苦豆碱在制备治疗肺动脉高压药物中的用途的制作方法

本发明涉及苦豆碱的应用，特别涉及苦豆碱制备治疗肺动脉高压药物中的用途。
背景技术：
：肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension，pah)是一组由异源性疾病和不同发病机制引起的以肺血管阻力持续增加，并导致右心室衰竭及死亡为特征的肺血管重构性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率，被认为是“假恶性肿瘤”。炎症反应引起的肺血管内皮损伤导致的血管平滑肌细胞增殖和肺血管重构、肺动脉闭塞被认为是肺动脉高压发病机制及病理改变的主要特征。由于肺血管阻力的增加和右心室后负荷的增高，引起右心室重构，最终导致右心室衰竭。伴随着血管收缩、炎症、管壁增厚和微血栓形成，肺血管阻力渐进性升高，气体交换功能下降，进而导致缺氧和右心负荷增加，严重者发生右心衰竭和猝死。肺血管重构主要包括血管周围基质沉积、炎性浸润、血管平滑肌增殖和血管内皮受损，而血管平滑肌增殖与患者的长期预后密切相关。血管平滑肌的异常增生肥大主要涉及了血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)、血管紧张素ⅱ、纤维母细胞生长因子及血管内皮生长因子等。体外研究表明，pdgf是血管平滑肌的有效刺激因子，而pdgf受体信号通路与肺血管重构密切相关，在特发性肺动脉高压病人和低氧及野百合碱诱导的肺血管重构动物模型中，pdgf及其受体的表达上调。pdgf受体拮抗剂可以阻止并逆转低氧及野百合碱诱导的右心室压力增高及肺血管重构。随着对肺动脉高压发病机制和病理生理学研究的深入，以及新型药物的临床应用，肺动脉高压患者的预后己有所改观，但长期有效性有限，5年存活率仅为49％。因此，寻找具有抑制甚至逆转肺血管重构、抑制细胞增殖、针对右心室功能且价格低廉的药物，将有助于临床的早期干预与治疗，具有深远的研究意义。苦豆子(sophoraalopecuroidlesl)，在宁夏有大量的野生和人工种植资源，是宁夏回族自治区“十三五科技发展规划”中重点支持大面积规范化种植和优先深度开发并产业化的特色植物之一，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用。苦豆碱(aloperine)是从苦豆子中提取的主要生物碱之一，具有来源比较容易，提取得率比较高，毒性比较低等优势。国内外学者研究表明，苦豆碱对心血管系统的作用尤为突出，具有抗心律失常，抗心肌缺血等作用。需要指出的是，苦豆子生物碱对心血管系统的药理作用是本课题组长期以来一直关注的科学问题，我们前期的研究发现：苦豆子生物碱中苦参碱可对抗苯肾上腺素引起的豚鼠主动脉环收缩，对高胆固醇和/或异丙肾上腺素所致心肌损伤及缺血具有保护作用；氧化苦参碱调控一氧化氮/adma信号通路对异丙肾上腺素所致慢性心功能衰竭具有逆转作用。苦豆碱是否对肺动脉平滑肌细胞的增殖具有抑制作用，其作用机制如何，目前未见报道。将其发展为治疗肺动脉高压药物具有极高的潜在价值与社会意义。技术实现要素：本发明的目的是通过对苦豆碱的药理作用研究，提供苦豆碱在制备治疗肺动脉高压药物中的用途。本发明通过以下技术方案来实现发明目的：本发明提供苦豆碱在制备治疗肺动脉高压药物中的用途，所述苦豆碱的结构式如式(1)所示：具体地，所述肺动脉高压为20ng/mlpdgf-bb刺激24h人肺动脉平滑肌细胞24h后诱导形成的肺动脉高压。具体地，所述苦豆碱单次应用剂量为不引起中枢抑制的剂量。优选地，所述苦豆碱单次应用剂量为0.125-1mm。优选地，所述苦豆碱单次应用剂量为0.25-1mm。优选地，所述苦豆碱单次应用剂量为0.0.5-1mm。具体地，所述苦豆碱单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞0.125-1mm，标准体重人70kg单次使用量为16mg/kg-64mg/kg。具体地，所述药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。优选地，所述剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型或粉针剂。具体地，所述的苦豆碱作为唯一活性成分在制备肺动脉高压药物中的用途。本发明提供的苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途具有以下有益效果：(1)苦豆碱能显著抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖和dna合成，促进人肺动脉平滑肌细胞凋亡；(2)苦豆碱能抑制炎症作用，显著抑制炎症引起的人肺动脉平滑肌细胞的增殖，并且能抑制nf-κbp65信号通路相关蛋白的表达。实验结果表明苦豆碱具有治疗肺动脉高压作用，可用于制备肺动脉高压的治疗药物。附图说明图1：苦豆碱对人肺动脉平滑肌细胞的存活率影响图。图2：苦豆碱对人肺动脉平滑肌细胞的增殖率影响图。图3：苦豆碱对人肺动脉平滑肌细胞的dna合成影响图。图4：苦豆碱对人肺动脉平滑肌细胞的细胞周期影响图。图5：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中ikkα蛋白表达水平的影响(与正常组比较：p＞0.05，与模型组比较：p＞0.05(x±s，n＝6)；relativeopticaldensity：相对光密度)。图6：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中pikkα蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。图7：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中iκbα蛋白表达水平的影响(与正常组比较：p＞0.05，与模型组比较：p＞0.05(x±s，n＝6))。图8：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中piκbα蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。图9：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中nf-κbp65蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。图10：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中tnf-α蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。图11：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中cycline1蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。图12：苦豆碱对肺动脉高压大鼠肺组织中p27kip1蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，实施例中所用的苦豆碱均为前述的式(1)所示的化合物。实施例1苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，所述苦豆碱的结构式如式(1)所示：其中，苦豆碱单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞0.5mm，药物的剂型为溶液剂型。实施例2苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，所述苦豆碱的结构式如式(1)所示：其中，苦豆碱单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞0.5mm，药物的剂型为粉针剂型。实施例3苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，所述苦豆碱的结构式如式(1)所示：其中，苦豆碱单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞1mm，药物的剂型为粉针剂型。实施例1至3的效果可以通过下面的动物实验及其结果得到证实：一、实验材料1.1细胞人肺动脉平滑肌细胞(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)1.2主要药品与试剂苦豆碱(购自上海源叶生物有限公司)，西地那非(购自辉瑞制药有限公司，s42045)，dmem(购自美国gibco公司，11965092)，胎牛血清(购自美国gibco公司，c2027010)，胰蛋白酶(购自美国gibco公司，15050065)，cck-8(北京索莱宝科技有限公司，m8180-250)，二甲基亚砜(dmso)(购自美国sigma公司d8418)，brdu(购自rocheswitzerland)，细胞凋亡与周期检测试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)，全蛋白提取试剂盒、蛋白含量测定试剂盒(购自南京凯基生物技术股份有限公司，kgp2100、kgpbca)，temed(购自美国sigma公司，t8090)，过硫酸铵(ap)(购自美国sigma公司，a8090)，10％sds(上海tongshan公司，p61014)，30％丙烯酰胺(购自上海double-helix，p31031)，蛋白上样缓冲液5×(购自北京transgenbiotech，p62114)，化学发光底物(购自美国advansta公司，k-12045-d10)，nf-κbp65单克隆抗体、ikkα单克隆抗体、iκbα单克隆抗体、p-ikkα单克隆抗体、p-iκbα单克隆抗体(购自美国abcam公司，#8242、ab32041、ab7217、#2697、#9246)，β-actin单克隆抗体、α-tubulin单克隆抗体、兔抗igg单克隆抗体(购自美国proteintech公司，17168-1-ap、11224-1-ap、zb-2301)。1.3主要仪器超净台(sw-cj-2fd，苏州省安泰技术有限公司)，二氧化碳培养箱(美国thermoscinentific)，立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，离心机(hypothermia,z323k，西门子公司)，水浴箱(constanttemperature,dk-420s，上海jinghong实验设备公司)，酶标仪(model550，美国thermoscientific)，bh-nic-b型倒置显微镜(日本olympusoptical公司)，激光共聚焦显微镜(tcs-sp，德国leica)，电子分析天平(al104瑞士，mettler-toleclogroup公司)，低温冰箱(bcd-215kcm，中国海尔)，冰箱(994-80。c，德国thermo)，雪花制冰机(sim-f124，日本三洋公司)，超纯水系统(milli-qacademica10，美国millipore公司)，干燥箱(9140，上海jinghong实验设备公司)，漩涡仪(8k-ⅱ，上海手术器械厂)。1.4主要试剂配制50mm苦豆碱贮存液：称取116mg的苦豆碱溶于2mldmso后加8ml超纯水形成浓度为50mm的苦豆碱母液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存(全程无菌操作)。2800ng/mlpdgf-bb贮存液：按照说明书取10mg规格的pdgf-bb加3.75ml100mm的乙酸形成浓度为2800ng/ml的pdgf-bb母液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存(全程无菌操作)。4000μm西地那非贮存液：1片西地那非含有的有效物质为100mg，将1片西地那非溶于5mldmso中，取其中1ml加9ml超纯水，形成浓度为4000μm的母液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存(全程无菌操作)。1.5复苏步骤从液氮罐中取出冻存管注应带防护眼镜和手套迅速放入盛有37℃的水浴锅中，并不时摇动,尽快解冻剪开纱布口袋，取出冻存管，用酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，移至离心管中，加入培养液，并吹打细胞用吸管吸出细胞悬液加入到的培养瓶中,置于37℃培养箱中静息培养。用完全培养液培养，第二天更换一次培养液用完全培养液培养，往后每隔一天更换一次培养液。1.6细胞冻存方法冻存前更换培养液，加入适量的胰酶，显微镜下观察，见细胞收缩后去除消化液，加入适量培养液，把消化好的细胞收集在离心管中，离心，去除上清液，加入冻存培养液，吹打细胞使之均匀，分装入冻存管中，将密闭好的冻存管依次放于4℃30min、-20℃2h、液氮表面、浸入液氮冻存。1.7传代培养细胞融合后，倒去旧的培养液，加入适量的胰酶观察，细胞收缩后加1ml培养基终止消化去除消化液，移入10ml离心管1000rpm离心10min。取新的培养瓶，将离心完成的细胞弃含有胰酶的上清，用培养基吹打混悬后转入，补足培养液，显微镜下观察记录放入培孵箱培养。传代细胞从第三代开始可将完全培养液换为含小牛血清的完全培养液培养，隔天更换一次培养液。人肺动脉平滑肌细胞至少可以传六代以上，并且从第二代开始细胞即可冻存。取生长良好的一代细胞进行后续试验。1.8细胞观察细胞接种后每天于倒置显微镜下观察细胞的生长情况,包括细胞的形态、大小、融合状况、有无污染等，并照相留作参考。1.9实验细胞的培养取处于对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化，用血球计数仪计数，按所需密度接种于细胞培养板/瓶中。隔天更换次培养液，直到达到融合。换成无血清培养液饥饿，使细胞同步化。然后收取细胞进行相关检测。二、实验过程(一)cck-8法检测苦豆碱的细胞毒性：1.1实验步骤(1)消化和铺板：胰酶消化对数期肺动脉平滑肌细胞，终止后离心收集,调整细胞悬液浓度，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。每孔加入体积为100ul，铺板时使待测细胞调密度至5000-10000/孔，边缘孔用无菌pbs填充。(2)给药：5％co2，37℃烘箱孵育，次日细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入0mm、0.125mm、0.25mm、0.5mm、1mm浓度梯度的苦豆碱，每孔100ul。(3)5％co2，37℃孵育12h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。(4)向每孔加入10μlcck溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。(5)将培养板在培养箱内孵育4h。(6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。(7)同时设置调零孔(培养基、cck-8)和对照孔(细胞、培养液、cck-8)。活力计算：细胞活力*(％)＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]×100其中：a(加药)：具有细胞、cck溶液和药物溶液的孔的吸光度；a(空白)：具有培养基和cck溶液而没有细胞的孔的吸光度；a(0加药)：具有细胞、cck溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力。1.2实验结果：不同浓度苦豆碱对人肺动脉平滑肌细胞(hpasmcs)的存活率无影响cck-8法检测不同浓度的苦豆碱(0.125-1mm)对hpasmcs的毒性。浓度为0.125-1mm的苦豆碱在12、24和48h对hpasmcs的存活率无明显影响(p＞0.05)，细胞活力可维持在约93％。这一结果表明，实验浓度的苦豆碱对的hpasmcs的存活率无明显毒性(图1)。(二)cck-8法检测苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs的增殖的影响2.1实验步骤：(1)消化和铺板：胰酶消化对数期肺动脉平滑肌细胞，终止后离心收集,调整细胞悬液浓度，细胞计数调整其浓度至5-104/ml。每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至5000-10000/孔，边缘孔用无菌pbs填充。(2)造模和给药：5％co2，37℃烘箱孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，正常对照组更换100μl新鲜培养基，其余各组更换100μl含有20ng/ml的pdgf-bb的新鲜培养基，继续培养12h。12h后正常对照组和模型组更换100μl新鲜培养基，阳性药物西地那非组加入浓度为40μm的100μl新鲜培养基，给药组依次加入0.125mm、0.25mm、0.5mm、1mm浓度梯度苦豆碱的新鲜培养基，每孔100ul，每组设置5个复孔。(3)5％co2，37℃孵育12h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。(4)向每孔加入10μlcck溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。(5)将培养板在培养箱内孵育4h。(6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。(7)同时设置调零孔(培养基、cck-8)和对照孔(细胞、培养液、cck-8)。2.2实验结果：cck-8法发现苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs增殖具有抑制作用：hpasmcs的异常增殖可引起肺血管重构的形成。苦豆碱是一种可抑制肿瘤细胞増殖的天然化合物，但是，苦豆碱是否能够抑制hpasmcs的増殖并未见相关报道。为了确定苦豆碱对hpasmcs的影响，我们通过cck-8法及检测苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs增殖响。cck-8法细胞增殖检测结果表明：与对照组相比pdgf-bb刺激hpasmcs后24小时细胞增殖显著；苦豆碱(0.125mm、0.25mm、0.5mm、1mm)干预24h后的cck-8结果显示，较未加入苦豆碱的pdgf-bb组(模型组)，加入苦豆碱的组别增殖量均下降，体现出对pdgf-bb诱导的hpasmcs增殖的抑制作用并且加入苦豆碱的浓度越高(0.125mm、0.25mm、0.5mm、1mm)，增殖数量越小，意味着这种抑制作用呈现出浓度依赖性(p＜0.01，p＜0.05)。同时0.5mm浓度的苦豆碱对hpasmcs增殖的抑制作用最为显著(p＜0.01)(图2)。(三)brdu法检测苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs的dna合成的影响3.1实验步骤：(1)试剂配制：brdu标记液：用无菌培养基1:100稀释(bottle1)(终浓度为100为μmbrdu)。96孔板，细胞如果按100μl/孔接种，需要1mlbrdu标记液，如果按200μl/孔接种，需要2mlbrdu标记液。未溶解的brdu标记液(1000×)：2-8℃避光可保存数月。溶解的brdu标记液：2-8℃避光可保存数周。长期保存的brdu标记液，需分装保存于-20℃。anti-brdu-pod贮存液：用1.1ml双蒸水溶解anti-brdu-pod(bottle3)10min并混匀，置于2-8℃避光可保存数月，长期保存应分装保存至-20℃。anti-brdu-pod工作液：用抗体稀释液(bottle4)1:100稀释anti-brdu-pod贮存液。一个96孔板，用10ml抗体稀释液(bottle4)稀释100μl，anti-brdu-pod工作液临用前配制，无法贮存。洗液：用双蒸水1:10稀释washingbufferconcentrate(bottle5),一个96孔板，用90ml双蒸水稀释10mlwashingbufferconcentrate(bottle5)，于2-8℃可保存几周。(2)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，接种于96孔板，5×103/孔，终体积为100μl/孔，37℃孵育。(3)细胞培养时间取决于特定的实验方法和用于测定的细胞种类。对于大多数的实验方案，孵育时间一般在24-120h。(4)细胞按100μl/孔培养，按10μl/孔加入brdu标记液，37℃继续解育细胞2-24h，细胞按200μl/孔培养，按20μl/孔加入brdu标记液。一般2h标记时间己足够。延长孵育时间将会増加brdu渗入细胞dna的总量，导致吸光度值和灵敏度增加(本实验为2h)。(5)移去标记液，轻扣或者吸取弃去标记液。在标记结束后可中断测定过程，如果不再继续测定，移去标记液，细胞可置于2-8℃一周。(6)200μl/孔加入fixdenatsolution(bottle2)15-25℃孵育30min。(7)通过弹掉或轻扣充分移去fixdenatsolution。(8)按照100μl/孔加入anti-brdu-pod工作液，在15-25℃孵育约90min。(9)移去抗体结合物并且用200μl-300μl/孔洗液清洗每孔，清洗3次。(10)移去洗液。(11)100μl/孔加入substratesolution。(12)15-25℃孵育5-30min直至颜色已足够光度检测。不加终止液：用酶标仪测定样品吸光度，波长370nm(参照波长492nm)，允许在不同时间点重复测定(如5、10、20min)。酶作用底物的最佳反应时间取决于不同的细胞种类。加终止液：每孔加入25μl的1mm硫酸终止反应，300rpm振荡约1min，在酶标仪450nm波长处检测od值(参考波长为的690nm)，即brdu检测值。检测需在加入终止液后5min内进行。3.2实验结果dna的合成与细胞周期及细胞增殖密切相关，故此我们通过brdu渗入法来研究苦豆碱对pdgf-bb诱导的肺动脉平滑肌细胞dna合成的影响。brdu检测dna合成结果表明：与对照组相比pdgf-bb刺激hpasmcs后24小时，细胞增殖显著(p＜0.01)；苦豆碱0.125mm、0.25mm、0.5mm、1mm)干预2h后的brdu结果显示，较未加入苦豆碱的pdgf-bb组，加入苦豆碱的组别增殖量均下降，体现出对pdgf-bb诱导的hpasmcs增殖的抑制作用，并且加入苦豆碱的浓度越高，增殖数量越小，抑制增殖的效应越显著，意味着这种抑制作用呈现出浓度依赖性(p＜0.01，p＜0.05)。并且0.5mm浓度的苦豆碱抑制hpasmcsdna合成效果最佳(p＜0.01)(图3)。(四)流式细胞术检测苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs细胞周期的影响4.1实验步骤：(1)细胞培养于六孔板，倒置显微镜下观察细胞融合达80％后消化细胞，离心并收集细胞，800rpm/min,5min，弃上清，用预冷的pbs将细胞重悬1次，再次离心，1000rpm/min，5min，—般一个样本所需的细胞可用6孔板培养。(2)加入1ml提前配制好并预冷的70％乙醇(无水乙醇+pbs配制)，于4℃固定过夜。在细胞固定时一定要用移液枪轻轻吹打并涡旋摇晃将细胞吹开，吹成单细胞。(3)次日再次离心，1500rpm/min，5min，弃上清。(4)再次用1ml的pbs洗细胞一次，离心，1500rpm/min，5min，弃上清，收集细胞。(5)按照每个样本需要：加入0.5mlpi/rnase染色缓冲液，缓慢并充分重悬细胞，4℃避光孵育30分钟。配制好的溴化乙锭染色液短时间可以保存在4℃，本实验现配现用。染色后立即上机检测各周期时相细胞所占百分比。流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数万个细胞，结果用modfit细胞周期拟和软件分析，上机前用200目的筛网是将粘在一起的细胞团滤掉的，避免造成堵塞机以及出现多倍体干扰影响实验结果。4.2实验结果流式细胞术检测细胞周期发现苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs增殖具有抑制作用：细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞周期的阻滞可影响细胞增殖。我们采用pi染色后通过流式细胞仪检测苦豆碱对细胞周期的影响。pdgf-bb刺激24h后hpasmcs处于g0/g1百分比减小(图4，p＜0.05)，s期细胞百分比增加(图4，p＜0.01)。与对照组相比0.5mm苦豆碱干预24小时后可使细胞g0/g1百分比增加(图4，p＜0.05)，s期细胞百分比增加(图4，p＜0.01)，g2/m对期细胞百分比无明显影响(图4，p＞0.05)。结果表明苦豆碱可阻滞g0/g1期细胞向s期过渡。(五)westernblot检测苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs中ikkα、iκbα、p-iκbα、p-ikkα、nf-κbp65、tnf-α、p27kip1、cycline1蛋白表达的影响5.1实验步骤(1)蛋白提取(全程低温操作)细胞准备：将hpasmcs接种于60mm的培养皿中，细胞融合达80％时，饥饿12h使其同步化。每个培养皿中加入5ml含有20ng/mlpdgf-bb的新鲜培养基，正常对照组加入新鲜培养基，放入培养箱培养24h后正常组和模型组更换新鲜培养基，给药组加入0.5mm苦豆碱继续培养24h。将各组细胞从培养箱取出，用预冷的pbs洗3遍，使用胰酶消化下细胞，转移至1.5ml的ep管中，离心。(1000rpm离心10min，4℃)弃上清，沉淀加入1ml预冷的pbs混悬，再次离心，条件同上。上述操作重复2次(沉淀即细胞)。按说明书配制细胞裂解液：按需配制：每1ml冷lysisbuffer中，加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂以及5μl100mmpmsf，冰上保存待用。注意现用现配。裂解细胞：细胞经2次离心后，弃上清，向纯细胞中加入60μl裂解液，混匀后置于摇床上，4℃环境下摇晃30分钟(摇床转速调至最大)。离心分离：各组ep管配平置于4℃离心机内离心，为20000rpm离心5min。小心吸取上清液转移至预冷的ep管中，标记好置于在-80℃冰箱保存。(2)蛋白浓度测定及蛋白变性处理按照下表1中标示加入各个试剂，然后再向各个酶标孔中分别加入200μl配制的bca工作液。表1.各个酶标孔中加入工作液的量孔号01234567蛋白标准溶液(μl)01248121620去离子水(μl)2019181612840对应蛋白含量(μg)0.00.51.02.04.06.08.010.0①提前将酶标仪条件设置为37℃孵育30min、每间隔10sec震荡1次、吸光度为562nm，预热完成后将酶标板放入酶标仪中，检测od值。②测得每孔吸光度数据后，以蛋白含量(μg)为纵坐标、吸光值为横坐标，绘制标准曲线。(3)样本蛋白含量测定每1μl提取的蛋白原液加入19μllysisbuffer将样本稀释20倍，混匀之后，每孔加入样本稀释液20μl，再加入bca工作液200μl，充分混匀并且保证无气泡。提前将酶标仪条件设置为37℃孵育30min、每间隔10sec震荡1次、吸光度为562nm，预热完成后将酶标板放入酶标仪中，检测od值。依据之前绘制的标准曲线纵坐标上od值，对应到横坐标上蛋白含量，除以20μl的总体积，再乘以稀释倍数，便得到样品浓度(μg/μl)。调整各样本蛋白浓度：根据测得的样品蛋白浓度，按照比例加入预冷的lysisbuffer，与5×loadingbuffer以4:1的比例混合，调整样本蛋白浓度为5ug/μl，然后震荡混匀、封口，在沸水中煮10min，冷却分装后-80℃分装保存，避免反复冻融。(4)配制浓缩胶和分离胶清洗玻璃板，流动水洗，双蒸水冲洗晾干，之后用甲醇充分擦拭干净。将玻璃板放入夹子中对齐夹紧并固定，然后开始配制分离胶。根据蛋白的分子量按照下表2配制8％/12％分离胶：表2.分离胶配方表组分8％凝胶12％凝胶去离子水4.8ml3.3ml30％丙烯酰胺2.7ml4.0ml4×tris/sds分离胶缓冲液(ph8.8)2.5ml2.5ml10％aps0.1ml0.1mltemed4μl4μl按顺序配制凝胶时加入aps和temed后立即涡旋混匀并开始后续操作：用1000μl的移液枪将8％/12％分离胶从两块玻璃板之间的空隙的一侧缓慢加入，加至玻璃板3/4高度处停止，留下剩余空间，然后再用甲醇覆盖在分离胶顶部，目的是压平凝胶的水平线、排尽空气，室温静置至凝胶和甲醇之间出现清晰的反光线时倒去甲醇，用滤纸尽量吸去剩余水分。紧接按照下表3配制浓缩胶：表3.浓缩胶配方表组分5％凝胶去离子水3.4ml30％丙烯酰胺0.85ml4×tris/sds分离胶缓冲液(ph8.8)0.65ml10％aps50μltemed5μl按顺序配制凝胶时加入aps和temed后立即涡旋混匀并开始后续操作：用1000μl的移液枪将浓缩胶加入两块玻璃板之间至溢出，迅速插入专用的梳子，静置在4℃冰箱可过夜。待浓缩胶全部凝聚之后，除去梳子。(5)电泳连接电泳装置，将玻璃胶板固定于电泳槽中，从内槽加入新鲜配置的5×tris-甘氨酸-sds缓冲液至2刻度处，确保缓冲液没过凝胶加样孔，外槽加入回收利用的电泳液至电泳槽的4刻度处。用10μl的移液枪在凝胶的加样孔中加入10μl样本，再在两边的孔中加入5μl的蛋白marker。加样后连接电源开始电泳，以恒压70v电泳至蛋白marker染料颜色之间跑开后将电压调整至120v继续电泳，待蛋白marker染料前端到达凝胶底部后结束电泳。(5)转膜在电泳结束前的30min，提前将硝酸纤维素膜(nc膜)和转膜滤纸放置于转膜液中浸泡待用。电泳结束后，转膜夹子黑面朝下，在上面垫一层海绵垫，再垫一层滤纸，将所需条带及内参铺在滤纸上，将nc膜置于上面，再放一层滤纸和一张海绵垫，形成三明治形式，赶走气泡并夹紧。放置于转膜槽，夹子的黑面对应转膜槽的黑面，透明面对应转膜槽的红面，加入转膜液至溢出，放入冰盒降温。设定转膜电流为200ma，转膜时间为2h。孵育一抗、二抗：转膜结束后取出nc膜进行修剪，弃去凝胶。封闭：将奶粉溶于pbst配制成5％封闭液，将nc膜置于封闭液中室温放置2小时。孵育一抗：封闭完成后取出nc膜，弃去封闭液。然后在摇床上用一抗孵育nc膜。兔抗ikkα抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：10000稀释、兔抗iκbα抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：1000稀释、兔抗p-iκbα抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：1000稀释、兔抗p-ikkα抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：1000稀释、兔抗nf-κbp65抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：50000稀释、兔抗tnf-α抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：500稀释、兔抗p27kip1抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：1000稀释、兔抗cycline1抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：1000稀释，4℃过夜。复温2小时，小心取出nc膜弃去一抗，pbst洗3遍，每次10min。孵育二抗：将山羊抗兔igg二抗用5％脱脂奶粉溶液以1:2000的比例混合，用涡旋振荡器混匀后室温下孵育nc膜2h。二抗孵育结束后，取出nc膜弃去二抗，用pbst洗3遍，每次15min。曝光显影：配制显色液：将ecl化学发光底物反应液中的试剂a和试剂b以1:1比例混合，摇匀待用。将nc模放入多功能分子成像系统的托盘上，滴加配制好的ecl反应液100μl，孵育2min，设置曝光时间为auto，然后拍照记录实结果。结果分析：使用quantityone图像分析系统对实验结果中的目标蛋白条带的累积灰度值进行测量分析，同时通过与内参β-actin灰度值对比以校正误差。5.2实验结果苦豆碱对pdgf-bb诱导的hpasmcs中ikk、iκb、p-iκb、p-ikk、nf-κb、tnf-α、p27kip1、cycline1蛋白表达的影响：根据westernbolt的结果显示，与正常组相比，模型组hpasmcs的nfκb-p65，p-ikkα，p-iκbα、tnf-α和cycline1蛋白表达明显增高(图6,8,9,10,11，p＜0.01，p＜0.05)，iκbα、ikkα蛋白表达无变化(图5,7，p＞0.05)，p27kip1蛋白表达显著降低(图12，p＜0.01)；与模型组相比，苦豆碱组可明显改善pdgf-bb诱导的hpasmcs中的nfκb-p65，p-ikkα，p-iκbα、tnf-α和cycline1蛋白表达增多现象(图6,8,9,10,11，p＜0.01，p＜0.05)，提高p27kip1蛋白表达(图12，p＜0.05)；而对于iκbα、ikkα蛋白，各组均无明显差别(图5,7，p＞0.05)。以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页12