大鼠心尖切除诱导心肌再生模型的建立方法与流程

本发明涉及一种大鼠心尖切除诱导心肌再生模型的建立方法。

背景技术：

心血管病高居我国居民总疾病死亡原因首位，且年患病率和死亡率仍处于上升阶段，是危害民众生命和健康的主要公共卫生问题。曾经由于缺乏对心脏再生领域的研究，人们普遍认为成年哺乳动物的心脏几乎不具有再生能力，因此当心脏遭受损伤时不能进行有效的修复。例如当心肌梗死发生时会造成心肌细胞的大量死亡，取而代之心肌成纤维细胞大量聚集在心肌细胞凋亡区域形成疤痕组织，严重的心肌纤维化，最终会导致心室重构直以及心脏功能下降乃至心力衰竭。因此心肌细胞的大量丢失是各种心血管疾病终末导致心力衰竭，危及生命健康的根本原因。已有研究发现，新生小鼠在出生后一周内心肌细胞具有短暂增殖能力。这一重大发现为探究哺乳动物心脏再生能力提供了相关策略，为研究心脏修复和心血管疾病的治疗提供了新的视角。因此探究新生哺乳动物心脏损伤后心脏再生的机制具有重要意义。

新生小鼠心肌损伤模型的提出为研究哺乳动物心脏再生提供了有力支持。目前较为普遍的心肌损伤模型有新生小鼠心尖切除模型（apicalresection）、新生小鼠心肌梗死模型（myocardialinfarction）和新生小鼠心脏冻伤模型（cryoinjury）。porrello实验室于2011年发表在science上的文章第一次提出出生1天（p1）的新生小鼠在施行心尖切除手术后，能够诱导其心肌再生的能力，这种能力可以持续到出生后第7天（p7）。对出生1天小鼠施行心尖切除术3周后，可发现心尖缺失部位被修复，而且遗传谱系追踪研究发现这些用于修补缺失部位的心肌细胞绝大部分是由原有的心肌细胞增殖而来。

心尖切除带来的损伤可以刺激新生小鼠心肌细胞的增殖和心脏修复。根据porrello实验中的描述，分别对p1天和p7天小鼠施行心尖切除手术，p1天小鼠心尖切除程度以左心室暴露为标准以达到实验可重复性，p7天小鼠心尖切除程度小于p1天小鼠。假手术组除不切除心尖外，其余步骤与手术组一致。与此同时，mahmoud等人的实验中对新生小鼠心尖切除关键步骤的描述是：打开新生小鼠胸腔后，将心脏轻轻挤压出胸腔，之后用虹膜剪少量多次剪下心尖组织，直至左心室暴露，剪下的心尖约占左心室的15%。

目前所知道的心尖切除方法，未能对所切除心尖大小进行统一标准的定量；另一方面心尖切除过程中，手术器械的直接接触，以及反复多次的剪切会对心脏造成额外损伤，而这些附加的额外损伤势必会影响手术稳定性和均一性，进而影响对术后心脏的增殖效率评价的准确性。

porrello和mahmoud的文章中将小鼠心尖切除大小定量为左心室的15%并以左心室暴露为切除标准以达到实验可重复性，然而这种以暴露左心室为标准的方法有一定局限性。手术过程中新生小鼠左心室体积的15%是难以准确定量的。因此，设计一种简单可行并可以定量切除小鼠心尖的手术方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大鼠心尖切除诱导心肌再生模型的建立方法，对切除心尖大小达到可定量目的。

为达到上述目的,本发明采用如下技术方案：

一种大鼠心尖切除诱导心肌再生模型的建立方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将新生大鼠置于冰盒内麻醉4-5分钟；

b.在新生大鼠腋下左胸口处做一0.4-0.6cm长水平切口，显微剪剪开肌肉暴露肋骨；

c.第四肋间隙打开胸腔，肋间隙开口使开口视野暴露心脏即可；

d.用微型台式真空泵连接移液枪枪头对心尖进行定量，且将枪头开口直径调整为2±0.2mm，将微量台式真空泵真空度调节至0.06±0.005mpa，将枪头开口抵压在左心室心尖位置，静置确保心尖被吸牢，沿着枪头开口边缘一次性剪下心尖组织，将剪下的心尖组织置于4%pfa中；

e.缝合消毒。

本发明以porrello文章中所提出方法为基础，以出生后1天新生大鼠为实验对象，对现有适用于小鼠的心尖切除术进行改良。通过手术过程中和手术后分别对切除心尖体积进行定量，已达到手术稳定性和均一性。

附图说明

图1为新生大鼠心尖切除手术步骤流程图。（a）低温麻醉新生大鼠；（b）碘伏消毒小鼠左胸口皮肤，显微剪剪开小鼠皮肤与肌肉；（c）突破肋间并暴露出心脏；（d）将微型台式真空泵档位调制最大，约0.06mpa，外连吸头吸牢小鼠心尖，准确定量所切心尖体积，虹膜剪紧贴吸头边缘迅速剪切心尖；（e）4%pfa溶液固定切下心尖；（h）缝合肋骨、肌肉与皮肤，并将小鼠置于37℃恒温毯上恢复苏醒。

图2为新生大鼠心尖切除后心肌再生过程。心尖切除后1天、2天、7天、14天心脏he染色图。心尖切除后1天，切除部位有血痂出现，以堵住创口；手术后2天，血痂逐步形成一定形态，之后逐渐被纤维组织和心肌组织填充取代；直至心尖切除部位被完全修复。

图3为切除心尖显微镜所拍图片。我们将切下心尖置于4%pfa溶液中固定，之后将其置于显微镜下拍照，用以统计心尖面积大小。其中1-7为正常剪切过程所得心尖，8为多次剪切后所得心尖，9为没有使用定量设备，直接使用虹膜剪剪切所得心尖。

图4为切除心尖面积统计图。我们使用imagej软件统计以上过程所切心尖的面积大小，并将其做成散点图以验证所切心尖大小是否均一。图a可以看出1-7号心尖面积较均已，而8号和9号面积明显小于1-7号。图b显示1-7号心尖面积离散程度较好，而8号和9号明显偏离均值。以上数据说明利用我们的设备，可以实现新生大鼠心尖切除手术的可重复性。

具体实施方式

参见图1—图4，以下结合具体实施例,来进一步说明本发明的技术方案。应理解,以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。

1.操作步骤：

1)将新生大鼠置于冰盒内低温麻醉4分钟，切记过长时间低温麻醉会增加小鼠术后死亡率。低温麻醉后新生大鼠心跳和呼吸停止，可防止手术过程中过度出血。尽可能缩短手术时间，避免小鼠提前苏醒。

2)将新生大鼠置于体视镜下，仰卧位固定四肢，用碘伏棉棒消毒胸口手术区域。

3)在新生大鼠腋下左胸口处做一0.5cm长水平切口，显微剪剪开肌肉暴露肋骨，。

4)用显微镊于第四肋间隙打开胸腔，肋间隙开口不宜过大，使开口视野暴露心脏即可。胸腔打开位置关系到后续操作步骤，肋间隙选择不准确将会直接影响心尖暴露效果。切记手术过程不要损伤肺组织。

5)我们用微型台式真空泵连接200µl移液枪枪头对心尖进行定量，且将枪头开口直径调整为2mm时可达到最佳手术效果。体视镜下轻轻分离心包膜，找到左心室心尖位置，将微量台式真空泵真空度调节至最大档位约为0.06mpa，将枪头开口轻轻抵压在左心室心尖位置，静置5秒钟，确保心尖被吸牢，待心尖被吸牢后，用虹膜剪沿着枪头开口边缘一次性迅速剪下心尖组织。将剪下的心尖组织从枪头中取出，置于4%pfa中，然后用显微镜进行拍照，imagej软件统计切下的心尖组织横切面积。

6)用7-0的非吸收性缝合线缝合肋间隙，然后依次缝合肌肉和皮肤。缝合结束后，用消毒棉签擦净伤口处血迹。

7)手术后的新生大鼠要置于37℃的恒温毯上。待新生大鼠完全苏醒后棉签蘸取母鼠尿液涂于小鼠体表，然后将其放回母鼠笼中饲养，此步可有效降低母鼠食子率。

8)术后通过统计切除心尖的面积、剔除显著差异个体，确保手术稳定性和均一性。