响应面法优化的罗汉松实黄酮的提取工艺的制作方法

本发明涉及一种植物黄酮提取工艺，特别涉及一种响应面法优化的罗汉松实黄酮的提取工艺，属于食品科学与工程技术领域。

背景技术：

罗汉松，又名罗汉杉、土杉，学名podocarpusmacrophyllus(thumb.)d.don，裸子植物门罗汉松科的一属，为常绿乔木。近年来国内外学者对罗汉松药材的化学成分和药理作用进行了许多研究，罗汉松属植物所含的双黄酮成分对抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎及对血液系统和神经系统的作用等方面显示了较好的活性。罗汉松种子提取物对人胃癌细胞mgc-803有明显的体外抑制作用。罗汉松实醇提物有降血脂、保肝及抗氧化的作用，罗汉松花托汁对实验动物没有明显的毒性反应。但关于罗汉松黄酮的提取鲜有报道。为了进一步利用罗汉松的药用价值，本发明对罗汉松实进行黄酮的提取工艺研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种响应面法优化的罗汉松实黄酮的提取工艺，该工艺通过对罗汉松实黄酮的提取工艺进行响应面法的优化，建立了提取罗汉松实黄酮的回归模型，从而确定最佳的罗汉松实黄酮的超声提取工艺，该方法具有黄酮得率高的优点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种响应面优化光谱扫描辅助提取罗汉松实黄酮的工艺，该工艺包括如下步骤：

(1)原料预处理：洗净后，杀青5-6min，于55-60℃下干燥，粉碎得到罗汉松实粉末；

(2)黄酮提取：罗汉松实粉末加入超纯水，按不同料液比在不同超声时间、超声温度下进行提取，得上清液，超声频率40khz，超声功率200w，通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比；

①在单因素实验的基础上，由design-expert8.0.6统计分析软件中的box-benhken试验设计，选择对黄酮提取率影响较为显著的3个因素作为考察对象，即料液比(a)、超声时间(b)、超声温度(c)为自变量，以黄酮浓度(y1)和对dpph的清除率(y2)为因变量(响应值)进行box-behnken中心组合设计，建立数学模型优化工艺条件，预测的模型如下：

y1＝3.41-5.00a+0.1b+0.06c-0.061ab-0.032ac-0.12c+0.041a²+0.059b²-0.31c²

②根据回归方程得到响应面分析图，考察拟合之后的响应曲面形状，分析所选定的三个变量对考察的响应值的影响；通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，并且通过对3d曲面图的分析，直观地评价各因素间的交互作用，最后得到最优工艺参数。

作为优选，所述步骤(2)黄酮提取具体过程为：罗汉松实粉末加入超纯水，料液比为1:28-32(g/ml)，超声温度70.0-72℃，超声时间2.9-3.1h。

作为优选，黄酮浓度的测定采用光谱扫描法，即将芦丁和上述制备所得的上清液稀释到适宜的浓度，用超纯水作为空白对照溶液，在200～800nm波长范围内光谱扫描，用芦丁较大吸收峰处吸光度的大小来衡量提取液黄酮浓度的高低，以确定罗汉松果实中黄酮提取的影响因素和水平。

一种响应面优化超声辅助提取罗汉松实黄酮的工艺，该工艺包括如下步骤：

(1)原料预处理：洗净后，杀青5-6min，于55-60℃下干燥，粉碎得到罗汉松实粉末；

(2)黄酮提取：罗汉松实粉末加入超纯水，按不同料液比在不同超声时间、超声温度下进行提取，得上清液，超声频率40khz，超声功率200w，通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比；

①在单因素实验的基础上，由design-expert8.0.6统计分析软件中的box-benhken试验设计，选择对黄酮提取率影响较为显著的3个因素作为考察对象，即料液比(a)、超声时间(b)、超声温度(c)为自变量，以黄酮浓度(y1)和对dpph的清除率(y2)为因变量(响应值)进行box-behnken中心组合设计，建立数学模型优化工艺条件，预测的模型如下：

y1＝23.1-0.025a+2.49b+1.89c-0.65ab-1.15ac+0.43bc-1.09a²-3.16b²-10.56c²

②根据回归方程得到响应面分析图，考察拟合之后的响应曲面形状，分析所选定的三个变量对考察的响应值的影响；通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，并且通过对3d曲面图的分析，直观地评价各因素间的交互作用，最后得到最优工艺参数。

作为优选，所述步骤(2)黄酮提取具体过程为：罗汉松实粉末加入超纯水，料液比为1:45-47(g/ml)，超声温度70.4-70.6℃，超声时间2.6-2.7h。

作为优选，所述的统计分析软件为design-expert8.0.6。

本发明的有益效果是：本发明在单因素实验基础上，采用box-behnken响应面实验设计，根据design-expert8.0.6软件进行分析，该工艺通过对罗汉松实黄酮的提取工艺进行响应面法的优化，建立了提取罗汉松实黄酮的回归模型，从而确定最佳的罗汉松实黄酮的超声提取工艺，该方法具有黄酮得率高的优点，提取工艺简洁，提取条件温和，此法比比色测定法更精确，且省时、省药品对环境友好。

附图说明

图1是芦丁光谱扫描图；

图2是料液比对吸光度的变化曲线；

图3是超声时间对吸光度的变化曲线；

图4是超声温度对吸光度的变化曲线；

图5是y＝f(a,b)的响应面图和等高线图；

图6是y＝f(a,c)的响应面图和等高线图；

图7是y＝f(b,c)的响应面图和等高线图；

图8是扫描法和测定法提取物对ce(ⅳ)还原能力的比较曲线；

图9是扫描法和测定法提取物对dpph清除率的比较曲线；

图10是料液比对黄酮浓度和对dpph清除率的曲线；

图11是超声时间对黄酮得率和对dpph清除率的曲线；

图12是超声温度对黄酮得率和对dpph清除率的曲线；

图13是y＝f(a,b)的响应面图和等高线图；

图14是y＝f(a,c)的响应面图和等高线图；

图15是y＝f(b,c)的响应面图和等高线图；

图16是罗汉松实黄酮与vc对dpph清除率的变化曲线；

图17是罗汉松实黄酮与vc对oh清除率的变化曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

材料与试剂

罗汉松果实采于2018年7月嘉兴职业技术学院校园内，洗净后，杀青5min，于60℃下干燥，粉碎后储存备用。无水酒精、浓硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸氢钠均为国产分析纯：上海联试化工试剂有限公司；维生素c：天津博迪化工股份有限公司；芦丁：国药集团化学试剂有限公司。dpph即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼：东京化成工业株式会社；na2so4：兰溪中星化工试剂有限公司；ce(so4)2·4h2o：北京康普汇科技有限公司；果胶酶(酶活力≥50.0u/g)：国药集团化学试剂有限公司。

抗氧化活性测定

1、对dpph清除率的测定

用dpph自由基清除法衡量样品的抗氧化性。罗汉松叶提取液的dpph自由基清除测定参照秦嫚嫚等(秦嫚嫚,冯育林,邵崇钰,等dpph法测定芒果叶中总黄酮提取物的抗氧化活性[j]..中药新药与临床药理,2014,25(2):185-188)的方法，并进行了修改。

准确称取25.8mgdpph·，用70％乙醇溶解后定容于200ml容量瓶，作为储备液储藏在棕色瓶于4℃的冰箱中保存，用时取出。利用dpph·溶液的紫红色，在加入抗氧化剂后颜色变淡来表示其对自由基的清除能力。取0.50ml样品溶液加入10.00mldpph·乙醇溶液，摇匀，37℃避光反应15min后，在523nm波长处测定其吸光度(以70％乙醇为空白调零)，空白样对照用0.50ml超纯水代替样品溶液，重复测定3次，取平均值。根据下列公式计算榨汁对dpph·自由基的清除率：

dpph·清除率(％)＝(a0－ai)/a0×100％

式中：a0——10.00mldpph·溶液+0.50ml样品的溶剂；ai——10.00mldpph·溶液+0.50ml样品溶液

2、对ce(ⅳ)还原率的测定

采用cerac法利用ce(ⅳ)/ce(ⅲ)之间的转化度，评价样品的总还原能力。称取0.0809gce(so4)2·4h2o，加入25ml超纯水，17ml浓h2so4，搅拌直至完全溶解，转移到100ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，得浓度为2.0×10^-3mol/lce(so4)2溶液。称取30.40gna2so4于100ml烧杯中，加水溶解，定容至250ml后，缓慢加入54ml的浓硫酸，摇匀，冷却，得到na2so4溶液。检测试剂由9mlna2so4溶液和1mlce(ⅳ)溶液组成。

用紫外可见分光光度计检测时，以超纯水为参比，测定波长320nm，移取一定浓度样品溶液0.50ml加入10.00ml检测试剂，摇匀，在37℃水浴避光反应50min后测定吸光度，所有样品测试过程重复三次。按下列公式计算样品对ce(ⅳ)的还原率：

ce(ⅳ)的还原率(％)＝[(a0－ai)/a0]×100％

式中，a0表示0.50ml水和10.00ml检测试剂的吸光值；ai表示0.50ml样品和10.00ml检测试剂的吸光值。

3、黄酮含量的测定

单因素实验和中心组合实验黄酮浓度的测定采用光谱扫描法，即将芦丁和上述制备所得的上清液稀释到适宜的浓度，用超纯水作为空白对照溶液，在200～800nm波长范围内光谱扫描，用芦丁较大吸收峰处吸光度的大小来衡量提取液黄酮浓度的高低，以确定罗汉松果实中黄酮提取的影响因素和水平，中心组合实验黄酮的浓度用芦丁2个吸收峰处的吸光度值之和代替。验证实验黄酮含量的测定采用nano2-al(no3)3比色法测黄酮。

4、对羟自由基(·oh)消除率的测定

本实验在smironff等报道的方法的基础上进行了改进，以2.0mmol/lfeso4︰3.0mmol/lh2o2︰3.0mmol/l水杨酸＝1︰1︰1的比例加入到烧杯中(按此顺序加，摇匀，现配现用)，混合液于室温反应15min。取10ml比色管，每支都加入上述溶液9.00ml，然后分别加入不同浓度的样品溶液1.00ml摇匀，继续于室温反应15min后以超纯水调零，于510nm处测其吸光度ai平行测3次，求其平均值。按以下公式计算各试样对羟基自由基(oh·)的清除率：

清除率(％)＝[a0－ai)/a0]×100％

式中：a0为不加样品只加超纯水时溶液的吸光度；aj为不加水杨酸溶液时的吸光度；ai为加样品时溶液的吸光度。

实施例1：响应面优化光谱扫描辅助提取罗汉松实黄酮的工艺

1、罗汉松实黄酮的提取

称取罗汉松果实粉末2.500g，用不同的溶剂按一定的料液比、在超声频率40khz，超声功率200w和一定提取温度下浸提一定时间，经离心分离(3000r/min，10min)，得上清液，保存于4℃的冰箱中备用。通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比。

2、抗氧化活性测定

①对dpph清除率的测定

用dpph自由基清除法衡量样品的抗氧化性。罗汉松实提取液的dpph自由基清除测定参照秦嫚嫚等(秦嫚嫚,冯育林,邵崇钰,等dpph法测定芒果叶中总黄酮提取物的抗氧化活性[j]..中药新药与临床药理,2014,25(2):185-188)的方法，并进行了修改。

准确称取25.8mgdpph·，用70％乙醇溶解后定容于200ml容量瓶，作为储备液储藏在棕色瓶于4℃的冰箱中保存，用时取出。利用dpph·溶液的紫红色，在加入抗氧化剂后颜色变淡来表示其对自由基的清除能力。取0.50ml样品溶液加入10.00mldpph·乙醇溶液，摇匀，37℃避光反应15min后，在523nm波长处测定其吸光度(以70％乙醇为空白调零)，空白样对照用0.50ml超纯水代替样品溶液，重复测定3次，取平均值。根据下列公式计算榨汁对dpph·自由基的清除率：

dpph·清除率(％)＝(a0－ai)/a0×100％

式中：a0——10.00mldpph·溶液+0.50ml样品的溶剂；ai——10.00mldpph·溶液+0.50ml样品溶液

②对ce(ⅳ)还原率的测定

采用cerac法利用ce(ⅳ)/ce(ⅲ)之间的转化度，评价样品的总还原能力。称取0.0809gce(so4)2·4h2o，加入25ml超纯水，17ml浓h2so4，搅拌直至完全溶解，转移到100ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，得浓度为2.0×10^-3mol/lce(so4)2溶液。称取30.40gna2so4于100ml烧杯中，加水溶解，定容至250ml后，缓慢加入54ml的浓硫酸，摇匀，冷却，得到na2so4溶液。检测试剂由9mlna2so4溶液和1mlce(ⅳ)溶液组成。

用紫外可见分光光度计检测时，以超纯水为参比，测定波长320nm，移取一定浓度样品溶液0.50ml加入10.00ml检测试剂，摇匀，在37℃水浴避光反应50min后测定吸光度，所有样品测试过程重复三次。按下列公式计算样品对ce(ⅳ)的还原率：

ce(ⅳ)的还原率(％)＝[(a0－ai)/a0]×100％

式中，a0表示0.50ml水和10.00ml检测试剂的吸光值；ai表示0.50ml样品和10.00ml检测试剂的吸光值。

③黄酮含量的测定

单因素实验和box-behnken中心组合实验黄酮浓度的测定采用光谱扫描法，即将芦丁和上述制备所得的上清液稀释到适宜的浓度，用超纯水作为空白对照溶液，在200～800nm波长范围内光谱扫描，用芦丁较大吸收峰处吸光度的大小来衡量提取液黄酮浓度的高低，以确定罗汉松果实中黄酮提取的影响因素和水平，中心组合实验黄酮的浓度用芦丁2个吸收峰处的吸光度值之和代替。验证实验黄酮含量的测定采用nano2-al(no3)3比色法测黄酮。

黄酮用芦丁作标准品，对芦丁溶液进行光谱扫描(见图1)，在352nm、256nm、203nm有吸收峰。

3、单因素试验

①提取剂的选择

称取罗汉松果实粉末6份，每份称取1.000g，放置于50ml具塞的锥形瓶中，分别加入超纯水、超纯水+果胶酶(0.6g/l)、95％乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮20ml，30℃超声1h，离心分离，取上清液测黄酮浓度(吸光度大则黄酮浓度大)，由表1可知纯水浸提黄酮含量最高，因此提取剂选水。

表1.不同溶剂浸提罗汉松黄酮

②料液比

称取2.500g,罗汉松实粉末5份，分别加入超纯水50、100、150、200、250ml，在40℃水浴浸提90min，离心分离得上清液，将上清液定容至250ml，稀释至一定体积在200～800nm波长范围内进行光谱扫描，料液比对吸光度的影响见图2。由图2可知料液比为1:40(g/ml)时，在三个吸收峰处对吸光度的影响率最大，故选择料液比为1:40(g/ml)。

③超声时间

称取2.500g罗汉松实粉末5份，超声温度为60℃，料液比1:40(g/ml)，超声时间对吸光度的影响如图3所示，随着超声时间的增加吸光度增大，故选择超声时间为2.5h。

④超声温度

称取2.500g罗汉松实粉末5份，料液比为1:40(g/ml)，超声时间为2.5h，不同温度提取对吸光度的清除率影响见图4。由图4可知，在50℃～70℃随着温度的升高吸光度增加，在70℃时最高，80℃反而减小，这是因为温度过高，黄酮的结构发生改变，因此选择超声温度为70℃。

4、响应面实验设计

根据单因素实验选择黄酮得率及对抗氧化性影响大的三个因素及水平，结果见表2。

表2响应面的因素与水平

在单因素实验的基础上，选择对黄酮提取率及对抗氧化性影响较为显著的3个因素作为考察对象，即料液比(a)、超声时间(b)、超声温度(c)为自变量，以黄酮浓度(y1)和对dpph的清除率(y2)为因变量(响应值)进行box-behnken中心组合设计，建立数学模型优化工艺条件。

响应面试验设计及结果如下所示：

4.1box-benhken实验设计及实验结果

由design-expert8.0.6统计分析软件中的box-benhken试验设计，以料液比(a)、超声时间(b)、超声温度(c)为自变量，黄酮浓度(y1)和对dpph的清除率(y2)为因变量，建立三因素三水平的中心组合设计，设计15个试验方案，每个试验对dpph清除率的测定测定3次，取平均值，黄酮浓度用光谱扫描的352nm和203nm处吸光度值之和代替，具体的试验方案及试验结果见表3。

表3box-behnken设计方案及试验结果

通过designexpert8.0.6软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型为：y1＝3.41-5.00a+0.1b+0.06c-0.061ab-0.032ac-0.12c+0.041a²+0.059b²-0.31c²

根据表4方差分析结果，对方差分析进行显著性检验显示，该模型回归显著(<0.05)，失拟项不显著，计算结果表明该模型r²＝0.9006，说明该模型与实际生产结果拟合性很好。由表4中f值的大小可判断各因素对抗氧化成分的影响大小，f值越大，影响越强。对抗氧化成分影响大小顺序为：超声时间>超声温度>料液比。

表4黄酮实验结果方差分析表

注：***差异极显著p＜0.0001；**差异高度显著p＜0.01；*差异显著p＜0.05

4.4响应曲面分析

响应面为响应值对两两交互因素所构成的三维空间曲线图，曲面的倾斜度表明该试验因素对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡峭，表明该试验因素对响应值y的影响越显著。响应面等高线图可以直观地反映出两个因素间交互效应的强弱，等高线的形状越接近椭圆形，表示两个因素交互效应越强，而圆形则反之。如图5～7所示，对黄酮得率的影响bc之间的交互作用很强。

5、验证实验

1、光谱扫描法

以罗汉松黄酮的浓度及对dpph的清除率为考察指标，根据design-expert8.0.6软件所得回归方程的最优预测值求解，得紫外-可见光谱扫描辅助对罗汉松黄酮提取的最佳工艺条件为：料液比为1:30(g/ml)，超声温度70.0℃，超声时间3h，超声频率40khz，超声功率200w。其理论预测值黄酮浓度(用吸光度)为3.676a，黄酮提取率为9.76mg/kg。在此条件下进行3次平行验证实验，实验结果黄酮平均浓度为23.4mg/l，rsd是2.59％。结果表明，经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明本实验建立的二次多项回归方程模型能准确预测各因素与效应面之间的关系。

2、比色测定法

同一实验单因素实验及中心组合实验采用比色测定法，即测定黄酮的浓度和对dpph的清除率来确定因素和水平，其响应面优化的工艺参数是：料液比0.46(g/ml)、超声时间2.7h、超声温度70.4℃、黄酮浓度23.0mg/l。验证实验的结果为：黄酮平均浓度为22.3mg/l，rsd是2.65％。

3、抗氧化性比较

将光谱扫描法和比色测定法这两组工艺参数提取的取物稀释到同一体积，比较两者的抗氧化性，其抗氧化性见图8-9。无论是对ce(ⅳ)还原能力还是对dpph的清除率，扫描法的抗氧化性都强于比色测定法。两者对dpph的清除率强于0.05％vc，对ce(ⅳ)还原能力当0.1％vc添加量<0.2ml时稍弱于这2种罗汉松提取物，0.1％vc添加量>0.2ml还原能力大大超过这2种罗汉松提取物。

综上，采用紫外-可见光谱扫描法应用box-behnken响应面实验设计，根据design-expert8.0.6软件进行分析，对罗汉松实黄酮的提取工艺进行优化，得最佳工艺条件为：料液比为1:30(g/ml)，超声温度70.0℃，超声频率40khz、超声功率200w、超声3h，在此条件下进行3次平行实验，黄酮平均提取率为9.76mg/kg，rsd是2.59％。此法比比色测定法更精确，且省时、省药品对环境友好。

实施例2：

一种响应面优化光谱扫描辅助提取罗汉松实黄酮的工艺，该工艺步骤是：

(1)原料预处理：罗汉松实洗净后，杀青5-6min，于55-60℃下干燥，粉碎得到罗汉松实粉末；

(2)黄酮提取：罗汉松实粉末加入超纯水，料液比为1:30(g/ml)，超声温度69.2℃，超声时间2.97h，超声频率40khz，超声功率200w。黄酮浓度(用吸光度)为3.661a。

实施例3：响应面优化超声辅助提取罗汉松实黄酮的工艺

1试验方法

1.1抗氧化成分提取

称取罗汉松实样品2.500g，用不同溶剂按一定的料液比、在超声频率40khz，超声功率200w和一定提取温度下浸提一定时间，经离心分离后，将所得溶液用稀释定容到一定体积，摇匀，得到样品溶液。

1.2响应面实验设计

在单因素实验的基础上，选择对抗氧化活性影响较为显著的3个因素作为考察对象，即加酶量(a)、酶解时间(b)、酶解温度(c)为自变量，以黄酮浓度(y1)和对dpph的清除率(y2)为因变量(响应值)进行box-behnken中心组合设计，建立数学模型优化工艺条件。

2结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1提取溶剂选择

称取罗汉松果实粉末6份，每份称取1.000g，放置于50ml具塞的锥形瓶中，分别加入超纯水、超纯水+果胶酶(0.6g/l)、95％乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮20ml，30℃超声1h，离心分离，取上清液测黄酮浓度(吸光度大则黄酮浓度大)，由表5可知纯水浸提黄酮含量最高，因此提取剂选水。

表5.不同溶剂浸提罗汉松黄酮

2.1.2料液比

称取2.500g,罗汉松实粉末5份，分别加入超纯水50、100、150、200、250ml，在40℃水浴浸提90min，离心分离得上清液，将上清液定容至250ml，料液比对dpph清除率和黄酮得率的影响见图10。由图1可知料液比为1:40(g/ml)时，对dpph的清除率和黄酮的得率最大，故选择料液比为1:40(g/ml)。

2.1.3超声时间

称取2.500g罗汉松实粉末5份，超声温度为60℃，料液比1:40(g/ml)，超声时间对黄酮得率和对dpph清除率的影响如图11所示，随着超声时间的增加对黄酮得率和对dpph的清除率增大，在所试范围选择超声时间为2.5h。

2.1.4超声温度

称取2.500g罗汉松实粉末5份，料液比为1:40(g/ml)，超声时间为2.5h，不同温度提取对黄酮得率和对dpph的清除率影响见图12。由图12可知，随着温度的升高黄酮的浓度增加，60℃～80℃时增加缓慢，对dpph清除率在70℃时最高，这是因为温度过高，黄酮的结构发生改变，抗氧化性降低，因此两者综合选择超声温度为70℃。

2.2.响应面法优化罗汉松黄酮提取工艺

根据单因素实验选择对黄酮得率及对抗氧化性影响大的三个因素及水平，结果见表6。

表6响应面的因素与水平

2.2.1响应面结果分析

由design-expert8.0.6统计分析软件中的box-benhken试验设计，以料液比(a)、超声时间(b)、超声温度(c)为自变量，黄酮浓度(y1)对dpph的清除率(y2)为因变量，建立三因素三水平的中心组合设计，设计15个试验方案，每个试验测定3次，取平均值，具体的试验方案及试验结果如表7所示。

表7box-behnken设计方案及试验结果

通过designexpert8.0.6软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型为：y1＝23.1-0.025a+2.49b+1.89c-0.65ab-1.15ac+0.43bc-1.09a²-3.16b²-10.56c²

根据表8方差分析结果，对方差分析进行显著性检验显示，该模型回归显著(<0.001)，失拟项不显著，计算结果表明该模型r²＝0.9872，说明该模型与实际生产结果拟合性很好。由表4中f值的大小可判断各因素对抗氧化成分的影响大小，f值越大，影响越强。对抗氧化成分影响大小顺序为：超声时间>超声温度>料液比。

表8黄酮实验结果方差分析表

注：***差异极显著p＜0.0001；**差异高度显著p＜0.01；*差异显著p＜0.05

2.2.2响应曲面分析

响应面为响应值对两两交互因素所构成的三维空间曲线图，曲面的倾斜度表明该试验因素对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡峭，表明该试验因素对响应值y的影响越显著。响应面等高线图可以直观地反映出两个因素间交互效应的强弱，等高线的形状越接近椭圆形，表示两个因素交互效应越强，而圆形则反之。如图13～15所示，对黄酮得率的影响bc之间的交互作用很强。

2.3验证实验

以罗汉松黄酮及对dpph的清除率为考察指标，根据design-expert8.0.6软件所得回归方程的最优预测值求解，可得超声辅助对罗汉松黄酮提取的最佳工艺条件为：在料液比为1:46(g/ml)，超声温度70.4℃，超声时间2.7h，超声频率40khz，超声功率200w。其理论预测值黄酮浓度为23.0mg/ml、对dpph的清除率为72.4％。在此条件下进行3次平行验证实验，实验结果黄酮浓度为22.3mg/ml，rsd是0.147％，与预测值的相对偏差为3.04％。结果表明，经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明本实验建立的二次多项回归方程模型能准确预测各因素与效应面之间的关系。

2.4与vc抗氧化性比较

罗汉松黄酮具有较好的抗氧化性，其提取液稀释10倍，比0.05％vc清除dpph的能力强(见图16)，比0.01％vc清除oh的能力强(见图17)。

3结论

在单因素实验基础上，采用box-behnken响应面实验设计，根据design-expert8.0.6软件进行分析，对超声波辅助提取罗汉松实黄酮的工艺进行优化，建立了提取罗汉松实黄酮的回归模型，由该模型优化的黄酮提取的最佳工艺条件为：在料液比为1:46(g/ml)，超声温度70.4℃，超声时间2.7h，超声频率40khz，超声功率200w，黄酮的提取率为9.30mg/kg。响应面优化超声波辅助提取罗汉松实黄酮，重现性好，提取的黄酮抗氧化性强，是一种合适的提取罗汉松黄酮的方法。

实施例4：

一种响应面优化超声辅助提取罗汉松实黄酮的工艺，该工艺具体步骤是：

(1)原料预处理：罗汉松实洗净后，杀青5-6min，于55-60℃下干燥，粉碎得到罗汉松实粉末；

(2)黄酮提取：罗汉松实粉末加入超纯水，在料液比为1:46(g/ml)，超声温度70.4℃，超声时间2.7h，超声频率40khz，超声功率200w，黄酮的提取率为9.26mg/kg。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。