油菜花总黄酮的纯化方法与流程

本发明涉及植物黄酮类代谢产物提取纯化领域，具体地，本发明涉及一种使用ab-8大孔树脂纯化油菜花总黄酮的方法。

背景技术：

黄酮类化合物是广泛存在于多种植物中的植物次生代谢活性产物，其为天然的抗氧化剂，根据研究黄酮类化合物具有清除人体中自由基、增强免疫力、降低血糖和血脂等生物学活性，在食品、药品、化妆品、保健品方面都有广阔的应用前景。油菜是世界范围内广泛种植的花卉和油料作物，油菜花中黄酮类化合物种类多样且含量丰富，是药用、食品用总黄酮的低成本良好来源。

目前油菜花中黄酮类化合物提取常用加热回流粗提方法(如cn105769967a)，也有使用超声波提取油菜花花粉中总黄酮的记载，上述方法效率高但无法有效去除色素、蛋白、脂质、糖类等杂质，对于科研和精细医药保健产品的制备不利。常规层析类精密提取方法则在成本上无法满足药用、特别是大量食品用的需求。大孔树脂是近年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，其理化性质稳定，不溶于酸碱及有机溶剂，不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰，吸附效果好，再生简便，使用周期长，适合用于总黄酮类天然产物的分离纯化。

技术实现要素：

申请人研究了多种不同大孔树脂对油菜花粗黄酮的吸附、解吸动力学特征，选择了适合纯化油菜花总黄酮的大孔树脂，并在此基础上优化了样品浓度、样品ph、流速、洗脱剂浓度、洗脱剂体积等因素，构建了使用大孔树脂高效纯化油菜花总黄酮的方法。申请人意外地发现，大孔树脂纯化的油菜花总黄酮不仅得到了有效纯化，而且其具有超过一般黄酮类化合物提取物的抗氧化能力，在等浓度情况下甚至超过了vc和trolox，是一种廉价和高效的抗氧化剂来源，有望取代部分vc的应用。

一方面，本申请提供了一种使用大孔树脂从油菜花总黄酮提取液纯化油菜花总黄酮的方法，包括制备油菜花总黄酮提取液、大孔树脂吸附和洗脱步骤，所用的大孔树脂为：d101、ab-8或dm1303。

进一步地，所用的大孔树脂为：ab-8。

进一步地，洗脱步骤中使用的洗脱剂为浓度为50％的乙醇。

进一步地，油菜花总黄酮提取液的制备方法为：将新鲜油菜花置于60℃鼓风干燥箱中干燥至恒重，粉碎过60目筛。准确称取油菜花粉末一定量，按料液比1:16加入73％乙醇溶液，于73℃加热回流60min，抽滤，得到油菜花黄酮提取液，将提取液黄酮含量调整至1mg/ml，ph调至5。

进一步地，大孔树脂吸附步骤为：将ab-8大孔树脂以95％乙醇浸泡树脂24h充分溶胀后湿法装柱；以95％乙醇冲洗至流出液加水至乙醇：水＝1:5不显浑浊为止，然后以蒸馏水洗去乙醇，至水洗液无醇味为止，依次用2bv5％naoh溶液、蒸馏水、2bv5％hcl溶液、蒸馏水冲洗，最后至中性；以2ml/min流速上样。

进一步地，洗脱步骤为：使用5bv体积浓度为50％的乙醇，以0.5ml/min流速洗脱。

另一方面，本申请提供了大孔树脂ab-8在纯化油菜花总黄酮中的应用。

进一步地，该应用中使用浓度为50％的乙醇从大孔树脂ab-8上洗脱油菜花总黄酮。

另一方面，本申请提供了使用上述方法纯化的油菜花总黄酮。

另一方面，本申请提供了上述油菜花总黄酮作为抗氧化剂的应用。

本申请的方法适用于各种产地和具体品种的油菜花，包括但不限于甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜。

本申请的方法中使用的大孔树脂、乙醇等试剂以及回流提取、柱等设备可以采用各种来源的产品，只要其符合规格和要求。

本申请的方法纯化的油菜花总黄酮可以作为抗氧化剂用于需要抗氧化剂的各种应用，包括但不限于用于食品、药品、保健品、化妆品、发酵以及其他工业加工过程。

附图简述

图1：不同大孔树脂静态吸附动力学曲线；

图2：样品浓度吸附动力学曲线；

图3：上样ph对吸附的影响；

图4：上样流速对吸附率的影响；

图5：洗脱剂乙醇浓度对解吸率的影响；

图6：洗脱剂用量对解吸率的影响；

图7：油菜花黄酮纯化产物的总抗氧化能力。

具体实施方式

材料、试剂和仪器

提取材料：普通甘蓝型油菜，2014年9月在淮阴师范学院“生物科技园”油菜隔离区种植以上油菜品种，油菜隔离区四周建有围墙且墙外无农田，充分满足环境隔离条件。2015年3月-4月油菜盛花期，采集盛开鲜花。

试剂：树脂d101、ab-8、dm130、nka-9、s-8，山东东鸿化工有限公司，型号和特性见表1；乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为国产常规型号。

表1实验用大孔树脂主要性质

仪器：is9001电子天平，sartotius公司；infinitem200pro酶标仪，瑞士tecan公司；fw100高速万能粉碎机，天津市秦思特仪器有限公司；re2000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；shb-ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；dhg-9140a电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；dk-s28电热恒温鼓风干燥器，上海精宏实验设备有限公司；direct-q3超纯水系统，美国millipore公司。柱型号：400×30mm。

实施例1油菜花总黄酮提取液的制备和黄酮含量的测定

油菜花总黄酮提取液的制备

将新鲜油菜花置于60℃鼓风干燥箱中干燥至恒重，粉碎过60目筛。准确称取油菜花粉末一定量，按料液比1:16加入73％乙醇溶液，于73℃加热回流60min，抽滤，得到油菜花黄酮提取液。

黄酮含量的测定

精密称取105℃干燥至质量恒定的芦丁标准品50mg，用70％乙醇定容至100ml，混匀，制得芦丁标准品溶液，备用。精密移取芦丁标准品溶液0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48ml分别置于ep管内用70％乙醇补足体积至0.48ml，混匀，加入5％nano20.08ml，混匀后静置6min，加入10％al(n03)30.08ml，混匀后静置6min，加入4％naoh0.8ml，再加入0.56ml70％乙醇使体积为2ml，混匀后静置15min，分别精密移取0.2ml不同浓度的芦丁标准品溶液置于96孔板，于510nm下测定吸光值。以芦丁浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。结果得吸光度与芦丁浓度的标准曲线y＝4.6346x+0.0383(x：芦丁浓度，mg/ml；y：吸光值)，r²＝0.9998。

实施例2大孔树脂的筛选

树脂的预处理：

将上述ab-8、d101、dm130、nka-9、s-8分别以95％乙醇浸泡树脂24h充分溶胀后湿法装柱，以95％乙醇冲洗至流出液加水(乙醇：水＝1:5)不显浑浊为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇，至水洗液无醇味为止。依次用2bv5％naoh溶液、蒸馏水、2bv5％hcl溶液、蒸馏水冲洗，最后至中性。

大孔树脂静态吸附率及解吸率的测定：

准确称量一定量的大孔树脂，预处理好后置于250ml锥形瓶中，加入15ml的油菜花黄酮提取液，于恒温振荡摇床以25℃、180r/min振荡吸附24h至吸附平衡，过滤，测定总黄酮浓度。将吸附饱和的大孔树脂用蒸馏水洗至洗脱液无色，过滤，吸干表面水分，加入60％乙醇溶液50ml，于恒温振荡摇床以25℃、180r/min振荡24h进行解吸实验，过滤树脂，测定洗脱液中总黄酮浓度。

吸附量

吸附率

解吸率

式中：c0：吸附液初始浓度，mg/ml；c1：吸附液平衡后浓度，mg/ml；v1：吸附液体积，ml；c2：洗脱液浓度，mg/ml；v2：洗脱液体积ml；w：树脂质量，g。

大孔树脂静态吸附动力学实验：

准确称量一定量的大孔树脂，预处理好后置于250ml锥形瓶中，加入15ml油菜花黄酮提取液于恒温振荡摇床以25℃、180r/min振荡12h，在1、2、3、4、5、6、8、12、24h时取样，测定总黄酮浓度，计算不同时间的吸附率，得出静态吸附动力学曲线。

实验结果如表2和图1所示：

表2大孔树脂静态吸附及解吸能力的比较

结果显示弱极性大孔树脂ab-8对油菜花黄酮的吸附率(74.85％)和解析率(79.14％)均最高；随着大孔树脂极性的增加，油菜花黄酮的吸附率和解析率均降低，吸附率极性树脂s-8最低为34.28％，解析率极性树脂nka-9最低为46.73％；这与油菜花黄酮化合物的特性相关：油菜花中的黄酮类化合物多为弱极性，具有一定的亲水性，根据相似相容原理，极性树脂对样品目标成分的吸附能力较弱，而弱极性或非极性树脂对目标成分的吸附能力较强。此外，吸附率和解析率较大的3种树脂(d101、ab-8、dm1303)均具有孔径较小、比表面积较大的特点，均可用于纯化油菜花总黄酮。综合考虑，选用ab-8作为纯化油菜花总黄酮的最适合大孔树脂用于进一步研究。

实施例3大孔树脂纯化油菜花总黄酮方法的优化

样品浓度对吸附的影响：

选取5种不同浓度的油菜花上样溶液，置于加有适量大孔树脂的250ml锥形瓶中，于恒温振荡摇床以25℃、180r/min振荡吸附2h，过滤，测定滤液中总黄酮含量，计算不同样品浓度下树脂对黄酮的吸附率。

样品ph对吸附的影响：

将一定浓度的油菜花上样溶液分别用1mol/lnaoh和5％hcl调节ph为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的吸附液，置于加有适量大孔树脂的250ml锥形瓶中，于恒温振荡摇床以25℃、180r/min振荡吸附2h，过滤，测定滤液中总黄酮含量，计算样品不同ph下树脂对黄酮的提取率。

上样流速对吸附的影响：

将一定浓度的油菜花上样溶液分别以1、2、3、4ml/min的速率通过大孔树脂层析柱，用蒸馏水洗脱，收集流出液，测定流出液中总黄酮的含量，计算不同流速下树脂对黄酮的吸附率。

洗脱剂乙醇浓度的选择：

将一定浓度的油菜花黄酮提取液以2ml/min的速率通过大孔树脂层析柱，静置2h，收集流出液，测定流出液中总黄酮的含量，然后用蒸馏水冲洗去除杂质，分别用40％、50％、60％、70％、80％、95％乙醇溶液以0.5ml/min流速洗脱，测定洗脱液中总黄酮含量。计算不同乙醇浓度下树脂的解吸率。

洗脱剂体积的选择：

将一定浓度的油菜花黄酮提取液以2ml/min的上样速率通过大孔树脂层析柱，饱和吸附，静置2h，然后用蒸馏水冲洗去除杂质，用60％乙醇以0.5ml/min流速洗脱，收集洗脱液，分别测定1、2、3、4、5、6、7、8bv时洗脱液中总黄酮含量。计算不同洗脱剂体积下树脂的解吸率。

树脂富集能力的评价

油菜花黄酮提取液平均分为两份，其中一份按照以上工艺优化得到的条件纯化，计算大孔树脂纯化富集后纯度；另一份不过大孔树脂富集纯化，计算上柱纯化前油菜花总黄酮样品纯度。

式中：m1：样品中黄酮质量，mg；m2：样品浓缩至无醇味，冷冻干燥后质量，mg；m3：产品中黄酮质量，mg；m4：产品浓缩至无醇味，冷冻干燥后质量，mg。

富集倍数＝经大孔树脂富集后产品纯度/上柱纯化前油菜花粗黄酮样品纯度。

大孔树脂纯化抗除草剂油菜花黄酮粗提物

按照以上大孔树脂工艺优化得到的最佳条件，分别纯化4种油菜花粗黄酮，测得总黄酮含量，将洗脱液浓缩至无有机溶剂残留，冷冻干燥后称重，计算纯度。

所有样品重复制备3次，实验数据采用spss19.0软件进行单因素方差分析。

实验结果如图2-6所示：

图2显示样品浓度对吸附率有影响：样品浓度低时，吸附粘度小，吸附率低，随着样品浓度的增加，树脂ab-8对样品中黄酮类物质的吸附率逐渐增大，但当样品黄酮浓度达到一定值后，树脂的吸附率不再随黄酮浓度的增加而变化，而基本保持不变。当样品中总黄酮浓度高于1mg/ml时，吸附率基本持平。

图3显示：样品ph可以通过改变样品中黄酮类化合物的存在形式、极性，进而改变其溶解度，影响黄酮类化合物与大孔树脂分子间作用力。观察上样ph对吸附率的影响，在一定范围内，上样ph增大，树脂ab-8对样品中黄酮的吸附率，先是随ph值的增大而增加，当样品ph值为5时，吸附率最大，之后吸附率随ph值的增大而减少。

图4显示：上样流速对吸附有一定的影响，上样流速对吸附有一定的影响，上样流速越大，树脂对黄酮的吸附量越小，吸附率越低。当流速达到3ml/min时，吸附率明显下降。这是因为流速过快，黄酮溶液与树脂接触时间较短，黄酮类物质还未完全扩散并吸附到数值内表面就已经流出。流速为1ml/min时，吸附量最大，吸附率最高，但吸附时间较长，效率较低。综合考虑吸附量和效率因素，选择2ml/min作为上样流速。

图5显示当洗脱剂乙醇浓度为50％时，解吸率最高，洗脱效果最好，过高或过低的浓度都对洗脱效果不利。这可能是由于乙醇浓度不同，极性不同，造成黄酮类物质与树脂的分子间作用力不同，同时黄酮类物质在不同浓度乙醇中的溶解度也不同。

图6显示洗脱剂体积与解吸率呈正相关关系。随着洗脱剂体积的增加，解吸率相应增大。当洗脱剂体积达到5bv时，解吸率为80.32％，之后洗脱剂体积增加解吸率提高幅度很小，洗脱已经接近终点。综合考虑，选择5bv为最佳洗脱体积。

综合以上实验数据，大孔树脂ab-8纯化油菜花黄酮提取液的最佳优化条件如下：提取液浓度大于1mg/ml、ph值5，提取液上样流速2ml/min，洗脱剂乙醇溶液浓度50％、体积5bv，洗脱流速0.5ml/min。

将油菜花乙醇提取物过ab-8树脂纯化，上柱纯化前油菜花总黄酮样品纯度为6.72％，经大孔树脂富集后产品纯度为61.33％，计算得出ab-8树脂的富集倍数为9.13倍。

实施例4油菜花黄酮纯化产物的总抗氧化能力测定

使用铁离子还原法测定所提取总黄酮的抗氧化能力：

取1.0ml样品液加入到7.5mlfrap工作液中(10mmol/ltptz、20mmol/lfecl3、0.3mol/lph3.6醋酸盐缓冲液以1:1:10的比例混合，预热至37℃备用)，摇匀后于37℃水浴中静置10min，于593nm波长处测得吸光值。每个处理均做3次重复。

feso4溶液标准曲线绘制：配制浓度为不同浓度的feso4溶液，以fes04浓度为x轴，吸光度为y轴绘制标准曲线，得回归方程，样品的抗氧化活性以达到同样吸光值所需的feso4毫摩尔数所示。

结果如图7所示：比较等浓度的纯化后油菜花黄酮提取物、vc和trolox，结果显示纯化黄酮的铁离子还原力frap值最高，抗氧化能力优于vc和trolox。