一种低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备的制作方法

本发明涉及一种纳米复合抗肿瘤药物的制备，特别涉及一种低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备。

背景技术：

目前，随着肿瘤发病率的提升，癌症对人类的威胁日益突出。针对癌症的传统治疗方法主要有手术、化疗和放疗，而这些方法对于恶性肿瘤的治疗效果常常伴随着严重的负效应。抗肿瘤类药物对哺乳动物的发育毒性作用日益受到关注，临床上常用的细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于dna拓扑异构酶ⅱ，形成药物-酶-dna稳定的可逆性复合物，阻碍dna修复。但其毒副作用较强，尤其是具有较强的致畸、致突变作用，影响人体生殖细胞及胎儿的生长和发育，严重危害人类生殖健康。

技术实现要素：

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法，通过该方法得到的纳米复合抗肿瘤药物具有低胚胎毒性的特点。

本发明提供了一种低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法，具有这样的特征：采用金属离子盐溶液与抗肿瘤药物共结晶从而得到纳米复合抗肿瘤药物，包括如下步骤：

步骤一：配制金属离子盐溶液，该金属离子盐溶液中溶质由二价金属离子盐及三价金属离子盐组成，二价金属离子与三价金属离子的摩尔比为1:1-3:1；

步骤二：用去co2的双蒸馏水作为溶剂，配制naoh溶液；

步骤三：n2气氛下，将抗肿瘤药物粉末加入到剧烈搅拌的naoh溶液中搅拌，再加入金属离子盐溶液，得到第三悬浮液；

步骤四：将第三悬浮液转移至水热合成釜，在80-120℃条件下加热14-18h，得到第四悬浮液；

步骤五：将第四悬浮液在真空干燥箱内干燥后得到纳米复合抗肿瘤药物。

在本发明提供的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，二价金属盐为硝酸镁、硝酸锌、硝酸钙、氯化镁、氯化锌或氯化钙中的任一种。

在本发明提供的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，三价金属盐为硝酸铝、硝酸铁、氯化铁或氯化铝中的任一种。

在本发明提供的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，抗肿瘤药物为细胞周期类抗肿瘤药物。

在本发明提供的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，细胞周期类抗肿瘤药物为依托泊苷或鬼臼毒素。

在本发明提供的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，纳米复合抗肿瘤药物的有效浓度为10μg/ml-100μg/ml。

在本发明提供的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，纳米复合抗肿瘤药物的有效浓度为20μg/ml。

本发明提供的根据低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法制备的纳米复合抗肿瘤药物，其特征在于：其中，纳米复合抗肿瘤药物的粒径为70nm-110nm。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法，通过该方法制得的纳米复合抗肿瘤药物，从细胞存活率检测实验、细胞形态及克隆形成能力的观察、实时定量pcr检测多潜能基因的表达、体外胚层分化效果评价以及体内效果等实验结果可知，与未搭载纳米层状双氢氧化物slw的抗肿瘤药物对比，搭载纳米层状双氢氧化物slw的抗肿瘤药物slw-cad对胚胎干细胞的毒性显著降低，能够降低对mesc的克隆形态及克隆个数的影响，维持去除lif条件下oct4、nanog、esrrb、rex1的表达，能够向三个胚层进行分化，具有多潜能性，有效的降低了药物引起的胚胎毒性及胚胎发育障碍的现象，因此根据本发明的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法得到的纳米复合抗肿瘤药物具有低胚胎毒性的优点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1a是本发明的实施例中的纳米层状双氢氧化物slw的透射电镜形貌；

图1b是本发明的实施例中的纳米复合抗肿瘤药物slw-cad的透射电镜形貌；

图2是本发明的实施例中的不同浓度cad、slw、slw-cad及slw+cad物理混合组处理e14细胞24h及48h的细胞毒性结果(mtt)；

图3是本发明的实施例中的cad、slw、slw-cad及slw+cad组处理e14后细胞形态图；

图4是本发明的实施例中的实时定量pcr检测去除lif条件下加入cad、slw、slw-cad及slw+cad处理e14细胞后对多潜能基因oct4、nanog、esrrb、rex1的基因表达水平柱状图；

图5是本发明的实施例中的实时定量pcr检测cad、slw、slw-cad及slw+cad处理24h的e14细胞后自发分化3天后形成的拟胚体中三个胚层相关基因的表达水平柱状图；

图6是本发明的实施例中的免疫细胞化学染色检测slw-cad处理24h的e14自发分化7天后的拟胚体中三胚层标志的表达效果图；以及

图7是本发明的实施例中的pbs、cad及slw-cad注射孕鼠后，在e15.5天的胎鼠形态图与出生后三天后的子代鼠形态图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明一种低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法作具体阐述。

胚胎干细胞(esc)是一种高度未分化细胞，具有维持基因组高度完整性和稳定性的能力，能分化出成体动物的所有组织器官的细胞，具有对药物作用反应迅速、敏感性高、干扰因素少等优点。因此，胚胎干细胞可以作为一种重要的体外药物毒性评价工具，用于实验研究具有实验周期短、指标敏感和有利于实验的标准化等优点，因此本发明中主要采用小鼠胚胎干细胞(mesc)评价药物的胚胎毒性。

以下实施例中，所使用的高糖dmem、胎牛血清、非必需氨基酸、谷氨酰胺为细胞培养基必需成分，用于维持细胞正常生长，为市售产品，购自美国gibco公司，其他非自制试剂和原料均为一般市售商品。

<实施例>

实验一、纳米层状双氢氧化物slw的制备

步骤一，用6mmol硝酸镁与2mmol硝酸铝配制60ml盐溶液，其中mg²⁺与al³⁺之间的摩尔比为1:1-3:1。

步骤二，用去co2的ddh2o(双蒸馏水)作为溶剂，配制0.016m的naoh溶液40ml。

步骤三，n2气氛下，将步骤一制得的混合盐溶液60ml加入到剧烈搅拌(转速为400rpm)的步骤二制得的40ml0.016m的naoh溶液中，得到第一悬浮液。

步骤四，将第一悬浮液转移至水热合成釜，在80-120℃条件下加热14-18h，得到第二悬浮液。在本实验中，加热温度为100℃，加热时间为16h。

步骤五：将第二悬浮液在真空干燥箱内干燥后得到纳米层状双氢氧化物slw，用透射电镜观察该纳米层状双氢氧化物。

图1a是本发明的实施例中的纳米层状双氢氧化物slw的透射电镜形貌。

由图1a可知，纳米层状双氢氧化物slw具有较好的晶体结构，呈六边形，材料分布较均匀，粒径大小为100-120nm。

本实验中，二价金属盐还可以是硝酸锌、硝酸钙、氯化镁、氯化锌或氯化钙中的任一种。

本实验中，三价金属盐还可以是硝酸铁、氯化铁或氯化铝中的任一种。

本实验中，二价金属离子m²⁺与三价金属离子m³⁺的摩尔比为3:1。

其他实验中，二价金属离子m²⁺与三价金属离子m³⁺的摩尔比还可以是1:1或2:1。

本实验中，二价金属离子m²⁺可以是mg²⁺、zn²⁺、ca²⁺中的任一种，三价金属离子m³⁺可以是al³⁺或fe³⁺。

实验二、纳米复合抗肿瘤药物slw-cad的合成

步骤一，用6mmol硝酸镁与2mmol硝酸铝配制成60ml盐溶液，其中mg²⁺与al³⁺之间的摩尔比为1:1-3:1。

步骤二，用去co2的ddh2o(双蒸馏水)作为溶剂，配制0.016m的naoh溶液40ml。

步骤三，n2气氛下，将抗肿瘤药物粉末cad600mg加入到剧烈搅拌(转速为400rpm)的步骤二中配制的40mlnaoh溶液中搅拌5min，再加入步骤一制得的金属离子盐溶液，得到第三悬浮液。

步骤四，将第三悬浮液转移至水热合成釜，在80-120℃条件下加热14-18h，得到第四悬浮液。在本实验中，加热温度为100℃，加热时间为16h。

步骤五，将第四悬浮液在真空干燥箱内干燥后得到纳米复合抗肿瘤药物slw-cad，用透射电镜观察该纳米复合物。

图1b是本发明的实施例中的纳米复合抗肿瘤药物slw-cad的透射电镜形貌。

由图1b可知，纳米复合抗肿瘤药物slw-cad的形态成为偏圆形的结构，表明抗肿瘤药物粉末cad被很好的负载到了纳米层状双氢氧化物slw载体上，且分布均匀，杂质少，粒径分布在70-110nm间。

在本实验中，细胞周期类抗肿瘤药物cad选用依托泊苷或鬼臼毒素。

本实验中，二价金属盐还可以是硝酸锌、硝酸钙、氯化镁、氯化锌或氯化钙中的任一种。

本实验中，三价金属盐还可以是硝酸铁、氯化铁或氯化铝中的任一种。

本实验中，二价金属离子m²⁺与三价金属离子m³⁺的摩尔比为3:1。

其他实验中，二价金属离子m²⁺与三价金属离子m³⁺的摩尔比还可以是1:1或2:1。

本实验中，二价金属离子m²⁺可以是mg²⁺、zn²⁺、ca²⁺中的任一种，三价金属离子m³⁺可以是al³⁺或fe³⁺。

实验三、细胞及胚胎毒性研究

1、细胞存活率检测(mtt法)

步骤一，培养小鼠胚胎干细胞(mesc)e14。

将e14接种在铺有1％明胶的96孔板上，铺板密度8000个/孔，用培养基在37℃、5％co2条件下培养18-24h，用于进行后续药物或材料的处理。e14培养基的原料组成为：高糖dmem；15％胎牛血清；0.1mmol/l非必需氨基酸；2mmol/l谷氨酰胺；0.1mmol/lβ-巯基乙醇；1000u/ml白血病抑制因子。在本实验中，培养时间为24h。

步骤二，配制四组溶液，每组溶液分别配制七种浓度，分别为cad溶液、slw溶液、slw-cad溶液以及slw与cad进行物理混合后的slw+cad溶液。

其中，slw-cad中抗肿瘤药物的载药量经紫外吸收光度计检测后计算得到为37.04％。cad溶液、slw-cad溶液以及slw+cad溶液中cad的浓度一致，cad的浓度依次为0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、60μg/ml以及100μg/ml。slw、slw-cad及slw+cad中slw的浓度保持与slw-cad中的slw的浓度一致，slw的浓度分别为0.85μg/ml、1.7μg/ml、8.5μg/ml、17μg/ml、34μg/ml、102μg/ml以及170μg/ml。

步骤三，将步骤一中已培养好的e14细胞弃去上清，每个孔分别加入步骤二中制得的不同浓度的cad、slw、slw-cad以及slw+cad溶液，再培养24h及48h后，每孔中加入20μl用pbs(磷酸盐缓冲溶液)作为溶剂配制的mtt(噻唑蓝)溶液，浓度为5mg/ml，避光放置4h后，每孔再加入150μldmso(二甲亚砜)，避光震荡15min，然后用酶标仪于492nm波长处测od(光密度)值，检测结果见图2。

图2是本发明的实施例中的不同浓度cad、slw、slw-cad及slw+cad物理混合组处理e14细胞24h及48h的细胞毒性结果(mtt法)。其中，横坐标表示各组中药物的浓度，纵坐标表示e14的细胞存活率，空白对照组存活率设为100％。

由图2可知，当cad浓度为0.5μg/ml、1μg/ml及5μg/ml时，经cad组、slw+cad物理混合组、slw组及slw-cad组处理后24h及48h后，与空白对照组相比，细胞存活率差异不大。

随着cad浓度的增加，cad组及slw+cad物理混合组处理后24h及48h后细胞存活率受到严重影响，随着浓度增加，影响效果递增，细胞存活率下降明显。而slw及slw-cad组处理后24h及48h后细胞存活率下降不明显，与对照组无显著差异，表明cad经过slw的搭载，其对胚胎干细胞e14的毒性显著降低。

2、细胞形态及克隆形成能力的观察

细胞按照细胞密度4*10⁴个/ml接种于预先用包被明胶(1％，过夜)的6孔板中，在5％co2、37℃的培养箱中培养24h使细胞融合密度达到50％，用e14培养基配制cad、slw、slw-cad及slw+cad组溶液，使得cad浓度为20μg/ml，处理24h后，e14细胞用倒置显微镜观察形态。对于克隆形成能力的观察，采用碱性磷酸酶(ap)活性检测，未分化的胚胎干细胞的克隆形成能力强，能够合成高浓度的碱性磷酸酶(ap)。对经过20μg/mlcad、slw、slw-cad及slw+cad组处理24h获得的细胞，用4％多聚甲醛固定后进行碱性磷酸酶染色。

图3是本发明的实施例中的cad、slw、slw-cad及slw+cad组处理e14细胞24h后的细胞克隆形态及克隆能力形成图。

由图3可知，从形态上看，加入cad及物理混合组slw+cad后e14细胞量减少，且经典的克隆形态难以形成，表明细胞丧失干细胞特性，转向分化状态。而加入slw和纳米复合抗肿瘤药物slw-cad的e14能够抑制分化，细胞的克隆形态规则，边缘光亮，表明克隆的状态良好；第三排为ap染色后各组克隆形成能力的检测，由图可以看出对照组、slw及纳米复合抗肿瘤药物slw-cad处理后的e14碱性磷酸酶染色呈强阳性，着色深，克隆个数较多，而cad及物理混合组slw+cad处理后的细胞碱性磷酸酶染色很弱，克隆个数明显减少，表明cad经过slw搭载后能够降低对mesc的克隆形态及克隆个数的影响。

3、实时定量pcr检测多潜能基因的表达

将e14按照细胞密度4*10⁴个/ml接种于预先包被明胶(1％，过夜)的6孔板中，在5％co2、37℃的培养箱中培养24h使细胞融合密度达到50％，用e14培养基(配制cad,slw,slw-cad及slw+cad组溶液，使得cad浓度为20μg/ml，处理24h后，采用实时定量pcr检测各组处理后mesc中多潜能因子oct4、nanog、rex1、esrrb的基因表达水平变化。

图4是本发明的实施例中的实时定量pcr检测在去除lif条件下加入cad、slw、slw-cad及slw+cad物理混合组处理e14细胞24h后多潜能基因oct4、nanog、rex1、esrrb的表达水平柱状图。其中，横坐标表示不同的基因，纵坐标表示相对表达水平，对照组的相对表达水平设为1。

由图4可知，lif是维持mesc自我更新的关键因子，因此去lif条件下mesc的干性基因oct4、nanog、esrrb、rex1的表达降低，此时加入cad、slw+cad能够更显著的抑制干性基因表达，而培养过程中加入slw、slw-cad则能使干性基因的表达回升。说明纳米搭载的方式不仅能够消除cad造成的mesc丧失自我更新的特性，还能更好的维持去lif条件下mesc的自我更新和未分化特性。

4、体外胚层分化效果评价

4.1实时定量pcr检测cad、slw、slw-cad、slw+cad处理24h的e14自发分化3天后形成的拟胚体中三个胚层的标志

mesc具有多向分化潜能的特性，能在去lif的悬浮条件下形成拟胚体向三个胚层进行分化。将e14按照细胞密度4*10⁴个/ml接种于预先包被明胶(1％，过夜)的6孔板中，在5％co2、37℃的培养箱中培养24h使细胞融合密度达到50％，用e14细胞培养液配制cad、slw、slw-cad以及slw+cad溶液，使得cad浓度为20μg/ml，处理24h后，将e14细胞悬浮培养形成拟胚体，并在拟胚体分化第三天通过实时定量pcr检测三胚层对应的标志基因，其中nestin、tuj1代表外胚层，eomes、t代表中胚层，sox17、cxcr4代表内胚层。

图5是本发明的实施例中的实时定量pcr检测cad、slw、slw-cad、slw+cad处理24h的e14自发分化3天后形成的拟胚体中三个胚层相关基因的表达水平柱状图。其中，横坐标表示不同的基因，纵坐标表示相对表达水平。

由图5可知，与对照组相比，加入cad组对外胚层基因的抑制效果最为明显，其中nestin表达仅为对照组的8％、tuj1为22％，对中胚层的基因表达也具有一定的抑制效率，其中eomes的表达为对照的56％、t的表达为72％，对内胚层基因(sox17、cxcr4)的影响不显著；加入物理混合体系slw+cad组对三胚层基因的抑制效率与cad组基本一致；而加入slw组和加入slw-cad组则对三胚层的分化都无显著影响，三胚层基因与对照组相比都能较好的表达。

4.2免疫细胞化学染色检测slw-cad处理24h的e14自发分化7天后的拟胚体中三个胚层的标志

将e14按照细胞密度4*10⁴个/ml接种于预先包被明胶(1％，过夜)的6孔板中，在5％co2、37℃的培养箱中培养24h使细胞融合密度达到50％，用e14细胞培养液配制slw-cad溶液，使得cad浓度为20μg/ml，处理24h后，将e14细胞悬浮培养形成拟胚体，拟胚体形成7天后进行免疫荧光染色。用4％pfa(多聚甲醛)固定细胞10min，0.25％tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)通透10min，5％山羊血清封闭1h，选用rabbitanti-nestin/sma/afp一抗在4℃孵育过夜，fitc标记的羊抗兔荧光二抗孵育1h，dapi进行细胞核染色，最后用荧光共聚焦显微镜观察染色情况。选用的胚层标志为：nestin(巢蛋白)作为外胚层标志，sma(平滑肌肌动蛋白)作为中胚层标志，afp(甲胎蛋白)作为内胚层标志。

图6是本发明的实施例中的免疫细胞化学染色检测slw-cad处理24h的e14自发分化7天后的拟胚体中三胚层标志的表达效果图。其中，标记dapi的图片表示经dapi进行染色的细胞核的表达效果，标记nestin、sma以及afp的图片表示其相应的表达效果。

由图6可知，slw-cad处理后的e14能够进行自发分化形成拟胚体，并且形成的拟胚体和对照组相比，nestin、sma以及afp三胚层免疫荧光染色与对照组相似，荧光信号较强，说明slw-cad处理后的mesc形成的拟胚体能够向三个胚层进行分化，表明其具有多潜能性。

5、体内效果

采用胚胎期小鼠作为体内模型研究药物引起的胚胎毒性效应，并对临床研究提供借鉴。将年龄体重相似的icr小鼠按雌雄2:1合笼，次日早验栓确定孕鼠并标记此时间为e0天，从孕鼠e3.5天开始经腹腔注射磷酸盐缓冲液(pbs)、cad和slw-cad溶液各0.1ml，(cad、slw-cad溶液中cad浓度为2.5mg/kg，用pbs配制)，每隔一天注射一次。e15.5天用体视显微镜观察胎鼠健康状况、器官畸形率及致死率，并在母鼠妊娠后三天将子代鼠麻醉观察其发育状态，cad处理后如果母鼠未能顺利产下健康子代鼠，则将其解剖取出进行对比观察。

图7是本发明的实施例中的pbs、cad及slw-cad注射孕鼠后，在e15.5天的胎鼠形态图与出生后三天后的子代鼠形态图。其中，a是在e15.5天的胎鼠形态图，b是出生后三天后的子代鼠形态图。

由图7可知，pbs注射孕鼠后，在e15.5天剖出的胎鼠发育良好，身体各部分组织器官无明显畸形及发育障碍情况，出生后三天子代鼠的体重、身长等明显增加，行动能力正常。而cad注射后的母鼠在e15.5天剖出的胎鼠发育明显滞缓于pbs组，且有较高的致死率，表明药物对其发育造成的显著毒性，甚至在正常妊娠期超过三天后仍未能产出子代鼠。经解剖取出后观察，子代鼠中仅有一只能观察到残存的形态。而用经过纳米材料搭载后的slw-cad注射母鼠后，在e15.5和出生后三天观察胎鼠的形态及发育，可以看到其毒性得到很大程度的缓解，达到与对照组相当的水平，表明纳米材料的搭载有效的降低了药物引起的胚胎毒性及胚胎发育障碍的现象，具有较好的防治效果。

实施例的作用与效果

根据本实施例所涉及的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法，通过该方法制得的纳米复合抗肿瘤药物，因为从细胞存活率检测实验、细胞形态及克隆形成能力的观察、实时定量pcr检测多潜能基因的表达、体外胚层分化效果评价以及体内效果等实验结果可知，与未搭载纳米层状双氢氧化物slw的抗肿瘤药物对比，搭载纳米层状双氢氧化物slw的抗肿瘤药物slw-cad对胚胎干细胞的毒性显著降低，能够降低对mesc的克隆形态及克隆个数的影响，维持去除lif条件下oct4、nanog、esrrb、rex1的表达，能够向三个胚层进行分化，具有多潜能性，有效的降低了药物引起的胚胎毒性及胚胎发育障碍的现象，所以根据本实施例的低胚胎毒性的纳米复合抗肿瘤药物的制备方法得到的纳米复合抗肿瘤药物具有低胚胎毒性的优点，具有广阔的应用前景。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。