一种脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型的建立方法及其应用与流程

本发明涉及医用动物模型领域，尤其涉及一种脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型的建立方法及其应用。

背景技术：

随着人类生活水平的提高，社会竞争压力增大，以及人口老龄化的进展，脑血管病成为威胁生命的第一大病因。而其中脑出血(intracerebralhemorrhage，ich)为常见的急性脑血管病，在西方国家中，脑出血约占所有脑卒中的15％，占所有住院卒中患者的10％～30％，我国的比例更高，为18.8％～47.6％。脑出血发病凶险，病情变化快，致死致残率高，除了各种继发因素所导致的脑水肿、出血灶周围脑细胞损害，后期诸多的并发症尤其是重症肺炎也是加重病情甚至导致死亡的罪魁祸首之一。脑卒中急性期患者中有约10％～47％发生肺部感染，而死于肺部感染者占脑卒中死亡病例的1/3，其肺部感染的控制程度，影响到卒中患者的转归和预后。

脑损伤可增加肺血管压力及血管内皮通透性，触发一系列生物机制，直接或间接对肺造成损伤。而肺损伤患者可通过复杂的网络途径如体液、细胞途径促进脑损伤，机械或化学刺激可以通过肺、气道或呼吸肌上的机械感受器或者化学感受器分别传入神经系统。脑出血引起吸入性肺炎，肺炎又加重脑损伤，无论从临床到机制，都体现了肺脑交互这一概念，两者互为影响，故将两者联合研究是十分必要的。

对于脑出血后吸入性肺炎的研究具有重大的临床意义及探索价值，但目前缺少该类疾病的基础研究。

技术实现要素：

为了于克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型的建立方法，建立脑出血+吸入性肺炎的复合模型，为行业内首次建立该复合模型，最大程度上模仿临床相关疾病，为以后类似疾病的后续研究提供理论基础，具有较高的科学研究价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型的建立方法，其包括如下步骤：

步骤一、脑出血大鼠模型的制备；

大鼠注射麻醉后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，留置预定时间，缓慢拔针，防止反流，获得脑出血大鼠模型；

步骤二、重症脑出血合并吸入性肺炎模型的制备；

步骤一中的脑出血大鼠模型制备成功后，将大鼠倾斜仰卧位固定，颈前切口暴露气管，在冷光源照射下将导管插入左主支气管，导管末端连接微量加样器，缓慢推注hcl溶液，推注完成后，拔出导管并竖直放置大鼠，获得重症脑出血合并吸入性肺炎模型。

为了进一步优化上述建立方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述步骤一中，大鼠采用10％水合氯醛320～380mg/kg腹腔注射麻醉，其断尾取血量为80～120ul，其血液注入方法为：2次注入法，先注入一半，留置8～12min后，再注射另一半血量；注入完成后，留置12～18min后拔针。更进一步地，大鼠采用10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，其断尾取血量为100ul，其血液注入方法为：2次注入法，先注入一半，留置10min后，再注射另一半血量；注入完成后，留置15分钟后拔针。

进一步地，所述步骤一中，所述右侧尾状核的注入位置为：前囟中线旁开2.8～3.2mm，冠状缝前0.8～1.2mm，深度5～7mm。更进一步地，所述右侧尾状核的注入位置为：前囟中线旁开3mm，冠状缝前1.0mm，深度6mm。

进一步地，所述步骤一中，在拔针后，采用骨蜡封闭颅骨创口，缝合头皮，局部皮肤用复合碘消毒液消毒，防止局部感染。

进一步地，在脑出血模型制备成功25～45min后制备重症脑出血合并吸入性肺炎模型，所述步骤二的操作于在洁净工作台内完成，大鼠倾斜仰卧的角度为50～70°。更进一步地，在脑出血模型制备成功30min后制备重症脑出血合并吸入性肺炎模型，所述步骤二的操作于在洁净工作台内完成，大鼠倾斜仰卧的角度为60°。

进一步地，所述步骤二中，所述颈前切口为4～6mm，所述导管的内径为0.25～0.32mm。更进一步地，所述颈前切口为5mm，所述导管的内径为0.28mm。

进一步地，所述步骤二中，所述hcl溶液的浓度为0.08～0.12mol/l，用量为：0.8～1.2μl/g体重，0.9％ns稀释，ph＝1.15～1.35；在推注hcl溶液结束时，推注适量空气以确保全部hcl或ns进入靶肺；推注完成的大鼠拔出导管并竖直放置4～8min后放置于动物加热板保温处理。更进一步地，所述hcl溶液的浓度为0.1mol/l，用量为：1μl/g体重，0.9％ns稀释，ph＝1.25；在推注hcl溶液结束时，推注适量空气以确保全部hcl或ns进入靶肺；推注完成的大鼠拔出导管并竖直放置5min后放置于动物加热板保温处理。

本发明的第二个目的是提供一种采用任一上述建立方法制备的脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型在制备预防或治疗脑出血患者吸入性肺炎的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明首次建立脑出血+吸入性肺炎的动物复合模型，以最大程度上模拟临床上此类相关疾病，从而为今后治疗该类疾病的研究提供重要的理论基础。

附图说明

图1是本发明一实施例中模型建成后第1天～第3天的各组织的水肿结果图；

图2是本发明一实施例中模型建成后tnf-α的elisa结果图。

具体实施方式

本发明涉及一种脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型的建立方法，其包括：大鼠注射麻醉后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，留置预定时间，缓慢拔针，防止反流，获得脑出血大鼠模型；将大鼠倾斜仰卧位固定，颈前切口暴露气管，在冷光源照射下将导管插入左主支气管，导管末端连接微量加样器，缓慢推注hcl溶液，推注完成后，拔出导管并竖直放置大鼠，获得重症脑出血合并吸入性肺炎模型。本发明还涉及上述脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型的相关应用

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为一种脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型的建立步骤，其包括：

一、实验动物：

体重为200g左右雄性sd大鼠。

二、动物分组：

(1)空白对照组；(2)ich组；(3)ap组；(4)ich+ap组。

三、动物模型建立：

1、脑出血大鼠模型(ich)制备

采用尾状核注射自体血制备ich模型：大鼠用10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，断尾取血100ul匀速注入右侧尾状核(前囟中线旁开3mm，冠状缝前1.0mm，深度6mm)。采用2次注入法，先注入一半，留置10min后，再注射另一半血量。留置15分钟，然后缓慢拔针，防止反流。骨蜡封闭颅骨创口，缝合头皮。局部皮肤用复合碘消毒液消毒，防止局部感染。

2、重症脑出血(ich)合并吸入性肺炎(sap(卒中相关性肺炎)吸入性肺炎)模型制备

脑出血大鼠模型制备成功后30min，在脑出血模型基础上叠加吸入性肺炎模型。全部手术过程在洁净工作台内完成，将大鼠60°倾斜仰卧位固定，颈前切口(5mm)暴露气管，在冷光源照射下将导管(内径0.28mm)插入气管，调整导管插入左主支气管，导管末端连接微量加样器，缓慢推注0.1mol/lhcl溶液(1μl/g体重，0.9％ns(生理盐水)稀释，ph1.25)。滴注结束时再推注适量空气以确保全部hcl或ns进入靶肺，拔出导管并竖直放置大鼠5min。大鼠术后放置于动物加热板保温处理，苏醒后，密切观察并单笼饲养。

四、观察指标：

①3h、6h、12h、1d、3d、7d分别观察各组大鼠的生存情况及体重的变化等。

②各个时间点进行呼吸功能检测，评估气道阻力。

③各时间点按bederson法进行行为学评分。

④3h、6h、12h、1d、3d、7d分别处死大鼠，观察各组脑、肺的水肿情况。脑、肺组织放于95°烘箱24h。组织含水量计算＝(组织湿重－组织干重)/组织湿重×100％。如图1所示。

⑤观察脑及肺部组织的病理学改变。

⑥肺泡灌洗液中蛋白及白细胞总数的情况。

⑦炎症因子检测：elisa、western-blot、pcr等方式观察相关炎症因子tnf-α(如图2)、il-1β、il-8及il-10分别在血及脑、肺组织中的表达情况及水平。

上述结果如图1和图2所所示，由上述结果可知，大鼠模型产生了一定的脑水肿和肺水肿，且其tnf-α水平升高，这表明上述方法已成功构建了脑出血+吸入性肺炎的大鼠复合模型。

应用实施例1

本实施例为由实施例1的脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型在在制备预防或治疗脑出血患者吸入性肺炎的药物中的应用。

乌司他丁对脑出血+吸入性肺炎模型进行干预：

1)乌司他丁最初仅作为胰蛋白酶抑制剂治疗急性胰腺炎，后来发现还具有抑制炎症介质的释放、清除氧自由基、改善休克时的微循环及组织灌注等功能，在辅助治疗休克，减轻大手术的侵袭以及体外循环、机械通气、缺血再灌注等情况下均显示了良好的治疗效果。近年来大量的临床及动物试验显示这种尿胰蛋白酶抑制剂通过抑制炎症介质释放如tnf-α、il-6，il-8等,预防细胞因子级联反应,抑制白细胞过度激活，阻断细胞因子与白细胞之间的恶性循环，在脓毒血症、多器官功能衰竭等全身性炎症疾病中具有肺保护作用，从而在早期ali/ards中扮演了重要角色。在脑出血方面，经研究证实，乌司他丁可抑制脑内炎性介质释放如tnf-a、il-1、il-8,从而减少了氧自由基释放，以此对脑损伤起到保护作用。同时，乌司他丁还可减少白细胞与脑血管内皮细胞的吸附、聚集，从而减轻内皮细胞损伤，改善微循环、并减轻神经细胞损伤以及增强抗炎因子的水平。经相关研究证实，脑出血时乌司他丁能够明显保护脑神经元与血管功能，通过减轻脑细胞损伤，保护细胞器及稳定生物膜,从而抑制脑细胞凋亡达到减轻脑水肿的目的。考虑到肺、脑存在相同的炎症介质，如前所提到的tnf-a等，所以设想采用对肺、脑有共同作用的干预措施，应该可以为该类疾病的治疗提供一条新的思路。因此，本实施例选择乌司他丁对模型进行干预，以期达到既能减轻脑水肿，又能减弱肺炎的损伤的目的，为以后的治疗提供理论基础。

2)本实施例借鉴renb等人的方法，在造模前30min给予腹腔注射10000u/kg乌司他丁，然后进行脑出血+吸入性肺炎的造模。

3)观察的指标同脑出血+吸入性肺炎造模后所检测的指标。

4)比较乌司他丁对该模型的治疗作用。

由上述实施例可知，本发明通过气管内注射在脑出血模型基础上叠加吸入性肺炎模型，其操作简便，成功率高，并优化各项操作参数(注射试剂、注射时间、注射量等)，成功构建了脑出血后吸入性肺炎重症相关动物模型，其可模拟脑出血并吸入性肺炎的病理及生理过程，对防治脑出血并吸入性肺炎的发生及后期的康复治疗及预后具有重要的意义。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。