行分离具有创新性意义。

二、提取福建水仙茶提取物中黄酮苷单体

采用制备型高效液相色谱仪进行两次制备，具体制备方法如下：

第一次制备：将粗黄酮样品ii配制成200mg/ml(纯甲醇溶解)的溶液，5000rpm离心2min去杂质，上清液经微孔有机滤膜(孔径0.45μm)过滤后，通过purifier100制备系统进行第一次制备。

第一次制备的条件为：agilentsbc18(250*21.2mm，10μm)制备柱；流动相为a相(0.1％甲酸/水)-b相(0.1％甲酸/乙腈)，洗脱程序见表3。

表3制备色谱洗脱程序

将第一次制备的冻干粉末，按照200mg/ml浓度配制成溶液，微孔有机滤膜(孔径0.45μm)过滤，然后进行第二次制备。

第二次制备：采用制备柱：agilentsbc18(250*21.2mm，10μm)；流动相：a相(0.1％甲酸/水)-b相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱分别为：25％b-26.5％b洗脱25min，26.5％b-27.5％b洗脱20ml；流速5ml/min；进样量0.5ml，室温下洗脱。

将收集的组分合并、浓缩、冻干后，保存，得到两个黄酮苷单体，用于nmr等分析。

将第一次制备的每个峰收集进行uplc-ms检测，发现峰8和峰11的主要峰在uplc图上的保留时间分别为14.97min和15.56min，且一级质谱结果的分子量也可与目标化合物对应，可确定第8号峰和第11号峰主要为目标化合物f1和f2，分子量分别为1050和1034。将收集的洗脱液经hplc检测后用峰面积归一法得纯度为71.50％和73.20％(图4和图5)，旋干后，用甲醇溶解，再进行二次制备，最终获得单体f1和f2。

二、鉴定单体成分

采用hplc-dad分析法、lc/ms分析法和核磁共振法对上述单体f1和f2进行鉴定。

(1)hplc-dad分析

采用岛津lc-2010aht型高效液相色谱仪，分析柱为美国agilent公司zoprbaxsb-c18(4.6×250mm，5μm)，流动相a为水/0.1％甲酸、b为乙腈/0.1％甲酸。洗脱梯度见下表，流速1.0ml/min，进样量10μl，柱温35℃，检测波长360nm。

表4hplc洗脱时间程序

结果如6和7所示，f1、f2组分均在波长220nm、320nm处有较大吸收，与黄酮类化合物吸收值相符；通过面积归一法得到化合物f1和f2，其纯度分别为98.77％和97.08％，纯度符合单体要求。

(2)lc/ms分析

采用负离子扫描模式；扫描范围：m/z100-2000；雾化气(gs1)：50psi；雾化气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：35psi；离子源温度(tem)：500℃；离子源电压(is)：-4500v；一级扫描：去簇电压(dp)：100v；聚焦电压(ce)：10v；二级扫描：使用tofms-production-ida模式采集质谱数据，cid能量为40、60和80v，进样前，用cds做质量轴校正。

结果如表5和图8、9所示。

表5f1和f2在负离子模式下的质谱信息

f1经uplc-ms分析，保留时间为14.89min，其相对分子质量为1050.28，分子式为c47h54o27，es^-模式下扫描结果显示基本无其它杂质信号。根据二级质谱结果可知，质谱碎片为887/724/542/431/299，确定母核离子为m/z299，即槲皮素，其上连接有四个糖基团，分别为两分子五碳糖糖基(132u)，两分子葡萄糖糖基(162u)和一分子鼠李糖糖基(146u)，还接有一个对香豆酰基(164u)。

f2经uplc-ms分析，保留时间为15.56min，由[m-h]^-为1033.28，可知其相对分子质量为1034.28，分子式为c47h54o26，es^-模式下扫描结果显示基本无其它杂质信号。根据二级质谱结果可知，质谱碎片为867/747/597/451/285，确定母核离子为m/z285，即山奈酚，其上连接有四个糖基团，分别为两分子五碳糖糖基(132u),两分子葡萄糖糖基(162u)和一分子鼠李糖糖基(146u)，还接有一个对香豆酰基(164u)。

(3)核磁共振鉴定

取10mg所制备的高纯度粉末充分溶于0.4ml的99.8％氘代甲醇中作nmr分析，根据lc/ms的出峰时间和二级质谱的扫描信息，结合uplc-q-tof/ms的分析鉴定二次制备纯化后的组分结果，根据brukerbiospinag型核磁共振仪的¹h-nmr(500mhz)和¹³c-nmr(126mhz)波谱信息分析化合物的结构。

结果如表6所示。

表6f1和f2的¹h和¹³c-nmr信息

注：p-coumaricacid(对香豆酰基)；glc(葡萄糖基)；rha(鼠李糖基)：ara(阿拉伯糖基)

通过表6可确认f1为quercetin

3-o-[(e)-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)]

[β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside,即接有四个糖基和一个对香豆酰基的槲皮苷，结构式如下所示。

f2为kaempferol3-o-[(e)-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)][β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside,即接有四个糖基和一个对香豆酰基的山奈苷，结构式如下所示。

实施例3f1和f2的抑菌功能

本实施例通过二倍稀释法测定化合物f1和f2对p.gingivalis和f.nucleatum的抑菌活性；其中，采用的实验菌株、培养基、细菌传代和培养方法以及最低抑菌浓度(mic)的测定方法均与实施例1相同。

表796孔板二倍稀释后各孔浓度

表8f1和f2对p.gingivalis的mic测定值

表9f1和f2对f.nucleatum的mic测定值

如表8和表9所示，f1，f2对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌都具有较好的抑菌效果，其中，对牙龈卟啉单胞菌的的最低抑菌浓度分别为0.24mm和0.24mm，对具核梭杆菌的最低抑菌浓度分别为0.24mm和0.12mm。

表10f1和f2的抑菌活性对比

表11f2和具有相同母核的山奈酚的抑菌活性对比

本发明采用实施例1相同方法测定不同浓度下f1，f2的铁螯合率以及对f.nucleatum生物膜的抑制率，结果如图8～9和表12～13所示。

由图8所示，f1和f2对的f.nucleatum生物膜均有抑制效果，且f2的抑制率更高。

由图9所示，f2与其母核相比较，在浓度大于0.12mm对f.nucleatum生物膜抑制率远远高于山奈酚。

表12不同浓度下f1，f2的铁螯合率(％)

表13不同浓度下f2，山奈酚的铁螯合率(％)

由表12所示，在浓度范围0.03-0.12mm时，f1的铁螯合率约比f2低9％，其余浓度下低3％，说明f2相对于f1来说具有更强的铁螯合活性。

由表13所示，在浓度范围0.03-0.12mm时，f2的铁螯合活性均强于其母核山奈酚。

实施例4福建水仙茶提取物的制备

一、制备福建水仙茶提取物

1、粗提物i的制备

(1)取福建水仙茶的原料茶(即：建瓯水仙茶)与体积浓度为50％的乙醇水溶液按1:15的料液比，投料至多功能超声波提取机组，超声提取2h，趁热抽滤，得到滤液；

(2)滤液经旋转蒸发挥干乙醇和部分水，得到浓缩液，过滤离心后，冷冻干燥，获得粗提物i。

2、大孔树脂的纯化

大孔树脂的预处理与装柱：将ab-8型大孔树脂采用体积分数95％乙醇水溶液浸泡24h过后，使其充分溶胀，将漂在上面的一些杂物，树脂碎片去除。采用湿法装柱，装好过后，采用体积分数95％乙醇进行清洗，直至流出液没有白色浑浊为止，然后再用去离子水将乙醇洗脱，直至无味，此时即可准备上样。

粗提物i(浓度为40.85g/l)与ab-8型大孔树脂按照1：25(v:v)比例进行静置吸附，经水洗2个柱体积(2bv)后，直接用50％乙醇洗脱2bv，再用80％洗脱1bv，流速控制在1.5bv/h，收集80％洗脱部分；最后，以95％乙醇冲洗层析柱以备下次使用。

分步收集各梯度洗脱液，每隔5管收集洗脱液进行uplc检测。通过目标化合物的相对峰面积比较，选取目标化合物富集的部分(80％体积浓度的乙醇)，合并、旋转蒸发和真空冷冻干燥，获得纯化的粗黄酮样品ii，即：福建水仙茶提取物。

经uplc检测，上述福建水仙茶提取物同样存在f1和f2两种化合物。