一种高载药量双硫仑纳米粒及其在肿瘤防治中的应用的制作方法
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种高载药量双硫仑纳米粒及其在肿瘤防治中的应用。
背景技术：
双硫仑(disulfiram，dsf)，分子式c10h20n2s4，分子量296.5，是二硫代氨基甲酸酯家族的成员之一，在临床上广泛引用于抗酗酒药物(hamidrezafasehee,ardeshirghavamzadeh,kamranalimoghaddam,etal.acomparativecytotoxicevaluationofdisulfiramencapsulatedplgananoparticlesonmcf-7cells[j].ijhoscr,2017,11:16-21.)。在近年来学者们通过研究发现dsf对许多的癌症类型均表现出强烈的细胞毒性，包括直肠癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、乳腺癌及前列腺癌等(morrisonbw,doudicanna,patelkr,etal.disulfiraminducescopper-dependentstimulationofreactiveoxygenspeciesandactiva-tionoftheextrinsicapoptoticpathwayinmelanoma[j],melanomares,2010,20:11-20.)。dsf在血液恶性肿瘤和实体瘤的抗癌作用，已经在临床前研究中被证实(robinsontj,paim,liujc,etal.high-throughputscreenidentifiesdisulfiramasapotentialtherapeuticfortriple-negativebreastcancercells:interactionwithiqmotif-containingfactors[j].cellcycle,2013,12:3013-3024；mohammadnajlah,zahimaahmed,mohammediqbal,etal.developmentandcharacterisationofdisulfirm-loadedplgananoparticleforthetreatmentofnon-smallcelllungcancer[j].eurjpharmbiopharm,2017,112:224-233.)，其作用机制涉及抑制醛脱氢酶(aldh)活性、诱导细胞毒性、抑制多种蛋白酶体和nfκb活性、逆转机体多药耐药性等(h.yang,j.a.zonder,q.p.dou,clinical.developmentofnovelproteasomeinhibitionforcancertreatment[j].expertopininvdrug,2009,18:957-971；hamidrezaf,rassould,ardeshirg,etal.deliveryofdisulfiramintobreastcancercellsusingfolate-receptor-targetedplga-pegnanoparticles:invitroandinvivoinvestigations[j].jnanobiotecg,2016,14:32；cvek,b.cytotoxiceffectofdisulfiram/copperonhumanglioblastomacelllinesandaldh-positivecancer-stem-likrcells[j].bjc,2013,108:993.)，但难溶于水及其在血液中的半衰期短等特性，限制了dsf抗肿瘤作用地充分发挥。因此,寻找一种可以解决dsf溶解性的方法并能促进其向肿瘤组织分布的载药系统很有必要。
双硫仑在溶液中很不稳定，而纳米包封对许多不稳定性药物可以保持其固态形式并与外界导致其不稳定的因素相对隔离，从而提高其稳定性；纳米粒具有表观溶解度高、稳定性好和药物粒径小，更重要的是粒径＜200nm混悬剂可以通过高通透性和滞留(epr)效应能够更容易在肿瘤组织中富集，因此，纳米制剂是解决dsf溶解性及稳定性的一个可行方案。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种双硫仑纳米粒，利用大豆卵磷脂(spc)和生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(tpgs)作为联合载体制备dsf纳米粒(dsf-nps)可显著提高载药量，稳定性好，且具有优异的抗肿瘤效果，能够用于制备抗肿瘤药物，同时简化了制备方法，在解决dsf静脉注射给药的同时，有望能基于epr效应提高药物在肿瘤组织中分布从而提高其体内抗肿瘤药效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种双硫仑纳米粒，包括双硫仑和稳定剂，所述稳定剂包括维生素e-聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)、甲氧基聚乙二醇磷脂(mpeg-dspe)、大豆卵磷脂(spc)、蛋黄卵磷脂(epc)、氢化大豆卵磷脂(hspc)、氢化蛋黄卵磷脂(hepc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、甲氧基聚乙二醇-聚己内酯(mpeg-pcl)、甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mpeg-pla)、泊洛沙姆p188、油酸钠、羟丙基-β-环糊精中的一种或几种，或者磷脂材料与苄泽的组合。
优选地，所述稳定剂为磷脂材料(大豆卵磷脂及大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱)与维生素e-聚乙二醇琥珀酸酯的组合。
优选地，所述双硫仑和稳定剂的质量比为1：(0.1～10)。
优选地，所述双硫仑纳米粒的粒径为10～1000nm。
本发明提供了上述技术方案所述双硫仑纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将双硫仑、稳定剂、有机溶剂和水混合，得到前驱体溶液；
除去前驱体溶液中的有机溶剂即得双硫仑纳米粒混悬液；
除去双硫仑纳米粒混悬液中的水后即得双硫仑纳米粒。
优选地，所述前驱体溶液中双硫仑的浓度为0.1～200mg/ml；有机溶剂和水的体积比为1：(1～100)。
优选地，所述有机溶剂为第一有机溶剂，或者为第一有机溶剂和第二有机溶剂的混合物；所述第一有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜和n，n-二甲基甲酰胺中的一种或几种，所述第二有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或几种。
本发明提供了上述技术方案所述双硫仑纳米粒或上述技术方案所述制备方法制备得到的双硫仑纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物中双硫仑纳米粒的含量为5～95％。
优选地，所述抗肿瘤药物的剂型为固体剂型、半固体剂型、液体剂型或气体剂型。
本发明提供了一种双硫仑纳米粒，包括双硫仑和稳定剂。本发明提供的双硫仑纳米粒中稳定剂的亲水部分构成亲水性外层，稳定剂的亲脂性部分形成脂溶性内核将成分双硫仑药物包裹在其中，保证了水不溶的双硫仑药物以纳米大小的微粒形式能够均匀分散在水相中，解决了其难溶、难给药的问题；以所述双硫仑纳米粒为活性成分，可通过现代制剂工艺制备成临床上常见的多种剂型，从而满足多种临床用药需要。
附图说明
图1为实施例44制备的dsf-nps分散体系中双硫仑纳米粒的粒径分布图；
图2为实施例3(图2a)和实施例44(图2b)制备的双硫仑纳米粒的透射电镜形貌图；
图3为实施例3(图3a)和实施例44(图3b)制备的双硫仑纳米粒与各种生理介质37℃孵育8h过程中粒径变化图；
图4为实施例3(图4a)和实施例44(图4b)制备的双硫仑纳米粒在纯水中的降解曲线
图5为实施例3(图5a)和实施例44(图5b)制备的双硫仑纳米粒在纯水及含10％胎牛血清的pbs中的降解曲线
图6为实施例3(图6a)和实施例44(图6b)制备的双硫仑纳米粒在含1％吐温80的pbs缓冲溶液中的体外释放行为曲线；
图7为实施例3(图7a)和实施例44(图7b)制备的双硫仑纳米粒给药48h后对乳腺癌细胞4t1细胞抑制率的柱状图(mean±sd，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；
图8为dir荧光标记的dsf-spc纳米粒对4t1荷瘤小鼠静脉注射给药12h后在主要脏器中的分布图；
图9为4t1荷瘤裸鼠给与实施例3(图9a)和实施例44(图9b)制备的双硫仑纳米粒后各组小鼠肿瘤体积随时间变化曲线；
图10为4t1荷瘤裸鼠给与实施例3(图9a)和实施例44(图9b)制备的双硫仑纳米粒后各组小鼠体重随时间变化曲线；
图11为实施例3制备的dsf-spc-nps对4t1荷瘤裸鼠药效学实验结束后鼠肿瘤组织实物图(a为口服给药组，b为静脉注射组)；
图12为实施例44制备的dsf-spc-tpgs-nps对4t1荷瘤裸鼠药效学实验结束后鼠肿瘤组织实物图(a为口服给药组，b为静脉注射组)。
具体实施方式
本发明提供了一种双硫仑纳米粒，包括双硫仑和稳定剂，所述稳定剂包括维生素e-聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)、甲氧基聚乙二醇磷脂(mpeg-dspe)、大豆卵磷脂(spc)、蛋黄卵磷脂(epc)、氢化大豆卵磷脂(hspc)、氢化蛋黄卵磷脂(hepc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、甲氧基聚乙二醇-聚己内酯(mpeg-pcl)、甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mpeg-pla)、泊洛沙姆p188、油酸钠、羟丙基-β-环糊精中的一种或几种，或者磷脂材料与苄泽的组合。
在本发明中，所述维生素e-聚乙二醇琥珀酸酯优选为维生素e-聚乙二醇1000琥珀酸酯(tpgs)，所述甲氧基聚乙二醇磷脂优选为甲氧基聚乙二醇2000磷脂(mpeg2000-dspe)。
在本发明中，所述双硫仑和稳定剂的质量比优选为1：(0.1～10)，更优选为1：(0.1～8)，进一步优选为1：(0.5～6)，最优选为1：(1～2)。
本发明提供的双硫仑纳米粒中稳定剂的亲水部分构成亲水性外层，稳定剂的亲脂性部分形成脂溶性内核将成分双硫仑药物包裹在其中，保证了水不溶的双硫仑药物以纳米大小的微粒形式能够均匀分散在水相中，解决了其难溶、难给药的问题；以所述双硫仑纳米粒为活性成分，可通过现代制剂工艺制备成临床上常见的多种剂型，从而满足多种临床用药需要。
在本发明中，所述双硫仑纳米粒的粒径优选为10～1000nm，更优选为50～800nm，进一步优选为50～600nm，最优选为60～300nm。
本发明提供了上述技术方案所述双硫仑纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将双硫仑、稳定剂、有机溶剂和水混合，得到前驱体溶液；
除去前驱体溶液中的有机溶剂即得双硫仑纳米粒混悬液；
除去双硫仑纳米粒混悬液中的水后即得双硫仑纳米粒。
本发明将双硫仑、稳定剂、有机溶剂和水混合，得到前驱体溶液。在本发明中，所述前驱体溶液中双硫仑的浓度优选为0.1～200mg/ml，更优选为1～100mg/ml，最优选为5～60mg/ml。在本发明中，所述有机溶剂优选为第一有机溶剂，或者为第一有机溶剂和第二有机溶剂的混合物；所述第一有机溶剂优选包括甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜和n，n-二甲基甲酰胺中的一种或几种，所述第二有机溶剂优选包括乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或几种。在本发明中，所述有机溶剂和水的体积比优选为1：(1～100)，更优选为1：(2～20)。
本发明优选根据所述稳定剂的水溶性，将所述稳定剂分为水溶性稳定剂和水不溶性稳定剂。本发明优选根据所述稳定剂的水溶性选择各物料的混合方式，具体的，当所述稳定剂为一种或几种水不溶性稳定剂时，本发明优选将所述水不溶性稳定剂和双硫仑溶于有机溶剂中得到有机相，将所述有机相滴加到水中，得到前驱体溶液；当所述稳定剂为一种或几种水溶性稳定剂时，本发明优选将所述水溶性稳定剂溶于水中得到水相，将双硫仑溶于有机溶剂中得到有机相，将所述有机相滴加到所述水相中，得到前驱体溶液；当所述稳定剂为一种或几种水溶性稳定剂和一种或几种水不溶性稳定剂的混合物时，本发明优选将所述水溶性稳定剂溶于水中得到水相，将水不溶性稳定剂和双硫仑溶于有机溶剂中得到有机相，将所述有机相滴加到所述水相中，得到前驱体溶液。
本发明对于所述有机相的滴加速率没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的滴加速率即可，具体如逐滴加入。在本发明中，所述有机相的滴加过程优选在超声条件下进行；本发明对于所述超声没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的超声技术方案即可。在本发明中，所述超声温度优选为12～60℃，更优选为25～40℃。
得到前驱体溶液后，本发明去除所述前驱体溶液中的有机溶剂，得到双硫仑纳米粒混悬液。本发明对于去除所述前驱体溶液中有机溶剂的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的去除溶剂的技术方案即可，具体如离心或减压旋转蒸发。
得到双硫仑纳米粒混悬液后，去除其中的水后即得双硫仑纳米粒，本发明对于去除所述双硫仑纳米粒混悬液的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的去除溶剂的技术方案即可，具体如减压蒸干或冻干，实际使用过程中多采用双硫仑纳米粒混悬液，采用冻干等处理将其转换为固体形式后，更便于储存和运输。
本发明提供了上述技术方案所述双硫仑纳米粒或上述技术方案所述制备方法制备得到的双硫仑纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明中，所述抗肿瘤药物中双硫仑纳米粒的含量优选为5～95％，更优选为8～80％，进一步优选为40～50％。本发明对于所述抗肿瘤药物的剂型没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的剂型即可。
在本发明中，所述抗肿瘤药物的剂型优选包括固体剂型、半固体剂型、液体剂型或气体剂型，更优选包括但不限于片剂、弹丸剂、糖锭剂、胶囊剂、栓剂、乳膏剂、软膏剂、气雾剂、散剂、乳剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂或其它适于经直肠、鼻内、肺部、阴道内、外部(局部)、口服或肠胃外(包括皮下、植入、静脉内和肌内)给药的药物剂型。
在本发明中，所述注射剂中优选包括水相分散介质，所述水相分散介质优选为用高浓度的氯化钠、葡萄糖或磷酸缓冲液调成生理盐水(0.9％氯化钠)、5％葡萄糖或磷酸缓冲液(pbs溶液)生理等渗体系。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1双硫仑纳米粒的制备
制备例1.spc为载体，丙酮，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、5mg的spc溶于600μl丙酮中，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径187.2±4.2nm，pdi值为0.272±0.013。
制备例2.spc为载体，dmso，药载比＝1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、5mg的spc溶于800μl的dmso中，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，13000rpm离心除去有机溶剂，沉淀超声复溶，马尔文粒径仪测得平均粒径551.5±37.60nm，pdi值0.591±0.064。
制备例3.spc为载体，丙酮+乙醇，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取5mg的spc溶于200μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，继续超声10min，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径162.6±5.64nm，pdi值为0.214±0.014，表面电位-19.6mv。
制备例4.spc为载体，丙酮+乙醇，药载比1:2，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取10mg的spc溶于200μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径219.7±5.7nm，pdi值为0.212±0.016，表面电位-7.73mv。
制备例5.spc为载体，丙酮+乙醇，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于100μl丙酮，称取5mg的spc溶于100μl乙醇，两者混合均匀后，室温和800rpm搅拌下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径186.5±3.12nm，pdi值为0.201±0.016，表面电位-17.6mv。
制备例6.spc为载体，丙酮+乙醇，药载比2:1，浓度1mg/ml
称取10mg双硫仑溶于100μl丙酮，称取5mg的spc溶于100μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到10ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径226.2±5.79nm，pdi值为0.455±0.026，表面电位-20mv。
制备例7.spc为载体，丙酮+乙醇，药载比3:1，浓度1mg/ml
称取15mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取5mg的spc溶于200μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到15ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径351.8±56.15nm，pdi值为0.404±0.046，表面电位-22.6mv。
制备例8.spc为载体，丙酮+乙醇，药载比3:1，浓度1mg/ml
称取15mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取3mg的spc溶于100μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到15ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径122.7±3.051nm，pdi值为0.271±0.010。
制备例9.蛋黄卵磷脂epc为载体，丙酮，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、5mg的epc溶于600μl丙酮中，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径153.9±3.1nm，pdi值为0.198±0.011。
制备例10.epc为载体，丙酮+乙醇，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取5mg的epc溶于200μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，继续超声2min，40摄氏度减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径142.6±4.14nm，pdi值为0.137±0.012。
制备例11.epc为载体，丙酮+乙醇，药载比5:1，浓度1mg/ml
称取15mg双硫仑溶于300μl丙酮，称取3mg的epc溶于300μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到15ml去离子水中，继续超声2min，40摄氏度减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径297.3±8.31nm，pdi值为0.278±0.062。
制备例12.epc为载体，丙酮+乙醇，药载比10:1
称取30mg双硫仑溶于3ml丙酮，称取3mg的epc溶于2ml乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到30ml去离子水中，继续超声2min，40摄氏度减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径386.5±9.76nm，pdi值为0.381±0.085。
制备例13.氢化豆磷脂(hspc)为载体，丙酮+乙醇，药载比1:2，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取10mg的hspc溶于200μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径235.9±6.3nm，pdi值为0.235±0.023。
制备例14.氢化豆磷脂(hspc)为载体，丙酮+乙醇，药载比1:5，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于400μl丙酮，称取15mg的hspc溶于400μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径178.5±8.nm，pdi值为0.186±0.016。
制备例15.氢化蛋黄卵磷脂(hepc)为载体，丙酮+乙醇，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取5mg的hepc溶于200μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径245.1±5.7nm，pdi值为0.246±0.023。
制备例16.二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)为载体，丙酮+乙醇，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于300μl丙酮，称取5mg的dspc溶于300μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径252.3±5.3nm，pdi值为0.227±0.022。
制备例17.二油酰磷脂酰胆碱(dopc)为载体，丙酮+乙醇，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于200μl丙酮，称取5mg的dopc溶于200μl乙醇，两者混合均匀后，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径245.1±5.7nm，pdi值为0.246±0.023。
制备例18.tpgs为载体，丙酮，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、5mg的tpgs溶于200μl丙酮，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径159.1±1.82nm，pdi值为0.130±0.020，表面电位-25.3mv。
制备例19.tpgs为载体，丙酮，药载比1:1，浓度1mg/ml，水相滴注到有机相
称取5mg双硫仑、5mg的tpgs溶于200μl丙酮，室温和250w超声下将5ml去离子水缓慢滴注到丙酮溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径379.4±2.13nm，pdi值为0.286±0.098。
制备例20.tpgs为载体，丙酮，药载比1:9，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、45mg的tpgs溶于500μl丙酮，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径385.3±45.95nm，pdi值为.439±0.046。
制备例21.tpgs为载体，丙酮，药载比1:9，浓度1mg/ml，水相滴注到有机相
称取5mg双硫仑、45mg的tpgs溶于500μl丙酮，室温和250w超声下将5ml去离子水缓慢滴注到丙酮溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径127.8±7.12nm，pdi值为0.206±0.013。
制备例22.p188为载体，丙酮，药载比1:1，浓度1mg/ml，水相滴注到有机相
称取5mg双硫仑、5mg的p188溶于200μl丙酮，室温和250w超声下将5ml去离子水缓慢滴注到丙酮溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径465.3±29.81nm，pdi值为0.052±0.058，电位-13.7mv。
制备例23.p188为载体，丙酮，药载比1:9，浓度1mg/ml，水相滴注到有机相
称取5mg双硫仑、45mg的p188溶于500μl丙酮，室温和250w超声下将5ml去离子水缓慢滴注到丙酮溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径343.6±11.86nm，pdi值为0.194±0.016。
制备例24.p188为载体，丙酮，药载比1:9，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、45mg的p188溶于500μl丙酮，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径643.6±17.39nm，pdi值为0.212±0.044。
制备例25.pcl2000-mpeg2000为载体，丙酮，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、5mg的pcl2000-mpeg2000溶于500μl丙酮，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径833.8±21.46nm，pdi值为0.922±0.164。
制备例26.pcl4800-mpeg3000为载体，丙酮，药载比1:9，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、45mg的pcl4800-mpeg3000超声溶于500μl丙酮，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径153.4±68.19nm，pdi值为0.247±0.076。
制备例27.pcl4800-mpeg3000为载体，丙酮，药载比1:9，水相超声滴加到有机相
称取5mg双硫仑、45mg的pcl4800-mpeg3000超声溶于500μl丙酮，室温和250w超声下将5ml去离子水缓慢滴注到丙酮溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径191.2±1.68nm，pdi值为0.252±0.012。
制备例28.pla2000-mpeg2000为载体，丙酮，药载比1:1，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、5mg的pla2000-peg2000超声溶于400μl丙酮，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径284.4±9.03nm，pdi值为0.163±0.072，表面电位-0.166mv。放置三天后，粒径286.1±9.16nm，pdi值为0.213±0.049。
制备例29.pla5000-mpeg5000为载体，丙酮，药载比1:10，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑、50mg的pla5000-peg5000超声溶于500μl丙酮，室温和250w超声下缓慢滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径677.2±39.16nm，pdi值为0.963±0.156。
制备例30.油酸钠为载体，丙酮，药载比1:1
称取5mg双硫仑溶于0.2ml丙酮，另取5mg油酸钠溶于5ml去离子水，室温和250w超声下将丙酮溶液滴加到水相中，继续超声5分钟，减压旋转蒸发除去有机溶剂，过0.45μm微孔滤膜，马尔文粒径仪测得平均粒径491.5±28.34nm，pdi值为0.862±0.123，表面点诶-107mv。
制备例31.羟丙基-β-环糊精为载体，丙酮，药载比1:9
称取5mg双硫仑溶于0.5ml丙酮，另取45mg羟丙基-β-环糊精溶于5ml去离子水，室温和250w超声下将丙酮溶液滴加到水相中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，过0.45μm微孔滤膜，马尔文粒径仪测得平均粒径152.3±15.30nm，pdi值为0.535±0.119。
制备例32.羟丙基-β-环糊精载体，丙酮，药载比1:9，水相超声滴加到有机相
称取5mg双硫仑溶于0.5ml丙酮，另取45mg羟丙基-β-环糊精溶于5ml去离子水，室温和250w超声下滴注到丙酮溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径750.3±84.26nm，pdi值为0.621±0.034。
制备例33.羟丙基-β-环糊精饱和溶液，丙酮，搅拌下滴加，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于0.2ml丙酮，1500rpm搅拌下滴注到5ml饱和的羟丙基-β-环糊精溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径304.2±118.3nm，pdi值为0.459±0.033。
制备例34.羟丙基-β-环糊精饱和溶液，丙酮，超声下滴加，浓度1mg/ml
称取5mg双硫仑溶于0.2ml丙酮，室温和250w超声下滴注到5ml饱和的羟丙基-β-环糊精溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径14.43±7.26nm，pdi值为0.226±0.023。
制备例35.羟丙基-β-环糊精饱和溶液，丙酮，超声下滴加，浓度4mg/ml
称取20mg双硫仑溶于0.2ml丙酮，室温和250w超声下滴注到5ml饱和的羟丙基-β-环糊精溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径10.94±3.89nm，pdi值为0.198±0.008。
制备例36.spc+dspe-mpeg2000为载体，丙酮+乙醇，药载比2:1:1，2mg/ml
称取10mg双硫仑、5mg的dspe-mpeg2000超声溶于400μl丙酮中，另取5mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下滴注到5ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径438.4±9.79nm，pdi值为0.218±0.036，电位-15.5mv。
制备例37.spc+dspe-mpeg2000为载体，丙酮+乙醇，药载比3:3:1，1mg/ml
称取9mg双硫仑、3mg的dspe-mpeg2000超声溶于400μl丙酮中，另取9mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下滴注到9ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径426.5±9.12nm，pdi值为0.346±0.043，电位-1.38mv。
制备例38.spc+
称取10mg双硫仑、10mg的
制备例39.spc+
称取20mg双硫仑、4mg的
制备例40.spc+
称取10mg双硫仑、10mg的
制备例41.spc+
称取20mg双硫仑、4mg的
制备例42.spc+
称取10mg双硫仑、5mg的
制备例43.spc+tpgs为载体，丙酮+乙醇，药载比5:5:1，1mg/ml
称取20mg双硫仑、4mg的tpgs超声溶于400μl丙酮中，另取20mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下滴注到20ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒210±1.26nm，pdi值为0.249±0.039。
制备例44.spc+tpgs为载体，丙酮+乙醇，药载比24:20:4，1mg/ml
称取24mg双硫仑、4mg的tpgs超声溶于400μl丙酮中，另取20mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下滴注到24ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒205.9±2.37nm，pdi值为0.255±0.012。放置3天后，平均粒径159.8±2.97nm，pdi值为0.350±0.003。
制备例45.spc+tpgs为载体，丙酮+乙醇，药载比1:1:1，1mg/ml
称取10mg双硫仑、10mg的tpgs超声溶于400μl丙酮中，另取10mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下滴注到10ml去离子水中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径189.9±6.82nm，pdi值为0.255±0.009。
制备例46.spc+pla2000-peg2000为载体，丙酮+乙醇，药载比2:1:1，2mg/ml
称取10mg双硫仑、5mg的pla2000-peg2000超声溶于400μl丙酮中，另取5mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下滴注到5ml去离子水中，超声1min，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径265.2±1.02nm，pdi值为0.168±0.055，表面电位-0.197mv。
制备例47.spc+pla2000-peg2000为载体，丙酮+乙醇，药载比2:1:1，2mg/ml
称取10mg双硫仑、5mg的pla2000-peg2000超声溶于400μl丙酮中，另取5mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和800rpm搅拌下滴注到5ml去离子水中，超声1min，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径745.1±12.85nm，pdi值为0.457±0.027，表面电位-0.301mv。
制备例48.spc+pla2000-peg2000载体，丙酮+乙醇，药载比10:10:1，1mg/ml
称取20mg双硫仑、2mg的pla2000-peg2000超声溶于400μl丙酮中，另取20mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声滴注到20ml去离子水中，超声1min，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径197.9±1.56nm，pdi值为0.199±0.011，表面电位-0.133mv。
制备例49.spc+pla2000-peg2000载体，丙酮+乙醇，药载比10:10:1，1mg/ml
称取20mg双硫仑、1mg的pla2000-peg2000超声溶于400μl丙酮中，另取20mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声滴注到20ml去离子水中，超声1min，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪和电位仪测得平均粒径204.8±3.90nm，pdi值为0.216±0.054，表面电位-1.99mv。
制备例50spc+p188载体，药载比2:1:1，2mg/ml
称取10mg双硫仑、5mg的p188超声溶于400μl丙酮中，另取5mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下将5ml去离子水滴加到上述混合有机溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径324.5±13.40nm，pdi值为0.226±0.071。
制备例51spc+p188+pla2000-peg2000为载体：药载比＝2:1:1:1，2mg/ml
称取10mg双硫仑、5mg的p188、5mg的pla2000-peg2000超声溶于600μl丙酮中，另取5mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下将5ml去离子水滴加到上述混合有机溶液中，超声1min，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径273.0±3.20nm，pdi值为0.141±0.029。
制备例52spc+brij78+pla2000-peg2000为载体：药载比＝2:1:1:1，2mg/ml
称取10mg双硫仑、5mg的p188、5mg的brij78超声溶于600μl丙酮中，另取5mg的spc溶于200μl乙醇，混匀，室温和250w超声下将5ml去离子水滴加到上述混合有机溶液中，超声1min，减压旋转蒸发除去有机溶剂，马尔文粒径仪测得平均粒径121.9±0.64nm，pdi值为0.194±0.025。
实施例2双硫仑纳米粒的表征
参照制备例44的方法，取24mg双硫仑、4mgtpgs溶于0.5ml丙酮，另取20mg的spc溶于乙醇，将乙醇溶液和丙酮溶液混匀作为有机相，室温和250w超声条件下滴加到24ml去离子水中，37℃减压旋转蒸发蒸除去有机溶剂，得到双硫仑纳米粒(dsfnanoparticles,dsf-nps)分散体系。
本实施例制备的dsf-nps呈现乳白色，略带乳光。
(1)载药量测定：将双硫仑纳米粒冻干，取一定量的冻干粉末(质量记为w)加入一定体积的乙腈(体积记为v)溶解，13000r/min离心20min，取上清高效液相测定双硫仑的质量浓度(记为c)，平行3次实验，根据以下等式计算dsf-nps的药物负载量(dlc)：
载药量＝c·v/w×100％
结果显示，制备例5、18、19、44中的dsf-nps平均载药量分别为(44.36±1.09)％、(44.82±2.25)％、(45.16±1.87)％和(45.36±2.09)％，制备例8中的dsf-nps平均载药量为(69.76±3.79)％，和理论值75％比较接近。载药量是评价药物制剂质量优劣的重要参数，较高的载药量降低了使用大量辅料的安全隐患，提高了药物制剂的安全性。
(2)透射电镜观察形态：将dsf-nps稀释到浓度约100μg/ml，取6μl滴到300目铜网上，静置5min，用滤纸吸干多余液体，室温放置10min晾干，滴加6.0μl质量浓度为2％的醋酸铀于铜网上染色90s，用滤纸吸去多余液体，室温自然晾干，透射电镜下加速电压为120kv观察双硫仑纳米粒的形态和大小。
图2a图2b分别为制备例3(spc为载体)和制备例44(spc和tpgs为载体)双硫仑纳米粒的透射电镜形貌图，结果显示，所述双硫仑纳米粒的粒径分布均匀，呈球形，粒径大约在100nm左右，比动态光散射法测得的粒径略小。原因是透射电镜中检测的是干燥之后双硫仑纳米粒的粒径，而动态光散射法检测的是双硫仑纳米粒的水化半径，所以检测方法针对对象的差异导致两种方法检测结果不一致。
(3)在生理介质中的稳定性考察
配制人工胃液：含1％胃蛋白酶的1mol/l的稀盐酸；
配制人工肠液：含1％胰蛋白酶的ph值为6.8的pbs(0.01m)缓冲液。
将制备的dsf-nps分别与质量浓度为1.8％的nacl溶液、10％的葡萄糖和二倍浓度的pbs缓冲液(0.02m)等体积混合，与血浆、人工胃液和人工肠液按1:4(v/v)混合，37℃孵育8h，特定时间点测双硫仑纳米粒的粒径，每个样品重复3次。
图3a图3b分别为制备例3(spc为载体)和制备例44(spc和tpgs为载体)双硫仑纳米粒在不同生理介质种37℃孵育8h过程中粒径和pdi变化图(mean±sd，n＝3)，结果显示，两个制备例的双硫仑纳米粒在37℃与生理盐水、5％葡萄糖、pbs、人工胃液、人工肠液、血浆中孵育8h的过程中均未出现粒径增大的情况，说明双硫仑纳米粒除满足口服给药的稳定性要求之外，还可以调制成等渗溶液用于静脉注射给药。
(4)纳米粒对双硫仑化学降解的保护作用
纯水中的降解保护:取10mg双硫仑溶于200ul的dmso，加去离子水稀释至10ml，配制得到1mg/ml的双硫仑母液。取双硫仑母液50ul加入950ul甲醇振摇，13000rpm离心10min，分离上清，取适量上清用hplc测定双硫仑浓度。剩余的母液在37℃、100rpm连续搅拌，在0h、6h、24h、48h、72h、96h取样同上处理以hplc测量dsf浓度，与初始dsf的浓度对比计算dsf剩余百分比，对相应的时间作图，绘制双硫仑药物在纯水中的降解曲线。
将制备例3和制备例44中双硫仑纳米粒分别以去离子水稀释到1mg/ml，同上法绘制双硫仑纳米粒在纯水中的降解曲线。
在含10％胎牛血清的pbs中的降解保护:取10mg双硫仑药物溶于200ul的dmso，用含10％胎牛血清的pbs稀释至10ml，取50ul稀释液加入950ul甲醇，13000rpm离心10min，分离上清，取适量用hplc测体系中双硫仑的初始浓度。剩余的稀释液在37℃、100rpm连续搅拌，在0h、6h、24h、48h、72h、96h同上取样加19倍体积的甲醇振摇、离心，取上清以hplc测量双硫仑浓度，同上绘制dsf在10％胎牛血清的降解曲线。
将制备例3和制备例44中双硫仑纳米粒分别以含10％胎牛血清的pbs配制成双硫仑理论浓度为1mg/ml的体系，同法绘制双硫仑纳米粒在10％胎牛血清中的降解曲线。
由双硫仑在纯水中的降解曲线(图4)可知，游离的双硫仑在水中快速降解，在6h后仅剩余45％，48h后剩余不到25％；而两种纳米粒均能显著减少所包封的双硫仑药物的分解，在48h超过70％的dsf仍然存在(图4a和图4b)。由双硫仑在含10％胎牛血清的pbs中的降解曲线(图5)可知，游离双硫仑6h后剩余43％，48h后剩余不到20％；而同样条件下dsf-nps在24h时仍有70％双硫仑存在，在24h后才发生明显降解(图5a和图5b)。综上分析认为，游离的双硫仑在液体分散介质和体液中很快发生讲解，而纳米粒包封可以显著提高双硫仑的稳定性；同时提示双硫仑纳米粒制备完成之后，也应该尽快转化成固态(如冻干)保存。
(5)双理论纳米粒的体外药物释放
将实施例3和实施例44中的双硫仑纳米粒2ml(双硫仑浓度2mg·ml-1)分别装入透析袋(mwco:8000～14000)中，密封，浸入50ml含有1％聚山梨醇酯80的磷酸盐缓冲液pb(0.01mol·l-1，ph7.4)中，37℃、150r·min-1连续搅拌，在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120和144h时间点取释放外液1ml，并补充相同体积的新鲜释放介质，每24h更换1次释放外液。根据释放外液中dsf的增加计算nsps的累积释放，平行3份实验。同时精密称取双硫仑原料药物10mg，在超声辅助下均匀分散在0.4％羧甲基纤维素钠10ml中,以制备双硫仑混悬液,用hplc测定实际浓度，并采用上述方法测定双硫仑混悬液的累计释放，平行3份实验。
结果如图6所示，可知两种纳米粒(dsf-spc-nps和dsf-spc-tpgs)在24h内呈相对快速释放，累积药物释放达约25％，之后释放趋缓慢，在168h累计释放(42.26±2.35)％。而dsf混悬液(0.4％cmc)释放缓慢，在24h累计药物释放约13.61％，168h累计释放仅为(15.76±2.48)％。
实施例3双硫仑纳米粒对肿瘤细胞的体外杀伤
将4t1细胞培养至对数期，制备成单细胞悬液，按照1×104个/孔(150μl)的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养过夜，倒置显微镜下观察到细胞贴壁后，弃上清，分别加入150μldsf浓度分别为100、50、25、10、5、1、0.1、0.05、0.01μg/ml的dsf-nps(由dsf-nps用不完全培养基稀释而成)和dsf游离药物(由dmso溶液用不完全培养基稀释而成)，放入培养箱中培养48h，每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，37℃、5％co2继续孵育4h，终止培养，弃上清，每孔加200μldmso，振荡，使用酶标仪在570nm吸收波长处测定其吸光度值(dsf)，用下式计算细胞存活率：
细胞存活率＝od值实验组/od值对照组×100％
通过graphpadprism5软件计算细胞的ic50值，使用ibmspssstatistics19软件分析统计学差异。
图7a、图7b是分别为制备例3(spc为载体)和制备例44(spc和tpgs为载体)双硫仑纳米粒给药48h后在不同浓度时对4t1细胞的抑制率柱状图。由图可知，两个制备例的双硫仑纳米粒和dmso溶液均可抑制4t1细胞的增殖，并且呈现剂量依赖关系；但在所有给药浓度，两种纳米粒对4t1细胞的抑制率都显著高于dsf游离药物)(p<0.01)。经计算可知，制备例3、制备例44的双硫仑纳米粒对乳腺癌4t1细胞的ic50分别为1.23、1.069μg·ml-1，均显著低于相应实验中的双硫仑dmso溶液的ic50值(5.61μg·ml-1、5.526μg·ml-1，p值分别＜0.05和0.01),说明纳米粒包封之后对肿瘤细胞呈现出更强的生长抑制作用。这既有纳米粒包封的保护作用减少了dsf-nps中dsf的降解之故，也有载药纳米粒提高了细胞对药物摄取的因素。
实施例4双硫仑纳米粒对4t1荷瘤鼠的药效和体内组织分布
(1)近红外探针标记的双硫仑纳米粒的制备：参照制备例3，取20mg双硫仑溶于0.5ml丙酮，另取20mg的spc和0.5mg近红外探针dir溶解于0.5ml乙醇中，将乙醇溶液和丙酮溶液混匀作为有机相，在室温和250w超声条件下将所述有机相滴加到15ml水中，37℃加压旋蒸除去有机溶剂，得到dir标记的双硫仑纳米粒(dir-dsf-spc-nps)分散体系。
采用zetasizernanozs型粒度仪，通过动态光散射(dynamiclightscattering，dls)原理，在25℃条件下测定所述dir-dsf-nps的粒径分布及zeta电位，每份样品平行测定3次。
(2)4t1荷瘤小鼠模型建立：于体外培养4t1细胞至对数生长期，用胰酶将贴壁细胞消化，取健康babl/c小鼠(6周龄，雌性)，于每只小鼠右侧腋窝皮下接种4t1乳腺癌瘤细胞悬液0.2ml(细胞悬液的浓度为8.0×105/小鼠)，定期测量肿瘤体积(v＝ab2/2；a为长边，b为短边)，待肿瘤体积达到100mm3左右时，筛选肿瘤大小相对一致的64只小鼠对dsf-spc纳米粒进行实验，另选肿瘤大小相对一致的64只小鼠对dsf-spc-tpgs纳米粒进行实验。
(3)实验分组和给药
dsf-spc纳米粒药效实验：将筛选出来的荷瘤小鼠随机分成7组，每组7只，除正常饮食外，按照以下分组，静脉注射(i.v.)每2天给药一次，灌胃(i.g.)每天给药，实验时长12天。dsf-spc纳米粒参照实施例3制备。
1)dsf-spc-nps20mg/kg，i.v.
2)dsf-spc-nps10mg/kg，i.v.
3)dsf-spc-nps5mg/kg，i.v.
4)dsf-spc--nps20mg/kg，i.g.
5)dsfsuspensions20mg/kg，i.g.(dsf分散于0.4％羧甲基纤维素钠溶液中)
6)阳性对照(广谱抗癌药市售紫杉醇(ptx)注射液8mg/kg，i.v.)
7)阴性对照(生理盐水(saline)0.2ml/只，i.v.)
dsf-spc-tpgs纳米粒药效实验：将筛选出来的荷瘤小鼠随机分成7组，每组7只，除正常饮食外，按照以下分组，静脉注射(i.v.)每2天给药一次，灌胃(i.g.)每天给药。dsf-spc-tpgs纳米粒参照实施例44制备。
1)dsf-spc-tpgs纳米粒20mg/kg，i.v.
2)dsf-spc-tpgs纳米粒10mg/kg，i.v.
3)dsf-spc-tpgs纳米粒5mg/kg，i.v.
4)dsf-spc-tpgs纳米粒20mg/kg，i.g.
5)dsfsuspensions20mg/kg，i.g.(dsf分散于0.4％羧甲基纤维素钠溶液中)
6)阳性对照(广谱抗癌药市售紫杉醇(ptx)注射液8mg/kg，i.v.)
7)阴性对照(生理盐水(saline)0.2ml/只，i.v.)
(4)考察指标：每天观察小鼠有无异常及死亡情况；每两天测一次每组小鼠的体重和肿瘤体积(v＝ab2/2；a为长边，b为短边)。给药第12天脱颈椎处死小鼠，解剖小鼠获取各组肿瘤并按下式计算抑瘤率：
抑瘤率＝(1-给药组瘤重/生理盐水组瘤重)×100％
同时将小鼠解剖出肝脏、脾脏并称重，按下式计算各组小鼠的肝、脾指数，以考察肝、脾损伤情况：
肝指数＝肝重/体重
脾指数＝脾重/体重
(5)组织分布研究及结果：在dsf-spc纳米粒药效实验中，对高剂量组荷瘤小鼠，在最后一次给药时单次尾静脉注射dir标记的dsf-spc-nps(dsf剂量为20mg/kg，n＝8)，于24h处死动物，解剖主要脏器荧光拍照。
图8为给药12h后dir-dsf-spc-nps在4t1荷瘤小鼠主要脏器分布图(n＝7)，从左至右依次为肿瘤、心、肝、脾、肺、肾和脑，结果显示，dsf-spc-nps在各组织中的浓度由高到低顺次为：肝>脾>肿瘤>肾>心，可以看出nps在小鼠体内主要集中在肝、脾、肿瘤。荧光在小鼠的肿瘤与肝的荧光强度比值为20.28±4.37％，说明nps具有一定的被动靶向特性，可以通过epr效应到达肿瘤部位。
(5)抗肿瘤药效学研究结果
图9a和图9b分别为制备例3中dsf-spc纳米粒和制备例44中dsf-spc-tpgs纳米粒药效学研究中小鼠肿瘤体积随时间变化曲线，图10a和图10b分别为制备例3中dsf-spc纳米粒和制备例44中dsf-spc-tpgs纳米粒药效学研究中各组小鼠体重随时间变化的曲线，图11和图12分别为制备例3中dsf-spc纳米粒和制备例44中dsf-spc-tpgs纳米粒药效学研究结束后对各组小鼠解剖所得的肿瘤组织实物图。表1和表2为分别为制备例3中dsf-spc纳米粒和制备例44中dsf-spc-tpgs纳米粒药效学研究结束时各组小鼠瘤重、抑瘤率、肝指数、脾指数等数据。
图9显示，生理盐水组肿瘤体积迅速增加，两周后达到2500mm3，双硫仑物理混悬液几乎没有观察到抗肿瘤作用(图9a)。
dsf-spc-nps无论静脉注射还是口服给药中均表现出显着的肿瘤生长抑制作用(相对于生理盐水，p<0.05)。dsf-nps以20mg/kg每天口服给药，其肿瘤体积随时间的变化和肿瘤抑制率均与8mg/kg的紫杉醇注射液(隔天给药)相差无几(抑瘤率59.03％vs55.01％)。静脉注射对肿瘤的抑制作用更好，20mg/kg的剂量隔天给药的肿瘤抑制率达到了80.22％，同时具有良好的量效关系(中、低浓度肿瘤抑制率分别为75.14％和66.10％)(表1)。
表1dsf-spc纳米粒对4t1荷瘤鼠抗肿瘤药效数据
(*p<0.05，**p<0.01vs生理盐水组；#p<0.05，##p<0.01vs空白纳米粒组；&p<0.05，&&p<0.01vs紫杉醇注射液组；$p<0.05，$$p<0.01vs5mg/kg的dsf-spc纳米粒组)
dsf-spc-tpgs-nps无论静脉注射还是口服给药中也均表现出显着的肿瘤生长抑制作用(相对于生理盐水，p<0.05)。dsf-nps以20mg/kg每天口服给药，其肿瘤体积随时间的变化和肿瘤抑制率均与8mg/kg的紫杉醇注射液(隔天给药)相差无几(抑瘤率57.06％vs55.01％)。dsf-spc-tpgs-nps静脉注射对肿瘤的抑制作用更好，20mg/kg的剂量隔天给药，肿瘤抑制率达到了80％，同时具有良好的量效关系(中、低浓度肿瘤抑制率分别为74.86％和69.20％)(表2)。
表2dsf-spc-tpgs纳米粒对4t1荷瘤鼠抗肿瘤药效数据
tumorweightresultsarepresentedasmean±sd,n＝8；**p<0.05vs.生理盐水；##p<0.05vs.空白纳米粒；&&p<0.05vs.紫杉醇注射液:$$p<0.05vs.5mg/kg的dsf-spc-tpgs-nps
从体重随时间变化曲线(图10)可知，在整个实验过程中，各组小鼠平均体重比较稳定，并略有上升；肝、脾脏指数的数据(表1和表2)也显示，各给药组与生理盐水组无显着差异(p>0.05)，提示各给药组小鼠的肝和脾未产生严重损伤，dsf-spc-nps和dsf-spc-tpgs-nps毒性小，生物安全性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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