本发明属于辣木叶深加工、高值化领域，涉及一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/l，女性高于360μmol/l即称为高尿酸血症。痛风是在高尿酸血症的生化基础上发展而成的一种代谢性疾病，高尿酸血症是痛风的重要生化基础，也是引起痛风性关节炎、痛风性肾病和痛风石沉积的原因。除此之外，高尿酸血症与高血压、高血脂、肥胖病症、冠状动脉疾病等相关，是上述病症的关键风险因素。随着人民生活水平的进一步提高，高尿酸血症和痛风的发病率逐渐上升，发病年龄提前。目前，我国成人高尿酸血症发病率为18％，痛风发病率约为2％，且正以9.7％的年增长率迅速增加。因此，开发具有降尿酸活性、毒副作用低的保健食品与药品具有显著的社会经济效益。
辣木(moringaoleiferalam.)，是一种辣木科辣木属热带落叶木本植物，在我国广东、广西、海南、四川和云南等地大规模种植，已形成了规模化的原料种植基地。辣木叶于2012年被批准为新资源食品，其营养成分丰富，蛋白质含量为27％左右，总糖含量为15％左右，除此之外，还含有多酚，类固醇，生物碱等活性成分，具有较大的开发潜力。近年的研究发现，辣木叶具有抗炎、抗氧化、抑菌等作用。
然而，关于具有降尿酸活性的辣木叶提取物的相关报道较少。本发明提供了一种辣木叶提取物的制备方法，并通过动物模型验证其体内降尿酸活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物及其制备方法，得到具有良好降尿酸活性的辣木叶提取物。该提取物通过动物实验验证具有良好的降尿酸功效。本发明提取工艺简单、整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。
本发明的技术方案如下。
一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物的制备方法，将新鲜辣木叶微波干燥后粉碎过筛，采用水-乙醇回流提取，有针对性地提取辣木叶中酚类物质，离心后，上清液减压浓缩得醇提取物；剩余残渣烘干后，使用碱法热处理、蛋白酶酶解、高速离心去渣、上清液超滤去杂、二次蛋白酶酶解、高速离心、上清液减压浓缩、醇沉去杂、二次减压浓缩，有针对性地提取辣木叶中多肽类物质，最后复配加入醇提取物，喷雾干燥，得到一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物，该提取物酚类物质含量>10％，肽类物质含量＞40％，在动物水平上具有良好的降尿酸功效。
本发明技术方案包括如下具体步骤：
(1)微波干燥：将新鲜辣木叶微波干燥，得到干辣木叶；
(2)粉碎过筛：将步骤(1)所得干辣木叶粉碎后过筛，得到辣木叶干粉；
(3)水-乙醇回流提取：将步骤(2)所得辣木叶干粉与一定浓度的乙醇水溶液混合，匀速搅拌，加热回流提取，离心，取上清液得提取液1，沉淀烘干得残渣1；
(4)减压浓缩：将提取液1减压浓缩，得醇提取液2；
(5)碱法热处理：将残渣1与去离子水混合，进行第一次搅拌，加入氢氧化钠调节ph，进行第二次加热搅拌，得混悬液1；
(6)蛋白酶酶解：在混悬液1中加入蛋白酶，恒温搅拌进行酶解，灭酶，得混悬液2；
(7)高速离心：混悬液2高速离心后，取上清液得提取液3；
(8)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液3，弃去大分子截留液，取小分子滤出液，得提取液4，减压浓缩得提取液5；
(9)二次蛋白酶酶解：在提取液5中加入蛋白酶，恒温搅拌进行酶解，灭酶，得混悬液3；
(10)高速离心：混悬液3高速离心后，取上清液得提取液6；
(11)减压浓缩：将提取液6减压浓缩，得提取液7；
(12)醇沉去杂：向提取液7中加入预冷的无水乙醇，匀速搅拌后，离心，取上清液得提取液8；
(13)二次减压浓缩：将提取液8减压浓缩，得酶解提取液9；
(14)复配：将步骤(4)所得醇提取液2和步骤(13)所得酶解提取液9混合，加热搅拌，得混合提取液10；
(15)喷雾干燥：将混合提取液10进行喷雾干燥，得辣木叶提取物。
进一步地，步骤(1)中，所述微波干燥时间1～3min，功率为400～600w。
进一步地，步骤(2)中，所述过筛是过40目筛。
进一步地，步骤(3)中，所述乙醇水溶液中乙醇浓度为60～80vol％，辣木叶干粉与乙醇水溶液的料液比为1:6～10g/ml，搅拌速率为120～180r/min，回流温度为80～90℃，回流时间为1～3h，所述离心为4000～6000g离心20～30min，残渣的烘干温度为50～60℃。
进一步地，步骤(4)中，所述减压浓缩温度为50～60℃，浓缩液中固形物含量为30～40wt％。
进一步地，步骤(5)中，所述残渣1与去离子水料液比为1:8～1:16g/ml，第一次搅拌时间为15～25min，所述ph值为7.0～8.0，两次搅拌速率均为120～180r/min，第二次搅拌时间为20～40min，第二次搅拌温度为50～60℃。
进一步地，步骤(6)中，所述蛋白酶的加入量为残渣质量的2～5％，蛋白酶为碱性蛋白酶和复合蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量占总酶量的50～70％，复合蛋白酶的加入量占总酶量的30～50％，所述碱性蛋白酶为诺维信型号为ns37071的蛋白酶，复合蛋白酶为诺维信公司的复合蛋白酶(protamex)，所述酶解温度为52～58℃，酶解时间为8～16h，搅拌速率为120～180r/min，所述灭酶是在90～96℃灭酶20-30min。
进一步地，步骤(7)，(10)中，所述高速离心为6000～8000g离心15～25min。
进一步地，步骤(8)中，所述超滤除杂的超滤膜分子量为10000da，超滤次数为4～6次，所述提取液4为分子量＜10000da的超滤滤出液，所述减压浓缩温度为50～60℃，提取液5中固形物含量为8～10wt％。
进一步地，步骤(9)中，所述蛋白酶的加入量为提取液5固形物含量的3～6％，蛋白酶为胰酶和复合蛋白酶，胰酶的加入量占总酶量的60～80％，复合蛋白酶的加入量占总酶量的20～40％，所述胰酶为南宁庞博生物工程公司的胰酶，复合蛋白酶为诺维信公司的复合蛋白酶(protamex)。所述酶解温度为40～50℃，酶解时间为2～4h，搅拌速率为120～180r/min，所述灭酶是在90～96℃灭酶20-30min。
进一步地，步骤(11)，(13)中，所述减压浓缩温度为50～60℃，浓缩液中固形物含量为30～40wt％。
进一步地，步骤(12)中，所述预冷的无水乙醇为预冷至4～8℃的无水乙醇，无水乙醇的加入量为使体系中乙醇含量达到10～20wt％，所述匀速搅拌为室温下120～180r/min转速搅拌3～5h，所述高速离心为6000～8000g离心20～30min。
进一步地，步骤(14)中，所述搅拌速率为120～180r/min，搅拌时间为30～50min，温度为65～85℃。
本发明提供了一种由上述方法制备的具有降尿酸活性的辣木叶提取物。
本发明还提供了一种所述辣木叶提取物在制备降尿酸保健品和药品中的应用。
本发明具有如下优点和效果：
(1)本发明的制备方法制备得到一种主要含辣木叶多酚和多肽的具有良好降尿酸作用的辣木叶提取物，该提取物酚类物质含量>10％，肽类物质含量＞40％。
(2)本发明的整个制备工艺流程均可达食品级要求。
(3)本发明所得辣木叶提取物经过高尿酸血症大鼠动物实验模型验证具有良好的降尿酸活性，能够有效地降低高尿酸血症大鼠的血清尿酸含量。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面将具体阐明动物实验的具体操作和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)微波干燥：微波功率400w下，将新鲜辣木叶微波干燥1min，得到干辣木叶。
(2)粉碎过筛：将步骤(1)所得干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉。
(3)水-乙醇回流提取：将步骤(2)所得辣木叶干粉与乙醇浓度为60vol％的乙醇水溶液按料液比1:6g/ml混合，120r/min匀速搅拌条件下，80℃下回流提取1h，4000g离心20min，取上清液得提取液a11，50℃烘干沉淀得残渣b11。
(4)减压浓缩：将提取液a11在50℃下减压浓缩至固形物含量为30wt％，得醇提取液a12。
(5)碱法热处理：将残渣b11与去离子水按料液比1:8g/ml混合，120r/min匀速搅拌15min，加入氢氧化钠调节ph值至7.0，50℃下120r/min匀速搅拌20min，得混悬液c11。
(6)蛋白酶酶解：在混悬液c11中加入蛋白酶，加入量为残渣b11质量的2％，诺维信公司的碱性蛋白酶ns37071的加入量占总酶量的50％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的50％，52℃下120r/min匀速搅拌，酶解8h，90℃灭酶20min，得混悬液c12。
(7)高速离心：混悬液c12采用6000g离心15min后，取上清液得提取液a13。
(8)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液a13，超滤膜分子量为10000da,超滤次数为4次，弃去大分子截留液，取小分子滤出液，得提取液a14，50℃减压浓缩，得固形物含量为8wt％的提取液a15。
(9)二次蛋白酶酶解：在提取液a15中加入蛋白酶，加入量为提取液a15固形物含量的3％，南宁庞博生物工程公司的胰酶的加入量占总酶量的60％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的40％，40℃下120r/min匀速搅拌，酶解2h，90℃灭酶20min，得混悬液c13。
(10)高速离心：混悬液c13采用6000g离心15min后，取上清液，得提取液a16。
(11)减压浓缩：将提取液a16在50℃下减压浓缩至固形物含量为30wt％，得提取液a17。
(12)醇沉去杂：向提取液a17中加入预冷至4℃的无水乙醇，使体系中的乙醇含量达到10wt％，120r/min匀速搅拌3h后，6000g离心20min，取上清液得提取液a18。
(13)二次减压浓缩：将提取液a18在50℃下减压浓缩至固形物含量为30wt％，得酶解提取液a19。
(14)复配：将步骤(4)所得醇提取液a12和步骤(13)所得酶解提取液a19在65℃下，120r/min匀速搅拌30min，得混合提取液a110。
(15)喷雾干燥：将混合提取液a110进行喷雾干燥，得辣木叶提取物1，酚类化合物含量为11.4％，肽类物质含量为42.9％。
实施例2
一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)微波干燥：微波功率500w下，将新鲜辣木叶微波干燥2min，得到干辣木叶。
(2)粉碎过筛：将步骤(1)所得干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉。
(3)水-乙醇回流提取：将步骤(2)所得辣木叶干粉与乙醇浓度为70vol％的乙醇水溶液按料液比1:8g/ml混合，150r/min匀速搅拌条件下，85℃下回流提取2h，5000g离心25min，取上清液得提取液a21，55℃烘干沉淀得残渣b21。
(4)减压浓缩：将提取液a21在55℃下减压浓缩至固形物含量为35wt％，得醇提取液a22。
(5)碱法热处理：将残渣b21与去离子水按料液比1:12g/ml混合，150r/min匀速搅拌20min，加入氢氧化钠调节ph值至7.5，55℃下150r/min匀速搅拌30min，得混悬液c21。
(6)蛋白酶酶解：在混悬液c21中加入蛋白酶，加入量为残渣b21质量的3.5％，诺维信公司的碱性蛋白酶ns37071的加入量占总酶量的60％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的40％，55℃下150r/min匀速搅拌，酶解12h，93℃灭酶25min，得混悬液c22。
(7)高速离心：混悬液c22采用7000g离心20min后，取上清液得提取液a23。
(8)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液a23，超滤膜分子量为10000da,超滤次数为5次，弃去大分子截留液，取小分子滤出液，得提取液a24，55℃减压浓缩，得固形物含量为9wt％的提取液a25。
(9)二次蛋白酶酶解：在提取液a25中加入蛋白酶，加入量为提取液a25固形物含量的4.5％，南宁庞博生物工程公司的胰酶的加入量占总酶量的70％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的30％，45℃下150r/min匀速搅拌，酶解3h，93℃灭酶25min，得混悬液c23。
(10)高速离心：混悬液c23采用7000g离心20min后，取上清液，得提取液a26。
(11)减压浓缩：将提取液a26在55℃下减压浓缩至固形物含量为35wt％，得提取液a27。
(12)醇沉去杂：向提取液a27中加入预冷至6℃的无水乙醇，使体系中的乙醇含量达到15wt％，150r/min匀速搅拌4h后，7000g离心25min，取上清液得提取液a28。
(13)二次减压浓缩：将提取液a28在55℃下减压浓缩至固形物含量为35wt％，得酶解提取液a29。
(14)复配：将步骤(4)所得醇提取液a22和步骤(13)所得酶解提取液a29在75℃下，150r/min匀速搅拌40min，得混合提取液a210。
(15)喷雾干燥：将混合提取液a210进行喷雾干燥，得辣木叶提取物2，酚类化合物含量为10.7％，肽类物质含量为45.3％。
实施例3
一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)微波干燥：微波功率600w下，将新鲜辣木叶微波干燥3min，得到干辣木叶。
(2)粉碎过筛：将步骤(1)所得干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉。
(3)水-乙醇回流提取：将步骤(2)所得辣木叶干粉与乙醇浓度为80vol％的乙醇水溶液按料液比1:10g/ml混合，180r/min匀速搅拌条件下，90℃下回流提取3h，6000g离心30min，取上清液得提取液a31，60℃烘干沉淀得残渣b31。
(4)减压浓缩：将提取液a31在60℃下减压浓缩至固形物含量为40wt％，得醇提取液a32。
(5)碱法热处理：将残渣b31与去离子水按料液比1:16g/ml混合，180r/min匀速搅拌25min，加入氢氧化钠调节ph值至8.0，60℃下180r/min匀速搅拌40min，得混悬液c31。
(6)蛋白酶酶解：在混悬液c31中加入蛋白酶，加入量为残渣b31质量的5％，诺维信公司的碱性蛋白酶ns37071的加入量占总酶量的70％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的30％，58℃下180r/min匀速搅拌，酶解16h，96℃灭酶30min，得混悬液c32。
(7)高速离心：混悬液c32采用8000g离心25min后，取上清液得提取液a33。
(8)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液a33，超滤膜分子量为10000da,超滤次数为6次，弃去大分子截留液，取小分子滤出液，得提取液a34，60℃减压浓缩，得固形物含量为10wt％的提取液a35。
(9)二次蛋白酶酶解：在提取液a35中加入蛋白酶，加入量为提取液a35固形物含量的6％，南宁庞博生物工程公司的胰酶的加入量占总酶量的80％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的20％，50℃下180r/min匀速搅拌，酶解4h，96℃灭酶30min，得混悬液c33。
(10)高速离心：混悬液c33采用8000g离心25min后，取上清液，得提取液a36。
(11)减压浓缩：将提取液a36在60℃下减压浓缩至固形物含量为40wt％，得提取液a37。
(12)醇沉去杂：向提取液a37中加入预冷至8℃的无水乙醇，使体系中的乙醇含量达到20wt％，180r/min匀速搅拌5h后，8000g离心30min，取上清液得提取液a38。
(13)二次减压浓缩：将提取液a38在60℃下减压浓缩至固形物含量为40wt％，得酶解提取液a39。
(14)复配：将步骤(4)所得醇提取液a32和步骤(13)所得酶解提取液a39在85℃下，180r/min匀速搅拌50min，得混合提取液a310。
(15)喷雾干燥：将混合提取液a310进行喷雾干燥，得辣木叶提取物3，酚类化合物含量为10.3％，肽类物质含量为44.1％。
对比例4
一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)微波干燥：微波功率600w下，将新鲜辣木叶微波干燥3min，得到干辣木叶。
(2)粉碎过筛：将步骤(1)所得干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉。
(3)水-乙醇回流提取：将步骤(2)所得辣木叶干粉与乙醇浓度为80vol％的乙醇水溶液按料液比1:10g/ml混合，180r/min匀速搅拌条件下，90℃下回流提取3h，6000g离心30min，取上清液得提取液a41。
(4)减压浓缩：将提取液a41在60℃下减压浓缩至固形物含量为40wt％，得醇提取液a42。
(5)喷雾干燥：将混合提取液a42进行喷雾干燥，得辣木叶提取物4，酚类化合物含量为23.8％。
对比例5
一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)微波干燥：微波功率600w下，将新鲜辣木叶微波干燥3min，得到干辣木叶。
(2)粉碎过筛：将步骤(1)所得干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉。
(3)碱法热处理：将辣木叶干粉与去离子水按料液比1:16g/ml混合，180r/min匀速搅拌25min，加入氢氧化钠调节ph值至8.0，60℃下180r/min匀速搅拌40min，得混悬液c51。
(4)蛋白酶酶解：在混悬液c51中加入蛋白酶，加入量为辣木叶干粉质量的5％，诺维信公司的碱性蛋白酶ns37071的加入量占总酶量的70％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的30％，58℃下180r/min匀速搅拌，酶解16h，96℃灭酶30min，得混悬液c52。
(5)高速离心：混悬液c52采用8000g离心25min后，取上清液得提取液a53。
(6)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液a53，超滤膜分子量为10000da,超滤次数为6次，弃去大分子截留液，取小分子滤出液，得提取液a54，60℃减压浓缩，得固形物含量为10wt％的提取液a55。
(7)二次蛋白酶酶解：在提取液a55中加入蛋白酶，加入量为提取液a55固形物含量的6％，南宁庞博生物工程公司的胰酶的加入量占总酶量的80％，诺维信公司的复合蛋白酶的加入量占总酶量的20％，50℃下180r/min匀速搅拌，酶解4h，96℃灭酶30min，得混悬液c53。
(8)高速离心：混悬液c53采用8000g离心25min后，取上清液，得提取液a56。
(9)减压浓缩：将提取液a56在60℃下减压浓缩至固形物含量为40wt％，得提取液a57。
(10)醇沉去杂：向提取液a57中加入预冷至8℃的无水乙醇，使体系中的乙醇含量达到20wt％，180r/min匀速搅拌5h后，8000g离心30min，取上清液得提取液a58。
(11)二次减压浓缩：将提取液a58在60℃下减压浓缩至固形物含量为40wt％，得酶解提取液a59。
(12)喷雾干燥：将混合提取液a59进行喷雾干燥，得辣木叶提取物5，酚类化合物含量为2.9％，肽类物质含量为37.4％。
高尿酸血症大鼠模型的实验研究：
(1)实验动物：雄性sd大鼠，21d龄，100～110g，购于广东省医学实验动物中心。
(2)动物饲养环境：室温22±2℃，相对湿度50％～70％，每日光照黑暗各12小时，饮用水采用反渗透紫外灭菌水。
(3)动物实验：适应性饲养7天结束后，随机分为实验组、正常组(12只)。实验组大鼠每天灌胃氧嗪酸钾(2g/kg)，7天后，腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg体重)麻醉，眼眶后静脉丛采血，4℃、3000g离心15min取上层血清测定尿酸含量，正常组大鼠灌胃等容积的溶媒。将尿酸含量＞110μm的大鼠确定为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型对照组，别嘌呤醇组(25mg/kg)，辣木叶提取物1组(500mg/kg)、辣木叶提取物2组(500mg/kg)、辣木叶提取物3组(500mg/kg)，辣木叶提取物4组(500mg/kg)和辣木叶提取物5组(500mg/kg)，每组12只，灌胃给药(给药容积10ml/kg)，模型大鼠给予等容积的蒸馏水。连续处理30天。药物处理第15、30天，腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，眼眶后静脉丛采血，4℃、3000g离心15min取上层血清测定尿酸含量。血清尿酸严格按照尿酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明进行操作和测定。
动物实验结果分析
表1辣木叶提取物对高尿酸血症大鼠血清尿酸水平的影响
不同字母表示同一时期组间具有显著性差异p＜0.05，相同字母表示组间没有显著性差异p＞0.05
由表1可知，在造模后，模型组、别嘌呤醇组和5个辣木叶提取物组的大鼠血清尿酸水平要显著高于正常组(n＝12，p＜0.05)，且四组的血清尿酸水平无显著性差异(n＝12，p＞0.05)。在给药15天和30天时，别嘌呤醇组和5个辣木叶提取物组的尿酸水平均显著低于模型组(n＝12，p＜0.05)，说明辣木叶提取物能显著降低高尿酸血症大鼠血清尿酸水平，其中，辣木叶提取物1,2,3在体内的降尿酸作用最好。然而，辣木叶提取物4的制备流程中缺少了辣木叶肽的提取及复合；辣木叶提取物5的制备流程中缺少了辣木叶多酚的提取及复合；辣木叶提取物4，5组的大鼠血清尿酸水平显著高于辣木叶提取物1，2，3组(n＝12，p＜0.05)。
本发明实施例可见，整个制备工艺流程简单、各环节均可达食品级要求，制备成本低。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。