一种治疗糖尿病肾病的中药组合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于药学技术，特别是涉及一种治疗糖尿病肾病蛋白尿的中药组合物及其制备方法与应用。

背景技术：

目前，我国糖尿病的高发病率已成为影响国民经济和社会发展的公共卫生问题，严重危害国民健康。其中，糖尿病肾病(diabeticnephropathy，dn)作为最为常见的临床并发症，是导致糖尿病患者进展至尿毒症的重要病因。研究表明，蛋白尿不仅是大多数早、中期dn患者的主要临床表现，更是其肾功能恶化的独立危险因素。因此，临床上，控制蛋白尿是延缓dn进展的基础治疗手段。国内外的研究显示，iii期(丹麦mogensen分期)dn患者往往出现难治性蛋白尿，也就是尿中有“分子量各异的持续性尿蛋白”，包括尿白蛋白(urinaryalbumin，ualb)、尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂c(urinarycystatinc，ucysc)、尿视黄醇结合蛋白(urinaryretinalbindingprotein，urbp)、尿β2微球蛋白(urinaryβ2microglobulin，uβ2-mg)、尿n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(urinaryn-acety1-β-d-glucosaminidase，unag)等。dn患者之所以出现难治性蛋白尿，尤其是肾小球源性蛋白尿，其原因与下述病理机制密切相关：①足细胞损伤；②足细胞裂隙膜功能性蛋白(nephrin、podocin、cd2ap、neph1)表达水平下调；③弥漫性肾小球硬化；④肾组织微炎症反应；⑤肾组织炎症相关stnfr1/pi3k/akt信号通路活化。基于此，针对上述病理环节或分子靶点而建立相应的“靶向”治疗技术就可以发挥“抗蛋白尿”的作用。

近年来，大型国际性循证医学试验结果显示，血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素ii受体拮抗剂能减少dn患者的蛋白尿，但是，疗效有限，尤其是对于iii期dn患者，一旦蛋白尿得不到有效控制，其肾功能就会急剧恶化而迅速进展至尿毒症。近年来，针对iii期dn患者出现的难治性蛋白尿，基于江苏省名老中医经验的中医药“抗蛋白尿”治疗技术在临床上得到确立与应用，并逐渐显现出有可靠的疗效。该治疗技术的核心就是本发明的中药组合物，它具有“补肾固精、清利化瘀”的功效，不仅能减少iii期dn患者蛋白尿，而且，能减轻dn炎症相关足细胞损伤。这为临床治疗以难治性蛋白尿为特征的早、中期dn提供了一个新的选择。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种治疗糖尿病肾病的中药组合物及其制备方法与应用。

技术方案：本发明所述的一种治疗糖尿病肾病的中药组合物，它由下述重量配比的原料中药制备而成：金樱子15-60份、芡实15-60份、覆盆子15-60份、菟丝子15-60份、雷公藤5-15份、益母草15-60份。

作为优选方案，以上所述的治疗糖尿病肾病蛋白尿的中药组合物，由下述重量配比的原料中药制备而成：金樱子15-40份、芡实15-40份、覆盆子15-40份、菟丝子15-40份、雷公藤5-10份、益母草15-40份。

作为更优选方案，以上所述的治疗糖尿病肾病蛋白尿的中药组合物，由下述重量配比的原料中药制备而成：金樱子30份、芡实30份、覆盆子30份、菟丝子30份、雷公藤10份、益母草30份。

本发明中药组合物是由金樱子、芡实、覆盆子、菟丝子、雷公藤、益母草等6味中药的原料药粉，或水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成药学上常用的制剂。

所述制剂可以是丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液或合剂。在制成胶囊剂时，把中药提取物与聚氧乙烯单硬脂酸酯、甘油山嵛酸酯和胶态二氧化硅混合，制得熔融物，再在二甲基硅油冷凝液中冷凝成丸，再用二甲基硅油洗丸，制得丸剂。在制成片剂时，把中药提取物减压浓缩制得浸膏，然后添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，压片制成片剂。在制成颗粒剂时，把中药提取物减压浓缩制得浸膏，加糊精等混合均匀，制粒，干燥，制成颗粒剂。在制成胶囊剂时，把中药提取物减压浓缩制得浸膏，干燥，粉碎，得干粉，与糊精或淀粉混合均匀，制粒，然后装胶囊制成胶囊剂。在制成口服液时，把中药提取物加纯化水溶解，加入甜菊素或阿斯巴坦，调ph，制成口服液。在制成合剂时，中药提取物加纯化水溶解，制成合剂。

本发明还提供一种上述的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：取配方量的各个组分加入5-15倍量的水，煎煮提取2-3次，每次1-3小时，合并煎液，浓缩，冷却至室温，加乙醇至含醇量达60％-90％，静置12-24小时，滤过，滤液回收乙醇，得提取物和药剂学上可接受的载体，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成药学上常用的制剂。

优选的，所述雷公藤加水先煎煮10-20分钟，再加入金樱子、芡实、覆盆子、菟丝子、益母草，一并煎煮提取。

本发明还提供所述的中药组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述糖尿病肾病为早、中期2型糖尿病并发的肾小球疾病，特别是针对糖尿病肾病蛋白尿的药物。

本发明还提供所述的中药组合物在制备改善糖尿病肾病足细胞损伤药物中的应用。所述药物能抑制dn炎症相关的stnfr1/pi3k/akt信号通路活性。

有益效果：本发明提供的治疗糖尿病肾病(diabeticnephropathy，dn)的中药组合物与现有技术相比，具有以下优点：①契合dn蛋白尿中医病机。dn患者肾元虚损，肾关不固，则精微下注，精气外泄，出现蛋白尿，此谓“肾虚”致病。dn患者在肾小球微结构的损伤不仅起于“肾虚”，更与“湿热、瘀血”密切相关；湿热、瘀血留滞下焦，肾络失和，肾元受损，封藏失职，亦致精微下注，精气外泄，出现蛋白尿，此谓“湿瘀”致病。因此，dn蛋白尿中医病机特点为“肾虚湿瘀”。②体现dn蛋白尿中医治则。据南宋《洪氏集验方》和近代《中华本草》记载，金樱子、芡实、覆盆子、菟丝子等酸甘收涩，具有“补肾固精”的功效；雷公藤具有“祛风除湿、活血通络”的功效；益母草具有“活血祛瘀、利水消肿”的功效。发明人基于古典医籍和已故江苏省名老中医万铭主任中医师的经验，将上述6味中药以适当比例组合而成为发明的中药组合物，具有“补肾固精、清利化瘀”的功效。③切中dn蛋白尿药效靶点。临床药效学研究和体内药理学研究表明，本发明的中药组合物及其制剂不仅能减少iii期dn患者蛋白尿，无不良反应，而且，能减轻dn炎症相关足细胞损伤。这为临床治疗以难治性蛋白尿为特征的早、中期糖尿病肾病提供了一个不同于“血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素ii受体拮抗剂”的新选择。④提供方便而实用的药物制备方法。本发明的中药组合物经制备，可以和药学载体制成多种剂型，如丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液或合剂等。在临床上，具有方便、实用、安全、有效的显著特点。

附图说明

图1是单侧肾切除联合链脲佐菌素(streptozotocin，stz)诱导的dn大鼠研究中，各组大鼠尿白蛋白、血糖、体重的变化，与正常组比较，^*p<0.05，^**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05；下同；

图2是单侧肾切除联合stz诱导的dn大鼠研究中，各组大鼠肾小球病理学特征的比较(×400)；

图3是单侧肾切除联合stz诱导的dn大鼠研究中，各组大鼠足细胞超微结构的比较(×10000)；

图4是单侧肾切除联合stz诱导的dn大鼠研究中，各组大鼠肾组织nephrin、podocin、cd2ap、neph1蛋白表达水平和表达量的比较，与模型组比较，^##p<0.01；下同；

图5是单侧肾切除联合stz诱导的dn大鼠研究中，各组大鼠肾组织tnf-α、il-β1蛋白表达水平和表达量的比较；

图6是单侧肾切除联合stz诱导的dn大鼠研究中，各组大鼠肾组织stnfr1、p85-pi3k、akt、473pakt蛋白表达水平和表达量的比较；

图7是dn大鼠模型制作示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

实施例1本发明的中药组合物丸剂的制备

取金樱子60g、芡实60g、覆盆子60g、菟丝子60g、雷公藤15g、益母草60g。

取各组分加入8倍量的水，取雷公藤15g加水先煎煮15分钟，再加入金樱子60g、芡实60g、覆盆子60g、菟丝子60g、益母草60g，煎煮提取2-3次，每次1-3小时，合并煎液，浓缩，将聚氧乙烯单硬脂酸酯和甘油山嵛酸酯置于水浴中加热，搅拌下加入胶态二氧化硅，继续搅拌，缓慢加入中药提取物，混合均匀，制得熔融物。将熔融物滴入二甲基硅油冷凝液中，冷凝成丸，用二甲基硅油洗丸，然后拭去丸剂表面的二甲基硅油，制得丸剂。

实施例2本发明的中药组合物片剂的制备

取金樱子40g、芡实40g、覆盆子40g、菟丝子40g、雷公藤10g、益母草40g。

取各组分加入12倍量的水，取雷公藤10g加水先煎煮15分钟，再加入金樱子40g、芡实40g、覆盆子40g、菟丝子40g、益母草40g，加水再煎煮(时间同上)，合并煎液，浓缩制得浸膏，干燥，粉碎，得干粉，加入1.4倍量的糊精，混匀，加75％乙醇适量，静置12-24小时，滤过，滤液回收乙醇，制粒，干燥，过筛，再加入助流剂适量，压片，制成片剂。

实施例3本发明的中药组合物颗粒剂的制备

取金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、雷公藤10g、益母草30g。

取各组分加入12倍量的水，取雷公藤10g加水先煎煮15分钟，再加入金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、益母草30g，加水再煎煮(时间同上)，合并煎液，浓缩制得浸膏，干燥，粉碎，得干粉，加入1.4倍量的糊精，混匀，加75％乙醇适量，制粒，干燥，制成颗粒剂。

实施例4本发明的中药组合物胶囊剂的制备

取金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、雷公藤10g、益母草30g。

取各组分加入12倍量的水，取雷公藤10g加水先煎煮15分钟，再加入金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、益母草30g，加水再煎煮(时间同上)，减压浓缩得浸膏，干燥，粉碎，得干粉，加入1.4倍量的糊精，混匀，加75％乙醇适量，制粒，干燥，装胶囊，制成胶囊剂。

实施例5本发明的中药组合物口服液的制备

取金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、雷公藤10g、益母草30g。

取各组分加入12倍量的水，取雷公藤10g加水先煎煮15分钟，再加入金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、益母草30g，加水再煎煮(时间同上)，浓缩，加入甜菊素或阿斯巴坦，调ph，制备成口服液。

实施例6本发明的中药组合物合剂的制备

取金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、雷公藤10g、益母草30g。

取各组分加入12倍量的水，取雷公藤10g加水先煎煮15分钟，再加入金樱子30g、芡实30g、覆盆子30g、菟丝子30g、益母草30g，加水再煎煮(时间同上)，浓缩，制备成合剂。

实施例7本发明的中药组合物合剂的制备

取金樱子20g、芡实20g、覆盆子20g、菟丝子20g、雷公藤5g、益母草20g。

取各组分加入12倍量的水，取雷公藤5g加水先煎煮15分钟，再加入金樱子20g、芡实20g、覆盆子20g、菟丝子20g、益母草20g，加水再煎煮(时间同上)，浓缩，制备成合剂。

临床试验例及动物试验例

试验例1本发明的中药组合物合剂减少iii期糖尿病肾病患者蛋白尿的临床疗效

资料与方法

病例收集与分组：收集在南京鼓楼医院中医科和肾内科门诊就诊的iii期dn患者，共80例。以单盲随机方法，设立治疗(a)组40例；对照(b)组40例。

诊断标准

西医诊断标准：按照丹麦mogensen分期法，dniii期(微量白蛋白尿期)：微量白蛋白排泄率在20-200μg/min、24h微量白蛋白定量在30-300mg。

中医辨证标准：按照中华中医药学会肾病分会《糖尿病肾病诊断、辨证分型及疗效评定标准》(中华中医药学会肾病分会.糖尿病肾病诊断、辨证分型及疗效判定标准[j].上海中医药杂志，2007，41(7)：7-8.)而制定。凡临床上表现为腰膝酸软或肢体浮肿，肢体重着或脘腹胀满，舌苔薄腻或黄腻，舌紫暗或有瘀斑或舌下青筋显露，脉细或涩者即为“肾虚湿瘀”证。

中医症候分级与积分标准：按照中华中医药学会肾病分会《糖尿病肾病诊断、辨证分型及疗效评定标准》而制定。分为无、轻、中、重四级，分值为0、2、4、6分。每位患者的累计得分即为最终积分。

纳入标准

①符合dn丹麦mogensen分期标准，属iii期dn者；②符合dn诊断和“肾虚湿瘀”证中医症候诊断标准者。

排除标准

①不符合dn诊断标准和“肾虚湿瘀”证中医症候诊断标准者；②糖尿病合并肾炎、严重感染者；③合并有严重心血管系统、消化系统及血液系统并发症者；④合并肉眼或镜下血尿者；⑤合并严重高血糖、酮症酸中毒、高渗性昏迷者；⑥因资料不全或不能配合的患者。

试验方法

治疗方案、疗程以及终点事件

基础治疗：在观察过程中，2组病例均接受自主糖尿病饮食+口服降糖药(糖适平+拜糖苹，常规剂量和用法，使血糖平均值保持在正常范围以内)的基础降糖治疗。共8周。

a(治疗)组：基础治疗+本发明的中药组合物合剂(简称“发明中药合剂”，实施例6制备所得)，2次/日，饭后30分钟口服。共8周。

b(对照)组：基础治疗+氯沙坦钾片(杭州默沙东制药有限公司)，50mg/次，1次/日，饭后30分钟口服。共8周。

常见并发症处理方案：对2组病例中伴有高血压(bp>140/90mmhg)者，可加用复方硫酸双肼屈嗪片(常州制药厂有限公司)，1片/次，3次/日，饭后30分钟口服；对伴有水肿者，可加用氢氯噻嗪片(常州制药厂有限公司)，1片/次，3次/日，饭后30分钟口服。共8周。

终点事件：在观察期间(8周)内，①微量白蛋白排泄率<20μg/min；②24h微量白蛋白定量>300mg。

疗程：8周。

观察指标：①血液生化指标，包括空腹血糖(fastingbloodglucose，fbg)、血清糖化血红蛋白(serumglycosylatedhemoglobin)比值、血清肌酐(serumcreatinine，scr)、血清尿素氮(bloodureanitrogen，bun)、血清总胆固醇(serumtotalcholesterol，tc)以及血清甘油三酯(serumtriglyceride，tg)等。②安全性指标，包括血清谷丙转氨酶(alaninetransaminase，alt)和血清谷草转氨酶(aspartatetransaminase，ast)。③尿蛋白指标，包括24h尿蛋白定量(24hurinaryprotein，upro)、尿白蛋白(urinaryalbumin，ualb)、尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂c(urinarycystatinc，ucysc)、尿视黄醇结合蛋白(urinaryretinalbindingprotein，urbp)、尿β2-微球蛋白(urinaryβ2-microglobulin，uβ2-mg)以及尿n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(urinaryn-acety1-β-d-glucosaminidase，unag)。在试验开始、结束各检测记录1次。

疾病疗效判定标准：按照中华中医药学会肾病分会《糖尿病肾病诊断、辨证分型及疗效评定标准》而制定。

显效：临床症状消失；尿白蛋白排泄率降至正常或下降1/2以上，血糖、糖化血红蛋白下降1/3或恢复正常，24h尿蛋白定量下降1/2以上；肾功能正常。

有效：临床症状较治疗前好转；尿白蛋白排泄率、血糖、糖化血红蛋白有所下降，但不足显效标准，24h尿蛋白定量较治疗前下降不到1/2；肾功能指标正常。

无效：临床症状未改善或恶化；实验室指标无变化或升高。

中医症候疗效判定标准：按照中华中医药学会肾病分会《糖尿病肾病诊断、辨证分型及疗效评定标准》而制定。

临床痊愈：中医症状与体征消失或基本消失，症候积分减少≥95％。

显效：中医症状与体征明显改善，症候积分减少≥70％。

有效：中医症状与体征有好转，症候积分减少≥30％。

无效：中医症状与体征无明显改善或加重，症候积分减少<30％。

统计学分析：定性指标采用百分率描述；定量指标采用均数±标准差表示，p<0.05表示差异有显著性。组间比较在进行方差齐性检验后采用单因素方差分析，p<0.05或p<0.01表示差异有统计学意义(有显著性或非常显著性)。实验数据采用spss13.0统计软件进行分析。

结果

两组患者一般情况、治疗前实验室指标和中医症候积分(基线)的比较

a组共40例患者，完成试验的患者39例，1例患者出现终点事件而脱落；b组共40例患者，完成试验的患者共38例，2例出现终点事件而脱落。两组患者性别、年龄、病程(从发现蛋白尿到纳入治疗的时间)、治疗前各实验室指标和中医症候积分(基线)相比较，其差异均无统计学意义(见表1)。

表1两组患者一般情况、治疗前实验室指标和中医症候积分(基线)的比较

两组患者治疗前后实验室指标和中医症候积分的比较

a组患者治疗后upro、ualb明显降低，与治疗前相比，其差异均有统计学意义(p<0.05)；其它指标和中医症候积分，治疗前后相比较，其差异无统计学意义；b组患者各项指标和中医症候积分，治疗前后相比较，其差异无统计学意义(见表2)。

表2两组患者治疗前后实验室指标和中医症候积分的比较

注：与治疗前比较，^*p<0.05，^**p<0.01。

两组患者临床疗效的比较

a组患者显效3例(7.7％)，有效30例(76.9％)，无效6例(15.4％)，总有效率33例(84.6％)；b组患者显效1例(2.6％)，有效23例(60.5％)，无效14例(36.8％)，总有效率24例(63.2％)；两组患者临床疗效相比较，其差别有统计学意义(p<0.05)，a组优于b组(表3)。

表3两组患者临床疗效的比较

注：与b组比较，^*p<0.05。

总之，临床药效学试验表明，发明中药合剂能减少iii期dn患者蛋白尿，在试验过程中无不良反应。

实验例2本发明的中药组合物合剂减轻糖尿病肾病模型鼠足细胞损伤的作用和机制

材料及方法

实验动物：spraguedawley(sd)大鼠15只，spf级，雄性，8周龄，体重200-220g，上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号[scxk(沪)2014-0004]，所有大鼠均予标准饮食，并自由饮水，适应性喂养1周。

实验药物和主要试剂：将本发明的中药组合物合剂(简称“发明中药合剂”，实施例6制备所得)以蒸馏水按14.4g/kg的给药剂量配制成2种不同浓度的溶液，4℃保存，有效期3天，灌胃给药前取出，放置至室温。链脲佐菌素(streptozotocin，stz)购自美国sigma公司。柠檬酸缓冲液：柠檬酸(fw：210.14)2.1g加入双蒸水100ml中配成a液，柠檬酸钠(fw：294.10)2.94g加入双蒸水100ml中配成b液。使用前将a、b液按一定比例混合(1：1.32)，ph计测定ph值，调节ph至4.2-4.5，即是配置stz所需的柠檬酸缓冲液。

实验动物模型的建立：根据文献[betzb，conwaybr.recentadvancesinanimalmodelsofdiabeticnephropathy[j].nephronexpnephrol，2014，126(4)：191-195.]，采用单侧肾切除联合stz腹腔注射的方法而建立糖尿病肾病(diabeticnephropathy，dn)大鼠模型，详见图7。sd大鼠自购入起适应性喂养1周，而后，以氯胺酮(2mg/kg)腹腔注射，逐一麻醉，采用俯卧位将大鼠固定于鼠板上，沿左侧背部肋弓下缘行约3cm的垂直纵向切口，暴露左肾，分离肾脏周围组织，结扎肾门血管，摘除左肾，分层缝合切口。术后3天内，每天给予大鼠腹腔注射青霉素钠盐(20万u/只)，预防术后感染。约1周左右，大鼠创面自行愈合。此后，在大鼠右侧腹腔注射stz(35mg/kg)，3天后监测大鼠随机血糖(尾静脉)，当3次随机血糖均>16.7mmol/l，确定dm模型成功建立。若随机血糖持续≤16.7mmol/l，再次注射同等剂量stz，如此反复，直至dm模型成功建立。为防止模型鼠血糖过高，根据血糖情况，每日给予大鼠适当剂量诺和灵n(皮下注射)。在注射stz后约8-10周，dm模型鼠会陆续出现异常升高的尿白蛋白(urinaryalbumin，ualb)，当ualb明显高于正常组大鼠，而且，其差异有统计学意义(p<0.05)时，确定dn模型成功建立。在模型制作过程中，少数大鼠会因手术感染、持续高血糖或其他并发症而死亡。

分组与给药：将15只按随机数字表将大鼠随机分为3组，即正常组5只、模型组5只、治疗组5只。在dn模型建立后，每天分别经灌胃给予模型组大鼠蒸馏水(2ml)，给予治疗组大鼠实施例6制备的发明中药合剂[14.4g/kg]，给予正常组大鼠蒸馏水(2ml)，每日1次，连续8周。给药8周后，经腹腔注射氯胺酮麻醉，心脏穿刺而处死。在处死大鼠前后，分别收集尿液、血液及肾组织，进行各项指标的检测。

观察指标和检测方法

一般情况、体重：在造模前和造模后0、2、4、6、8周，分别观察各组大鼠精神、饮食、饮水、皮毛色泽以及活动情况等，并测量各组大鼠体重。

尿蛋白排泄量：在造模前和造模后0、4、8周，分別将各组大鼠放入金属代谢笼，禁食，自由饮水，收集24h尿液，采用免疫散浊法测定ualb。

血清生化指标：在造模前和造模后0、4、8周，分别采用血糖仪在大鼠右侧前爪测定随机血糖(bloodglucose，bg)；在造模后的第8周末，予氯胺酮麻醉大鼠，解剖胸腔，经心脏采血2ml，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清白蛋白(serumalbumin，alb)、血清肌酐(serumcreatinine，scr)、血清尿素氮(bloodureanitrogen，bun)、血清谷丙转氨酶(alaninetransaminase，alt)、血清谷草转氨酶(aspartatetransaminase，ast)、血清总胆固醇(serumtotalcholesterol，tc)以及血清甘油三酯(serumtriglyceride，tg)等。

足细胞形态：采用hitachi7500透射电子显微镜观察足细胞超微结构。

足细胞功能：westernblotting检测足细胞裂隙膜功能性蛋白nephrin、podocin、cd2ap、neph1表达水平。

肾组织病理学特征：肾组织经10％福尔马林固定24h后，常规脱水，透明，石蜡包埋，经切片机分别切为3μm厚切片，进行过碘酸雪夫(periodicacidschiff，pas)染色和masson染色，光学显微镜下观察肾小球内系膜细胞(mesangialcell，mc)数量和细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)情况；采用病理图像分析系统(imageproplus，ipp)计算肾小球内mc数量和ecm相对面积(ecm面积/肾小球面积)。

肾小球中巨噬细胞数目：免疫荧光染色检测肾小球内总巨噬细胞(ed1⁺细胞)和活化巨噬细胞(ed3⁺细胞)数目。

肾组织炎症因子表达：westernblotting检测肾组织代表性炎症因子——肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)-α、白介素(interleukin，il)β1蛋白表达水平。

肾组织炎症相关stnfr1/pi3k/akt信号通路活性：westernblotting检测肾组织stnfr1/pi3k/akt信号通路关键信号分子stnfr1、p85-pi3k、473pakt蛋白表达水平。

统计学分析：各组数据均数采用均数±标准差表示，p<0.05表示差异有统计学意义(有显著性)。组间比较在进行方差齐性检验后采用单因素方差分析，p<0.05或p<0.01表示差异有统计学意义(有显著性或非常显著性)。实验数据采用spss13.0统计软件进行分析。

结果

发明中药合剂对dn模型鼠一般状态、尿白蛋白、血糖和体重的影响

由表4、图1可见，在整个实验过程中，正常组大鼠一般情况、ualb、血糖无明显改变，体重持续上升。dn模型成功建立后，模型组和治疗组大鼠均出现进食、饮水、尿量增多，活动减少，体态消瘦，皮毛晦暗等变化，其中，模型组大鼠表现尤为明显。模型组大鼠体重缓慢上升；血糖显著升高，并维持在16.7mmol/l以上；ualb明显上升，均大于20mg/l；与正常组大鼠比较，其差异均有统计学意义(p<0.01)。在发明中药合剂干预后的第8周末，治疗组大鼠ualb下降，与模型组大鼠比较，其差异有统计学意义(p<0.05)；在发明中药合剂干预后的第6、8周末，治疗组大鼠体重有所上升，与模型组大鼠比较，其差异有统计学意义(p<0.05)，但是，发明中药合剂对模型鼠血糖无明显影响。

上述结果说明，发明中药合剂能改善dn模型鼠ualb和体重。

表4各组大鼠尿白蛋白、血糖、体重的比较

注：与正常组比较，^**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05；下同。

发明中药合剂对dn模型鼠血清白蛋白、肾功能、肝功能和血脂的影响

由表5、6可见，与正常组大鼠相比，在造模成功后的第8周末，模型组大鼠alb明显降低，scr、bun、tc、tg明显升高，其差异均有统计学意义(p<0.01)。与模型组大鼠比较，在发明中药合剂干预后的第8周末，治疗组大鼠alb有所升高，差异有统计学意义(p<0.05)，但是，治疗组大鼠scr、bun、tc、tg均无明显改变。此外，alt、ast在3组大鼠之间无明显改变。

上述结果说明，发明中药合剂能改善dn模型鼠alb，但是，对肾功能、肝功能和血脂无明显影响。

表5各组大鼠肾功能和肝功能指标的比较

表6各组大鼠血清白蛋白和血脂指标的比较

发明中药合剂对dn模型鼠肾组织病理学特征的影响

由表7、图2可见，在造模后第8周末，正常组大鼠肾小球形态完整、结构清晰，毛细血管腔开放良好，无明显细胞增生、基质沉积等病变。模型组大鼠肾小球肥大，体积增大，mc增生、系膜基质沉积明显，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肾小球内mc数量和ecm相对面积明显增加，其差异有统计学意义(p<0.01)。与模型组大鼠比较，在发明中药合剂干预后的第8周末，治疗组大鼠肾小球内mc数量和ecm相对面积明显减少，其差异有统计学意义(p<0.01)。

上述结果说明，发明中药合剂能改善dn模型鼠肾组织病理学特征。

表7各组大鼠肾组织mc数量和ecm相对面积的比较

注：与模型组比较，^##p<0.01；下同。

发明中药合剂对dn模型鼠足细胞形态和功能的影响

由图3可见，在造模后第8周末，正常组大鼠足细胞未见异常，模型组大鼠足细胞足突融合或消失，治疗组大鼠足细胞足突融合有所减轻。由图4可见，经westernblotting检测发现，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肾组织nephrin、podocin、cd2ap、neph1蛋白表达水平下降，其差异有统计学意义(p<0.05)；与模型组大鼠比较，治疗组大鼠肾组织nephrin、podocin、cd2ap、neph1蛋白表达水平明显上升，其差异有统计学意义(p<0.05)。

上述结果说明，发明中药合剂能改善dn模型鼠足细胞形态，增加肾组织nephrin、podocin、cd2ap、neph1蛋白表达水平。

发明中药合剂对dn模型鼠肾小球中巨噬细胞数目和肾组织炎症因子蛋白表达水平的影响

由表8、图5可见，免疫荧光染色检测显示，在造模后第8周末，正常组大鼠肾小球中无ed1⁺细胞和ed3⁺细胞，但是，模型组大鼠肾小球中ed1⁺细胞和ed3⁺细胞数目明显增加。与模型组大鼠比较，治疗组大鼠肾小球中ed1⁺细胞和ed3⁺细胞数目明显减少，其差异有统计学意义(p<0.05)。westernblotting检测显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肾组织tnf-α、il-β1蛋白表达水平明显增加，其差异有统计学意义(p<0.05)；与模型组大鼠比较，治疗组大鼠肾组织tnf-α、il-β1蛋白表达水平明显减少，其差异有统计学意义(p<0.05)。

上述结果说明，发明中药合剂能减少dn模型鼠肾小球中巨噬细胞数目和肾组织炎症因子蛋白表达水平。

表8各组大鼠肾小球中巨噬细胞数目的比较

发明中药合剂对dn模型鼠肾组织炎症相关stnfr1/pi3k/akt信号通路关键信号分子蛋白表达水平的影响

由图6可见，westernblotting检测显示，在造模后第8周末，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肾组织炎症相关stnfr1/pi3k/akt信号通路关键信号分子stnfr1、473pakt蛋白表达水平明显增加，其差异有统计学意义(p<0.05)；与模型组大鼠比较，治疗组大鼠肾组织stnfr1、473pakt蛋白表达水平明显减少，其差异有统计学意义(p<0.05)，各组大鼠肾组织p85-pi3k蛋白表达水平无明显改变。

上述结果说明，发明中药合剂能抑制dn模型鼠肾组织炎症相关stnfr1/pi3k/akt信号通路活性。

总之，体内药理学实验表明，本发明中药合剂能减轻dn炎症相关足细胞损伤，改善足细胞的结构和功能，减少蛋白尿，可用于制备治疗或辅助治疗糖尿病肾病的药物。