一种鳗鱼肽在制备促进免疫的食品、药品或保健品中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种鳗鱼肽在制备促进免疫的食品、药品或保健品中的应用。

背景技术：

免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质(如病菌等)，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康，抵抗或防止微生物或寄生物的感染或其它所不希望的生物侵入的状态。一氧化氮(no)和一氧化氮合酶(inos)是体内重要的生理递质和细胞间、细胞内的信号分子，参与机体生理过程的调节和宿主防御及免疫反应。免疫过程中巨噬细胞在受到外界刺激处于应激状态时，会产生呼吸爆发，通过nadph氧化酶产生大量的超氧自由基和活性氧(ros)；与此同时细胞内的可诱导型一氧化氮合酶蛋白(inos)被诱导表达，产生大量的一氧化氮(no)，一氧化氮自由基(no·)通过刺激巨噬细胞诱导受感染细胞的炎症和死亡，起到对抗外源性微生物的细胞毒作用。nf-κb是一类参与调节免疫应答、炎症反应、凋亡、增殖等多种功能的核转录因子，具有重要的生理和病理作用。nf-κb是由p50和p65两个亚基组成，在静息状态下，nf-κb与其抑制蛋白iκb-α结合形成复合物，游离于胞浆中；当被激活后，nf-κb的p65亚基和iκb-α被磷酸化，nf-κb与iκb-α解离，随后nf-κb进入细胞核与dna结合，发挥转录调控作用。在炎症反应中，炎症介质no及相关细胞因子tnf-α、il-6的产生，都与nf-κb信号通路的激活息息相关。

鳗鱼俗称“海中人参”，营养价值极高，深受消费者青睐。我国鳗鱼养殖产量巨大，经济价值十分可观。鳗鱼多肽水解物除了含有丰富的鳗鱼多肽外，还含有氨基酸、矿物质及其它活性物质，充分保留了鳗鱼肉的主要营养保健成分，同时多肽也可能增加某些新的保健功能，而且更易消化吸收。因此，鳗鱼多肽水解物，可用于开发功能食品；同时，由于其美味可口，也用于开发高档调味料，应用前景广泛。据《护理报》报道，鳗鱼的营养成分比鲈鱼、鸡肉、牛肉等高得多，维生素、矿物质和微量元素含量更是陆上动物所不能比拟的。科学研究表明，鳗鱼是含epa和dha(深海鱼油成分，dha为二十二碳六烯酸，epa为二十碳五烯酸)最高的鱼类之一，不仅可以降低血脂、抗动脉硬化、抗血栓，还能为大脑补充必要的营养素。dha能促进青少年大脑发育，增强记忆力，也有助于老年人预防大脑功能衰退与老年痴呆症。医学专家还发现，鳗鱼兼有鱼油和植物油的有益成分，是补充人体必须的脂肪酸、氨基酸的理想食品。鳗鱼的锌含量、高度不饱和脂肪酸含量和维生素e的含量都很高，可辅助预防朽迈和动脉硬化，从而具有护肤美容作用。营养成份富含维生素a和维生素e，含量分别是普通鱼类的60倍和9倍，其他维生素如维生素b1、维生素b2含量同样很丰富。此外，鳗鱼还含有大量的钙质，对于预防骨质疏松症也有一定的效果。鳗鱼体内含有一种很稀有的西河洛克蛋白，其鱼骨和肉含有丰富的优质蛋白和各种人体必需的氨基酸，如何更好的利用鳗鱼中的蛋白营养成分，已成为科研工作者的工作重点。

技术实现要素：

本发明为了克服现有鳗鱼活性成分的应用开发不足的缺陷，提供了鳗鱼肽在制备促进免疫的食品、药品或保健品中的应用，鳗鱼肽无细胞毒性，并能诱导细胞活性提高，可作为促进免疫的食品、药品或保健品的制备原料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了鳗鱼肽在制备促进免疫的食品、药品或保健品中的应用。

优选的，所述鳗鱼肽由包括以下步骤的方法制备得到：

(1)将鳗鱼鱼骨蒸煮后粉碎，蛋白酶酶解，固液分离，取液体部分即得酶解液；

(2)将酶解液依次进行过滤、脱色和板框过滤，得到精制液；

(3)将精制液浓缩后精密过滤，精密过滤所得滤液喷雾干燥，磁选，得到鳗鱼肽粗粉；

(4)将鳗鱼肽粗粉依次以离子交换柱、分子筛纯化，干燥，得到鳗鱼肽。

优选的，所述鳗鱼肽的平均分子量为485～1800da。

优选的，所述促进免疫包括促进inos蛋白表达、激活nf-κb信号通路、诱导tnf-α和il-6分泌。

优选的，所述食品、药品或保健品的剂型包括片剂、口服液、粉剂或膏剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了鳗鱼肽在制备促进免疫的食品、药品或保健品中的应用。如本发明的具体实施例的实验所示，采用griess法检测鳗鱼肽对小鼠巨噬细胞(raw264.7细胞)产生no含量的影响，研究发现鳗鱼肽促进巨噬细胞no的释放，并具有剂量依赖性。用cck-8法检测对鳗鱼肽对巨噬细胞活力的影响，结果表明鳗鱼肽不影响巨噬细胞的细胞活力，无细胞毒作用。进一步，通过蛋白免疫印迹法测定raw264.7细胞一氧化氮合酶(inos)蛋白以及nf-κb信号通路的表达情况，发现鳗鱼肽可以很好地诱导inos的表达并激活nf-κb信号通路。最后，通过elisa法检测鳗鱼肽对raw264.7细胞tnf-α，il-6分泌量的影响，发现鳗鱼肽促进raw264.7细胞tnf-α和il-6的释放，并具有剂量依赖性。因此，该鳗鱼肽具有良好的增强免疫功效，说明该鳗鱼肽可作为新型的促免疫食品、药物或保健品用途进行开发。

附图说明

图1鳗鱼肽对raw264.7细胞no生成量的影响；

图2鳗鱼肽对raw264.7细胞的细胞活力影响；

图3鳗鱼肽对raw264.7细胞inos蛋白表达量的影响；

图4鳗鱼肽对raw264.7细胞nf-κb信号通路的影响；

图5鳗鱼肽对raw264.7细胞tnf-α分泌量的影响；

图6鳗鱼肽对raw264.7细胞il-6分泌量的影响。

具体实施方式

本发明提供了鳗鱼肽在制备促进免疫的食品、药品或保健品中的应用。在本发明中，所述鳗鱼肽的平均分子量为485-1800da。

本发明所述鳗鱼肽可来源于市售商品，也可自行制备。在本发明中，所述鳗鱼肽的优选的由包括以下步骤的方法制备得到：

(1)将鳗鱼鱼骨蒸煮后粉碎，蛋白酶酶解，固液分离，取液体部分即得酶解液；

(2)将酶解液依次进行过滤、脱色和板框过滤，得到精制液；

(3)将精制液浓缩后精密过滤，精密过滤所得滤液喷雾干燥，磁选，得到鳗鱼肽粗粉；

(4)将鳗鱼肽粗粉依次以离子交换柱、分子筛纯化，干燥，得到鳗鱼肽。

本发明将鳗鱼鱼骨蒸煮后粉碎，蛋白酶酶解，固液分离，取液体部分即得酶解液；

在本发明中，选择鳗鱼的鱼骨作为原料制备鳗鱼肽，这主要是因为鳗鱼骨是鳗鱼食品加工后无价值的副产品，有利于废物循环利用。在本发明中，所述鳗鱼鱼骨蒸煮前优选的以水漂洗，漂洗的目的是去除鱼骨中的杂质和内脏等。在本发明中，漂洗的水优选为纯水。在本发明中，所述漂洗的温度优选冰水0～20℃。

在本发明中，所述鳗鱼鱼骨鳗鱼鱼骨的蒸煮温度优选为90～95℃；所述蒸煮的优选为40～120min，更优选为60min。在本发明中，所述粉碎的粒度优选为60～120目，更优选为80目。在本发明中，所述蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、风味蛋白酶。在本发明中，所述酶解的时间优选为2～4h，更优选为3h。在本发明中，所述酶解的温度优选为50～70℃，更优选为60℃。本发明对所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域已知的固液分离的方法即可，例如过滤。

得到酶解液后，本发明将酶解液依次进行过滤、脱色和板框过滤，得到精制液。

在本发明中，所述过滤优选的采用布袋过滤，所述布袋的材质包括但不限于为pp(聚丙烯)、pe(聚酯)、ptfe(聚四氟乙烯)。在本发明中，所述脱色优选的采用活性炭进行脱色。在本发明中，所述板框过滤中，板框滤膜的孔径优选为80～150目，更优选为120目。

得到精制液后，本发明将精制液浓缩后精密过滤，精密过滤所得滤液喷雾干燥，磁选，得到鳗鱼肽粗粉。

在本发明中，所述浓缩的方式优选为低温浓缩，所述低温在10℃以下。在本发明中，所述精密过滤纳滤是用0.45μm的滤膜过滤可除去肽液中的菌类及杂质。在本发明中，喷雾干燥后得到的鳗鱼肽粗粉的粒径在4～80目范围内。

在本发明中，磁选可以将肽粉中的金属碎屑除去。

得到鳗鱼肽粗粉后，本发明将鳗鱼肽粗粉依次以离子交换柱、分子筛纯化，干燥，得到鳗鱼肽。

在本发明中，所述离子交换柱的规格优选为deae葡聚糖a25凝胶分离。进一步分子筛的规格优选为p6柱分离获得有活性的鳗鱼肽。

如本发明的具体实施例所示，鳗鱼肽的促进免疫作用包括促进raw264.7细胞的inos蛋白表达、激活nf-κb信号通路、诱导tnf-α和il-6分泌，即表明鳗鱼肽对细胞具有提高免疫的作用。

在本发明中，所述食品、药品或保健品的剂型包括但不限于片剂、口服液、粉剂或膏剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1鳗鱼肽的制备

将鳗鱼鱼骨通过冰水漂洗得到粗产物。将粗产物进行粉碎90度蒸煮60min，60℃用胰蛋白酶和风味蛋白酶共同酶解2小时得到鳗鱼肽酶解液。将鳗鱼肽酶解液经过布袋过滤，活性炭脱色，板框过滤，到鳗鱼肽精提液。将鳗鱼肽精提液通过低温纳滤浓缩，冷却，喷雾干燥，得到鳗鱼肽粉。将鳗鱼肽粉通过离子交换柱deae葡聚糖a25凝胶分离，p6柱分子筛分离得到鳗鱼活性肽。

该鳗鱼鱼骨肽粉溶于水，粉白，无味道，肽含量98％。

实施例2

实验原料与实验方法：

1、实验原料以及相关试剂

本实验的鳗鱼肽来源于汕尾市维明生物科技股份有限公司(按照实施例1所示方法制备得到)；高糖dmem培养基、青霉素、链霉素购于美国hyclone公司；胎牛血清购于bi公司；no检测试剂盒、cck-8试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所；细胞裂解液购于上海博彩生物科技公司；inos，p-iκb，iκb，p-p65，p65单克隆抗体，山羊兔二抗购于德国cst公司；ecl发光液购于thermofisherscientific公司；lps及其他常用生化试剂购于sigma公司；小鼠tnf-α、il-6elisa试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司。

2、实验方法

2.1细胞培养

小鼠巨噬细胞raw264.7购自美国模式培养物保藏所，培养在由90％高糖dmem培养基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素构成的完全培养基中，置于37℃、5％co2细胞培养箱。

2.2no检测

将小鼠巨噬细胞raw264.7以1×10⁵个/孔接于96孔板中，37℃培养4h后吸弃上清液，实验组每孔加入90μl的无血清高糖dmem培养基与10μl不同浓度的鳗鱼肽(160μg/ml，800μg/ml，1600μg/ml)，阳性对照组每孔加入90μl的无血清高糖dmem培养基与10μllps(100ng/ml)，空白对照组加入100μl无血清高糖dmem培养基，在37℃继续培养24h。

然后将待检测的培养上清吸出，依次放在一个新的96孔板中，将标准孔和实验孔分别加入50μlsulfanilamide溶液，室温下避光孵育5～10min，再分别加入50μlned溶液，室温下避光孵育5～10min。在30min内，用a550nm和a630nm双波长同时读值，结果处理时用a550nm读数减去a630nm的读数。根据标准曲线，计算出细胞no含量。

2.3蛋白免疫印迹

将小鼠巨噬细胞raw264.7细胞(2×106个/孔)接种于6孔板中，待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入含鳗鱼肽16μg/ml，80μg/ml，160μg/ml的培养基共培养24h。然后用预冷的pbs洗涤细胞3次，加入含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液，4℃中裂解细胞30min，收集细胞裂解液。然后，通过bca蛋白定量试剂盒检测细胞裂解液中总蛋白质浓度。将含等量蛋白的细胞裂解液溶液与6×loadingbuffer按1:5的比例混合，配置成蛋白上样液，于沸水浴中煮沸10min，瞬时离心，并用10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳条件为80v20min、120v100min。然后，在100ma电流下电转100min，将蛋白转印到pvdf膜上。在室温下用含5％脱脂奶粉的封闭液封闭2h，于4℃与一抗(1:1000)杂交过夜。然后用tbst洗膜3次，加入二抗(1:10000)，在室温杂交2h，用tbst洗膜3次后，显影。

2.4细胞活力检测

将小鼠巨噬细胞raw264.7细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为1×10⁵个，贴壁培养2～6h，弃去上清液，分别加入含鳗鱼肽16μg/ml，80μg/ml，160μg/ml的培养基100μl共培养24h，之后于每孔中加入10μlcck-8试剂，孵育1h后，用酶标仪检测在波长450nm下的吸光值。

2.5细胞因子检测

将raw264.7细胞或者原代巨噬细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2×10⁵个，贴壁培养2-6h，弃去上清液，分别加入含鳗鱼肽16μg/ml，80μg/ml，160μg/ml的培养基100μl共培养24h。用elisa法检测细胞上清液中各细胞因子的含量。根据说明书进行实验操作，最后用酶标仪检测450nm波长下的吸光值。

3、实验结果：

3.1鳗鱼肽对raw264.7细胞生成no的影响

巨噬细胞通过反应性氮中间物作用系统产生no，进而发挥杀伤功能。如图1所示，用含不同浓度的鳗鱼肽完全培养基培养raw264.7细胞24h后，测定细胞产生no的能力，结果表明，鳗鱼肽可有效促进raw264.7细胞产生no，且其作用呈现剂量依赖性。

3.2鳗鱼肽对raw264.7细胞活力的影响

通过cck-8剂盒检测鳗鱼肽对raw264.7细胞细胞活力的影响，结果如图2所示，不同浓度(16μg/ml，80μg/ml，160μg/ml)的鳗鱼肽与raw264.7细胞共培养24h后，实验组与对照组相比，细胞活力没有降低，表明鳗鱼肽对raw264.7细胞没有毒性作用。

3.3鳗鱼肽对raw264.7细胞inos蛋白表达量的影响

在免疫细胞中，一氧化氮合酶inos可被诱导生成胞内信使no进行免疫调节。结果如图3所示，鳗鱼肽可促进raw264.7细胞inos的蛋白表达，并且具有剂量依赖性。

3.4鳗鱼肽对raw264.7细胞nf-κb信号通路的影响

nf-κb是一类参与调节免疫应答、炎症反应、凋亡、增殖等多种功能的核转录因子，具有重要的生理和病理作用。结果如图4所示，鳗鱼肽可促进raw264.7细胞nf-κb信号通路中激酶(p-iκb，p-p65)表达，并且具有剂量依赖性。

3.5.鳗鱼肽对raw264.7细胞tnf-α，il-6分泌量的影响

tnf-α是能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，参与调节免疫应答、炎症反应等重要的生理和病理活动。结果如图5所示，鳗鱼肽可促进raw264.7细胞tnf-α的分泌，并且具有剂量依赖性。

il-6是能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能的细胞因子，具有重要的生理和病理作用。结果如图6所示，鳗鱼肽可促进raw264.7细胞il-6细胞因子的分泌，并且具有剂量依赖性。

4、结论

综上所述，鳗鱼鱼骨经过漂洗，粉碎，酶解，纯化、分离得到的多肽产物——鳗鱼肽可有效诱导raw264.7细胞免疫活性的增强。根据研究可得出以下结论：

第一：鳗鱼肽可有效诱导raw264.7细胞生成no，且其作用呈现剂量依赖性；

第二：鳗鱼肽对raw264.7细胞活力没有细胞毒性作用；

第三：鳗鱼肽可有效诱导raw264.7细胞的inos蛋白的表达，且其作用呈现剂量依赖性；

第四：鳗鱼肽可有效激活raw264.7细胞的nf-κb信号通路，且其作用呈现剂量依赖性；

第五：鳗鱼肽可有效诱导raw264.7细胞的tnf-α，il-6的分泌，且其作用呈现剂量依赖性

综上所述，本研究首次发现鳗鱼肽具有诱导raw264.7细胞产生no，诱导inos的表达，激活nf-κb信号通路，促进tnf-α，il-6分泌的作用，证明了鳗鱼肽具有良好的免疫调节活性，将其作为一种新型的促免疫药物和保健品，具有广阔的市场应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。