一种含有人脐带间充质干细胞的培养上清的化妆品的制作方法

本发明属于日用化妆品技术领域，具体涉及一种含有人脐带间充质干细胞的培养上清的化妆品。

背景技术：

皮肤是人体的天然外衣，一般由外至内分为表皮、真皮和皮下组织三大部分，而表皮又分为角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层。皮肤最外层的角质层，对于皮肤屏障功能的完整起着很重要的作用。角质层上有一层皮脂膜，是由皮脂、汗液和表皮细胞分泌物乳化而形成的半透明乳状薄膜，皮脂膜中的游离脂肪酸、乳酸盐、尿素和尿酸为天然的保湿因子，对皮肤起保湿作用。皮肤保湿功能降低会导致皮肤屏障功能下降，进而导致皮肤保湿功能进一步降低，从而形成恶性循环。因此对于正常皮肤屏障功能而言，保湿既能维持皮肤正常生理功能，延缓皮肤衰老，又是预防和治疗皮肤病的重要环节。

随着人们对化妆品种类和功能的需求不断提高，化妆品的研发技术也在不断改进和提高，保湿功效作为皮肤护理类化妆品的最基本的功能之一，也越来越受到重视。皮肤的柔润及弹性与角质层中的水含量有着密切的关系，角质层的正常含水量维持在10％-20％之间，才能维持角质层正常的功能和肌肤的健康状态。因此，皮肤保湿是化妆品护肤抗衰老永恒的主题，而对护肤类产品的保湿功效评价也就成为产品开发和改良的重要指标。然而，目前市售各类保湿化妆产品鱼龙混杂，良莠不齐，许多美容化妆品由化学物质制成，其不良反应已逐渐引起人们的不安和重视。此外，现有市场出售的通过植物成分提取的天然保湿剂，由于产品中可能存在的天然生物大分子物质不易被皮肤吸收，会造成皮肤的额外负担。除此之外，由于产能或技术瓶颈等原因，目前阶段的保湿化妆产品基本都不具有生物活性，无法从根本上调节表皮细胞的新陈代谢和生存环境，无法有效改善干燥、老化皮肤的外观和触感，尤其皮肤敏感或孕妇等人群需谨慎使用。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是中胚层来源的一类具有自我复制及多向分化潜能的干细胞，广泛存在于全身多种组织中，在组织修复、造血重建及免疫治疗等方面具有广阔的临床应用前景。随着对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞。其中人脐带间充质干细胞具有无法比拟的优势，其来源丰富、易于获得、增殖能力强且排除了伦理道德方面的限制，已成为目前临床应用最广泛的细胞来源之一。

技术实现要素：

本发明的目的为提供一种具有保湿和/或提高皮肤含水量的功能化妆品。

本发明首先保护一种化妆品，该化妆品可包括间充质干细胞的培养上清；所述化妆品可具有保湿和/或提高皮肤含水量的功能。

上述化妆品中，所述“间充质干细胞的培养上清”的制备方法可为：培养间充质干细胞，收集液相，得到间充质干细胞的培养上清。

上述任一所述间充质干细胞可为人脐带间充质干细胞。

上述制备方法中，所述培养使用的培养基可为人脐带间充质干细胞完全培养基。所述人脐带间充质干细胞完全培养基已在中国发明专利文献cn106906181a中公开。所述人脐带间充质干细胞完全培养基可包括人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、il-3和il-6。所述人脐带间充质干细胞完全培养基可为含2-10μg/ml(如2-5μg/ml、5-10μg/ml、2μg/ml、5μg/ml或10μg/ml)的人胰岛素、0.1-1mg/ml(如0.1-0.5mg/ml、0.5-1mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml)的人血清白蛋白、2-10μg/ml(如2-5μg/ml、5-10μg/ml、2μg/ml、5μg/ml或10μg/ml)的转铁蛋白、1-5ng/ml(如1-3ng/ml、3-5ng/ml、1ng/ml、3ng/ml或5ng/ml)的表皮细胞生长因子、1-5ng/ml(如1-3ng/ml、3-5ng/ml、1ng/ml、3ng/ml或5ng/ml)的血小板衍生生长因子、2-50ng/ml(如2-20ng/ml、20-50ng/ml、2ng/ml、20ng/ml、2-50ng/ml)的il-3和2-50ng/ml(如2-30ng/ml、30-50ng/ml、2ng/ml、30ng/ml、50ng/ml)的il-6的无血清基本培养基。

所述无血清基本培养基可选自如下中任一：α-mem培养基、dmem培养基、dmem/f12培养基、m199培养基、imdm培养基、imdm/f12培养基。其中，以α-mem培养基为最优选。

上述制备方法中，所述培养的条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％c02(如3-5％c02、5-7％c02、3％c02、5％c02或7％c02)。

上述制备方法中，所述培养间充质干细胞时，间充质干细胞的传代代数可为3-6代(如3代、4代、5代或6代)。

上述任一所述人脐带间充质干细胞可以通过商购途径获得，也可以自行制备。

上述任一所述人脐带间充质干细胞的制备方法可如下：

(1)取足月妊娠分娩胎儿的脐带组织(长度为8～10cm)，去除脐带组织中的血管(可通过用pbs缓冲液充分清洗实现)，得到华通氏胶；

(2)完成步骤(1)后，将所述华通氏胶剪成小块(体积可为1mm³)，然后置于上述任一所述人脐带间充质干细胞完全培养基，培养，得到贴壁细胞；

(3)完成步骤(2)后，将所述贴壁细胞置于上述任一所述人脐带间充质干细胞完全培养基，培养至贴壁细胞的密度达到70％以上时(培养期间每隔3-4天使用人脐带间充质干细胞完全培养基进行换液)，传代3次，获得人脐带间充质干细胞。

所述步骤(2)中，所述培养可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％c02(如3-5％c02、5-7％c02、3％c02、5％c02或7％c02)培养箱中培养2-4天(如2天、3天或4天)。

所述步骤(3)中，所述培养可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％c02(如3-5％c02、5-7％c02、3％c02、5％c02或7％c02)培养。

所述步骤(3)中，每次传代的操作步骤依次可如下：①弃上清液，加入pbs缓冲液清洗；②加入适量胰蛋白酶(浓度可为0.25％)，消化；③加入人脐带间充质干细胞完全培养基(目的为终止消化)，混匀，然后离心，收集沉淀；④取沉淀，加入适量人脐带间充质干细胞完全培养基重悬，得到重悬液；⑤培养重悬液，当贴壁细胞的密度达到70％以上时进行传代。

所述步骤⑤中，所述培养可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％c02(如3-5％c02、5-7％c02、3％c02、5％c02或7％c02)培养。

上述任一所述“培养人脐带间充质干细胞，收集液相，得到人脐带间充质干细胞的培养上清”具体可如下：

(1)将人脐带间充质干细胞(约1×10⁷个)接种至上述任一人脐带间充质干细胞完全培养基(约10ml)，培养，得到培养体系4。

(2)收集培养体系4的液相(命名为液相1)。

(3)向完成步骤(2)的体系中加入pbs缓冲液，充分清洗；然后加入适量胰蛋白酶消化细胞至单细胞状态；再加入人脐带间充质干细胞完全培养基(目的为终止消化)，混匀，离心，收集沉淀；最后向沉淀中加入人脐带间充质干细胞完全培养基(约10ml)重悬，得到重悬液；取重悬液，培养，得到培养体系5。

(4)收集培养体系5的液相(命名为液相2)。

(5)向完成步骤(4)的体系中加入pbs缓冲液，充分清洗；然后加入适量胰蛋白酶消化细胞至单细胞状态；再加入人脐带间充质干细胞完全培养基(目的为终止消化)，混匀，离心，收集沉淀；最后向沉淀中加入人脐带间充质干细胞完全培养基(约10ml)重悬，得到重悬液；取重悬液，培养，得到培养体系6。

(6)收集培养体系6的液相(命名为液相3)。

(7)将液相1、液相2和液相3混合，得到混合液。该混合液即为人脐带间充质干细胞的培养上清。

所述步骤(1)、(3)和(5)中，所述培养可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％c02(如3-5％c02、5-7％c02、3％c02、5％c02或7％c02)培养20-30h(如20-24h、24-30h、20h、24h或30h)。

上述任一所述化妆品还可包括甘油、1，3-丙二醇和透明质酸钠。

所述化妆品具体可为含50-150g/l(如50-60g/l、60-150g/l、50g/l、60g/l或150g/l)甘油、30-150g/l(如30-80g/l、80-150g/l、30g/l、80g/l或150g/l)1，3-丙二醇和3-15mg/l(如3-10mg/l、10-15mg/l、3mg/l、10mg/l或15mg/l)透明质酸钠的人脐带间充质干细胞的培养上清。

所述化妆品还可包括血管内皮生长因子、干细胞生长因子和吡咯烷酮羧酸钠。

所述化妆品具体可为含50-150g/l(如50-60g/l、60-150g/l、50g/l、60g/l或150g/l)甘油、30-150g/l(如30-80g/l、80-150g/l、30g/l、80g/l或150g/l)1，3-丙二醇、3-15mg/l(如3-10mg/l、10-15mg/l、3mg/l、10mg/l或15mg/l)透明质酸钠、0.5-2.0mg/l(如0.5-1.5mg/l、1.5-2.0mg/l、0.5mg/l、1.5mg/l或2.0mg/l)血管内皮生长因子、1-3mg/l(如1-2mg/l、2-3mg/l、1mg/l、2mg/l或3mg/l)干细胞生长因子和1-3g/l(如1-2g/l、2-3g/l、1g/l、2g/l或3g/l)吡咯烷酮羧酸钠的人脐带间充质干细胞的培养上清。

本发明还保护上述任一所述化妆品的制备方法，可为将甘油、1，3-丙二醇、透明质酸钠和所述间充质干细胞的培养上清混合，得到混合液；甘油在混合液中的浓度为50-150g/l(如50-60g/l、60-150g/l、50g/l、60g/l或150g/l)，1，3-丙二醇在混合液中的浓度为30-150g/l(如30-80g/l、80-150g/l、30g/l、80g/l或150g/l)，透明质酸钠在混合液中的浓度为3-15mg/l(如3-10mg/l、10-15mg/l、3mg/l、10mg/l或15mg/l)；混合液即为制备的化妆品。

本发明还保护上述任一所述化妆品的制备方法，可为将甘油、1，3-丙二醇、透明质酸钠、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、吡咯烷酮羧酸钠和所述间充质干细胞的培养上清混合，得到混合液；甘油在混合液中的浓度为50-150g/l(如50-60g/l、60-150g/l、50g/l、60g/l或150g/l)，1，3-丙二醇在混合液中的浓度为30-150g/l(如30-80g/l、80-150g/l、30g/l、80g/l或150g/l)，透明质酸钠在混合液中的浓度为3-15mg/l(如3-10mg/l、10-15mg/l、3mg/l、10mg/l或15mg/l)，血管内皮生长因子在混合液中的浓度为0.5-2.0mg/l(如0.5-1.5mg/l、1.5-2.0mg/l、0.5mg/l、1.5mg/l或2.0mg/l)，干细胞生长因子在混合液中的浓度为1-3mg/l(如1-2mg/l、2-3mg/l、1mg/l、2mg/l或3mg/l)，吡咯烷酮羧酸钠在混合液中的浓度为1-3g/l(如1-2g/l、2-3g/l、1g/l、2g/l或3g/l)；混合液即为制备的化妆品。

上述制备方法中，所述间充质干细胞可为人脐带间充质干细胞。

上述任一所述pbs缓冲液具体可为gibco公司的产品，货号为20012068。

本发明还保护q1)或q2)或q3)：

q1)上述任一所述间充质干细胞的培养上清在制备化妆品中的应用；

q2)上述任一所述人脐带间充质干细胞完全培养基在制备化妆品中的应用；

q3)上述任一所述间充质干细胞在制备化妆品中的应用；

所述化妆品具有保湿和/或提高皮肤含水量的功能。

上述应用中，所述间充质干细胞可为人脐带间充质干细胞。

上述任一所述化妆品可为保湿水、保湿乳、保湿霜、面膜、护手霜、修护液或精华霜。

实验证明，在短期保湿试验和长期保湿试验中，本发明提供的化妆品均具有较好的吸水、锁水功效，具有更好的保湿性；同时，以人脐带间充质干细胞的培养上清作为化妆品的基础配方，且不添加任何化工添加物(如着色剂、矿物油、铅、汞、乙醇等致敏成分)，可最大程度的保护了不同人群持续使用的安全性。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为人脐带间充质干细胞的流式细胞仪检测。

图2为实施例2制备的保湿修护液的保湿功效检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pbs缓冲液为gibco公司的产品，货号为20012068。cd90抗体、cd73抗体、cd105抗体、cd45抗体和hla-dr抗体均为美国bd公司的产品，货号分别为559869、550257、550839、555482和559866。

人脐带间充质干细胞完全培养基已在中国发明专利文献cn106906181a中公开。在下述实施例中，人脐带间充质干细胞完全培养基具体为向α-mem培养基中加入终浓度为5μg/ml的人胰岛素、终浓度为0.5mg/ml的人血清白蛋白、终浓度为5μg/ml的转铁蛋白、终浓度为3ng/ml的表皮细胞生长因子(egf)、终浓度为3ng/ml的血小板衍生生长因子(pdgf)、终浓度为20ng/ml的il-3和终浓度为30ng/ml的il-6得到的培养基。

实施例1、人脐带间充质干细胞的获得和鉴定

一、人脐带间充质干细胞的获得

人脐带间充质干细胞是从足月妊娠分娩胎儿的脐带组织(捐赠者知情且同意)中分离获得的。具体步骤如下：

1、在无菌条件下，将足月妊娠分娩胎儿的脐带组织(长度为8～10cm)置于gmp实验室，然后用pbs缓冲液充分清洗(目的为去除脐带组织中的血管)，得到华通氏胶。

2、完成步骤1后，将华通氏胶剪切成小块(体积约为1mm³)，然后置于人脐带间充质干细胞完全培养基后移入细胞培养瓶，将细胞培养瓶置于37℃、5％c02培养箱中培养3天，得到贴壁细胞。

3、另取一新的细胞培养瓶，加入步骤2获得的贴壁细胞和人脐带间充质干细胞完全培养基，37℃、5％c02培养，培养期间每隔3-4天使用人脐带间充质干细胞完全培养基进行换液。当贴壁细胞的密度达到70％以上时，传代3次，即得到人脐带间充质干细胞。

每次传代的操作步骤依次如下：(1)弃上清液，加入pbs缓冲液清洗；(2)加入适量胰蛋白酶(浓度为0.25％)，消化3min；(3)加入1ml人脐带间充质干细胞完全培养基(目的为终止消化)，混匀，然后1000rpm离心5min，收集沉淀；(4)取沉淀，加入适量人脐带间充质干细胞完全培养基重悬，得到重悬液；(5)将重悬液置于37℃、5％c02培养箱中培养，当贴壁细胞的密度达到70％以上时进行传代。

二、人脐带间充质干细胞的检测

待测抗体为cd90抗体、cd73抗体、cd105抗体、cd45抗体或hla-dr抗体。

cd90、cd73和cd105均为人脐带间充质干细胞表面标志物，即在人脐带间充质干细胞表面特异表达。cd45和hla-dr均不为人脐带间充质干细胞表面标志物，即不在人脐带间充质干细胞表面特异表达。

使用流式细胞术对步骤一中3获得的人脐带间充质干细胞表面标志物进行检测，具体步骤如下：

1、取步骤一中3获得的人脐带间充质干细胞，先加入适量0.25％胰蛋白酶消化细胞至单细胞状态，然后离心，弃上清，加入pbs缓冲液重悬，得到浓度为1×10⁶个/ml的干细胞重悬液。

2、完成步骤1后，取所述干细胞重悬液，加入待测抗体，室温避光孵育20min，然后1500rpm离心5min，收集沉淀。

3、完成步骤2后，取所述沉淀，用含2％(v/v)胎牛血清的pbs缓冲液重悬，然后采用流式细胞仪检测。

cd90抗体的检测结果见图1中a。结果表明，99.9％的人脐带间充质干细胞表面表达cd90。

cd73抗体的检测结果见图1中b。结果表明，99.1％的人脐带间充质干细胞表面表达cd73。

cd105抗体的检测结果见图1中c。结果表明，99.8％的人脐带间充质干细胞表面表达cd105。

cd45抗体的检测结果见图1中d。结果表明，0.6％的人脐带间充质干细胞表面表达cd45。

hla-dr抗体的检测结果见图1中e。结果表明，0.9％的人脐带间充质干细胞表面表达hla-dr。

上述结果表明，步骤一中3制备的细胞为人脐带间充质干细胞。

实施例2、保湿修护液的制备

一、培养上清的获得

1、将实施例1步骤一中3制备的人脐带间充质干细胞(约1×10⁷个)接种至10ml人脐带间充质干细胞完全培养基，置于37℃、5％c02培养箱中培养24h，得到培养体系4。该步骤实际为第4次传代培养。

2、收集培养体系4的液相(命名为液相1)。

3、向完成步骤2的体系中加入pbs缓冲液，充分清洗；然后加入适量胰蛋白酶(浓度为0.25％)消化细胞至单细胞状态；再加入人脐带间充质干细胞完全培养基(目的为终止消化)，混匀，1000rpm离心5min，收集沉淀；最后向沉淀中加入10ml人脐带间充质干细胞完全培养基重悬，得到重悬液；将重悬液置于37℃、5％c02培养箱中培养24h，得到培养体系5。该步骤实际为第5次传代培养。

4、收集培养体系5的液相(命名为液相2)。

5、向完成步骤4的体系中加入pbs缓冲液，充分清洗；然后加入适量胰蛋白酶(浓度为0.25％)消化细胞至单细胞状态；再加入人脐带间充质干细胞完全培养基(目的为终止消化)，混匀，1000rpm离心5min，收集沉淀；最后向沉淀中加入10ml人脐带间充质干细胞完全培养基重悬，得到重悬液；将重悬液置于37℃、5％c02培养箱中培养24h，得到培养体系6。该步骤实际为第6次传代培养。

6、收集培养体系6的液相(命名为液相3)。

7、将液相1、液相2和液相3混合，得到混合液(约30ml)。该混合液即为培养上清。

二、保湿修护液的制备

1、保湿修护液甲的制备

取步骤一获得的培养上清(全部)，加入甘油、1，3-丙二醇、透明质酸钠、血管内皮生长因子、干细胞生长因子和吡咯烷酮羧酸钠，得到保湿修护液甲。该保湿修护液甲中，甘油的浓度为60g/l，1，3-丙二醇的浓度为80g/l，透明质酸钠的浓度为10mg/l，血管内皮生长因子的浓度为1.5mg/l，干细胞生长因子的浓度为2mg/l，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为2g/l。

2、保湿修护液乙的制备

取步骤一获得的培养上清(全部)，加入甘油、1，3-丙二醇和透明质酸钠，得到保湿修护液乙。该保湿修护液乙中，甘油的浓度为60g/l，1，3-丙二醇的浓度为80g/l，透明质酸钠的浓度为10mg/l。

实施例3、保湿修护液的保湿功效检测

根据市售保湿化妆品的包装盒记载，市售保湿化妆品的主要成分包括甘油、透明质酸钠、海藻糖、神经酰胺、1，3-丙二醇、硬脂酸和水。

一、短期保湿试验

选择性别相同、年龄为20～25、皮肤表面无创伤、无皮肤病史且无化妆品过敏史的受试者9名。所有受试者均知情同意。将9名受试者随机分为实验组一、实验组二和对照组(每组3名)，然后进行如下试验：

实验组一：首先在每位受试者的左、右前臂内侧标记测试区域(4cm×6cm)，并在测试区域内标记3个测试探头的测试位点；清水清洁后将实施例2制备的保湿修护液甲均匀涂抹于测试区域；分别在清水清洁后(即未使用保湿修护液甲)、保湿修护液甲使用后0h、使用后1h、使用后2h和使用后4h，用corneometercm825couragekhazakacolognegermany测量测试位点的皮肤含水量。每个测试位点平行测定5次；按组取平均值；

实验组二：首先在每位受试者的左、右前臂内侧标记测试区域(4cm×6cm)，并在测试区域内标记3个测试探头的测试位点；清水清洁后将实施例2制备的保湿修护液乙均匀涂抹于测试区域；分别在清水清洁后(即未使用保湿修护液乙)、保湿修护液乙使用后0h、使用后1h、使用后2h和使用后4h，用corneometercm825couragekhazakacolognegermany测量测试位点的皮肤含水量。每个测试位点平行测定5次；按组取平均值；

对照组：首先在每位受试者的左、右前臂内侧标记测试区域(4cm×6cm)，并在测试区域内标记3个测试探头的测试位点；清水清洁后将市售保湿化妆品均匀涂抹于测试区域；分别在清水清洁后(即未使用市售保湿化妆品)、市售保湿化妆品使用后0h、使用后1h、使用后2h和使用后4h，用corneometercm825couragekhazakacolognegermany测量测试位点的皮肤含水量。每个测试位点平行测定5次；按组取平均值。

试验时保持室内温度20～24℃，湿度40～60％，自然光线，无阳光直射。测试前受试者需在测试条件下至少稳定30min。

部分检测结果见图2中a。结果表明，与市售保湿化妆品相比，使用实施例2制备的保湿修护液甲和保湿修护液乙的皮肤含水量更高(使用保湿修护液甲和保湿修护液乙的皮肤含水量无显著差异)，即实施例2制备的保湿修护液甲和保湿修护液乙具有更好的保湿性。即在短期保湿试验中，实施例2制备的保湿修护液甲和保湿修护液乙均具有较好的吸水、锁水功效，具有更好的保湿性。

二、长期保湿试验

选择性别相同、年龄为20～25、皮肤表面无创伤、无皮肤病史且无化妆品过敏史的受试者9名。所有受试者均知情同意。将9名受试者随机分为实验组一、实验组二和对照组(每组3名)，然后进行如下试验：

实验组一：首先在每位受试者的面部标记测试区域(4cm×6cm)，并在测试区域内标记3个测试探头的测试位点；每日早晚清水清洁后将实施例2制备的保湿修护液甲均匀涂抹于面部；分别在使用前(即未使用保湿修护液甲)、保湿修护液甲使用后1d、使用后7d、使用后14d和使用后28d，用corneometercm825couragekhazakacolognegermany测量测试位点的皮肤含水量。每个测试位点平行测定5次；按组取平均值；

实验组二：首先在每位受试者的面部标记测试区域(4cm×6cm)，并在测试区域内标记3个测试探头的测试位点；每日早晚清水清洁后将实施例2制备的保湿修护液乙均匀涂抹于面部；分别在使用前(即未使用保湿修护液乙)、保湿修护液乙使用后1d、使用后7d、使用后14d和使用后28d，用corneometercm825couragekhazakacolognegermany测量测试位点的皮肤含水量。每个测试位点平行测定5次；按组取平均值；

对照组：首先在每位受试者的面部标记测试区域(4cm×6cm)，并在测试区域内标记3个测试探头的测试位点；每日早晚清水清洁后将市售保湿化妆品均匀涂抹于面部；分别在使用前(即未使用市售保湿化妆品)、市售保湿化妆品使用后1d、使用后7d、使用后14d和使用后28d，用corneometercm825couragekhazakacolognegermany测量测试位点的皮肤含水量。每个测试位点平行测定5次；按组取平均值。

试验期间不得使用其它化妆品且无日常清水清洁之外的皮肤护理行为。

部分检测结果见图2中b。结果表明，与市售保湿化妆品相比，使用实施例2制备的保湿修护液甲和保湿修护液乙的皮肤含水量更高(使用保湿修护液甲和保湿修护液乙的皮肤含水量无显著差异)，即在长期保湿试验中，实施例2制备的保湿修护液甲和保湿修护液乙均具有较好的吸水、锁水功效，具有更好的保湿性。

此外，以实施例2中步骤一获得的培养上清作为保湿修护液的基础配方，且不添加任何化工添加物(如着色剂、矿物油、铅、汞、乙醇等致敏成分)，可以最大程度的保护了不同人群持续使用的安全性。