可注射型组织工程骨修复材料及其构建方法与流程

本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种可注射型组织工程骨修复材料及其构建方法。

背景技术：

可注射型组织工程骨修复材料通常是将水凝胶类支架载体与种子细胞、活性因子以某种方式复合在一起，以注射的方式植入体内，在体内通过物理或化学作用转化为固态，或以某种方式固定，植入物逐渐生成骨组织，发挥骨修复作用。

在可注射型组织工程骨修复材料的组分中，种子细胞发挥骨形成的核心作用。种子细胞的数量、密度、成骨活性决定了可注射型组织工程骨修复材料的骨生成能力的高低。现有的通常种子细胞在可注射型组织工程骨修复材料中是以单个细胞的形式存在。例如申请号为200510036966.1的专利申请“一种注射型组织工程骨修复材料和构建方法”以及申请号为200510034120.4的专利申请“一种注射型组织工程骨及其构建与应用”均是使用单个细胞为种子细胞。当种子细胞以单个细胞的形式存在时，由于细胞间空隙较大，可接种密度偏低，通常在10⁷数量级，在上述两个专利申请中，种子细胞的密度均在10⁷数量级。当种子细胞以某种形式聚集在一起时，由于细胞间连接紧密，可接种密度明显提高，可达到10⁸数量级，使骨形成能力明显提高，但由于在组织工程骨修复材料的构建中，种子细胞的接种密度远高于常规细胞培养，因而种子细胞在组织工程骨修复材料中容易出现供氧不足，从而严重影响种子细胞的成骨活性。

技术实现要素：

本发明针对上述问题，提出了一种可注射型组织工程骨修复材料及其构建方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种可注射型组织工程骨修复材料，包括凝胶载体和种子细胞，种子细胞附着于凝胶载体上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，以可注射性的海藻酸钠和纤维蛋白原混合物作为凝胶载体，凝胶载体用于复合种子细胞；所述种子细胞为骨髓基质干细胞微球，即以骨髓基质干细胞培养得到的细胞微球。

所述的可注射性的海藻酸钠和纤维蛋白原混合物为质量浓度为0.1％-4％的海藻酸钠和浓度为5-30mg/ml的纤维蛋白原以体积比1:3混合形成的。

所述骨髓基质干细胞微球为细胞密度为10⁸数量级的细胞微球。

一种可注射型组织工程骨修复材料的构建方法，包括以下步骤：

(1)培养种子细胞，种子细胞为骨髓基质干细胞微球；

(2)构建可注射性凝胶载体，以可注射性的海藻酸钠和纤维蛋白原混合物进行混合形成凝胶载体；

(3)复合种子细胞与凝胶载体，将种子细胞附着于凝胶载体以形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体。

步骤(1)中，种子细胞为细胞密度为10⁸数量级的骨髓基质干细胞微球。优选的，将细胞密度为6×10⁵/ml的骨髓基质干细胞悬液置于旋转培养瓶中，转速为60转/分钟，旋转培养72小时后收集细胞密度为10⁸数量级的骨髓基质干细胞微球。

步骤(2)中，将质量浓度为0.1％-4％的海藻酸钠和浓度为5-30mg/ml的纤维蛋白原以体积比1:3混合形成凝胶载体。

步骤(3)中，将种子细胞、磷酸钙和细胞因子加入到可注射性凝胶载体中，再灌装入1号注射器中；将凝血酶和氯化钙以体积比2:1混合装入2号注射器中，其中，凝血酶浓度为20-1000u/ml，氯化钙浓度为0.2％-3％；将1号注射器和2号注射器通过医用三通连接，将1号注射器中的混合物通过医用三通推注到2号注射器中进行混合，再将2号注射器中的混合物通过医用三通推注到1号注射器中，实现混合固化与灌装，获得可注射型组织工程骨修复材料。2号注射器中凝血酶和氯化钙作为固化剂，可以将海藻酸钠和纤维蛋白原形成的凝胶载体变成固态胶，从而锁定种子细胞、磷酸钙和细胞因子，否则种子细胞、磷酸钙和细胞因子在液态凝胶载体里会沉淀，无法注射。

细胞因子为bmp-2、bmp-6和tgfβ3组合形成，其中，bmp-2浓度为1-200ug/ml，bmp-6浓度为1-200ug/ml，tgfβ3浓度为1-200ug/ml。通过实验结果证明，bmp-2、bmp-6和tgfβ3组合而成的细胞因子更利于成骨。优选的，bmp-2浓度为20μg/ml，bmp-6浓度为20μg/ml，tgfβ3浓度为20μg/ml。

本发明通过实验结果证明当种子细胞的细胞密度超过1×10⁷/ml时，在相同细胞密度的情况下，细胞微球在凝胶载体中的存活率远超过单个细胞在凝胶载体中的存活率，证明了细胞微球具有强大的耐缺氧能力，当细胞密度达到1×10⁸/ml时，细胞微球仍可以存活，因而说明以细胞微球作为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料能够在提高细胞接种密度的同时，保证细胞存活率，从而提高骨形成效率；且通过实验结果证明以10⁸数量级的骨髓基质干细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料的成骨效果优于以10⁷数量级的单个细胞为种子细胞的成骨效果。

本发明使用骨髓基质干细胞微球取代单个细胞作为种子细胞，克服了单个细胞接种密度低和耐缺氧能力差的问题，从而提高了可注射型组织工程骨修复材料的成骨能力。

附图说明

图1为实验1得到的细胞微球；

图2为实验2得到的细胞微球；

图3为实验3得到的细胞微球；

图4为实验4得到的细胞微球；

图5为单个细胞与细胞微球在凝胶载体中的存活率对比图；

图6为种子细胞为单个细胞的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的x光片图；

图7为种子细胞为细胞微球的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的x光片图；

图8为分别以单个细胞与细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料成骨的灰度值；

图9为种子细胞为单个细胞的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图；

图10为种子细胞为细胞微球的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图；

图11为分别以单个细胞与细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨的骨面积对比图；

图12是分别具有不同细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨的骨面积对比图；

图13为含有a细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图；

图14为含有b细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图；

图15为含有c细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图；

图16为含有d细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图；

图17为含有e细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图；

图18为分别加有a、b、c、d、e细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨的骨面积对比图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。

实施例一，骨髓基质干细胞的培养和细胞微球的构建

大鼠骨髓基质干细胞的培养：取6周龄健康sd大鼠，处死后取双下肢骨，无菌条件下冲出骨髓，培养液重悬后接种于培养瓶内，置于co2培养箱中培养，每隔三天换液一次，待原代细胞长满瓶底后，消化传代。

细胞微球的构建：通过旋转培养法获得细胞微球，取细胞密度为(2-5)×10⁵/ml的骨髓基质干细胞悬液置于旋转培养瓶中，置于磁力搅拌器上旋转培养16-24小时，转速为25-80转/分钟，得到细胞密度为10⁸数量级的骨髓基质干细胞微球。但不仅限于此，也可以通过悬滴法进行培养。

实验1，将细胞密度为2×10⁵/ml的骨髓基质干细胞悬液置于旋转培养瓶中，旋转培养24小时，转速为20转/分钟，之后收集得到的细胞微球，参见图1；

实验2，将细胞密度为4×10⁵/ml的骨髓基质干细胞悬液置于旋转培养瓶中，旋转培养48小时，转速为40转/分钟，之后收集得到的细胞微球，参见图2；

实验3，将细胞密度为6×10⁵/ml的骨髓基质干细胞悬液置于旋转培养瓶中，旋转培养72小时，转速为60转/分钟，之后收集得到的细胞微球，参见图3；

实验4，将细胞密度为6×10⁵/ml的骨髓基质干细胞悬液置于旋转培养瓶中，旋转培养96小时，转速为80转/分钟，之后收集得到的细胞微球，参见图4；

将实验1、实验2、实验3、实验4培养得到的细胞微球，放在倒置显微镜下进行观察，参见图1、图2、图3和图4，图1为实验1得到的细胞微球，图2为实验2得到的细胞微球，图3为实验3得到的细胞微球，图4为实验4得到的细胞微球，经过对实验1、实验2、实验3、实验4培养得到的细胞微球进行观察，实验3得到的细胞微球的成球率最高，单个细胞的比率最低，因此，细胞微球的最适构建条件是细胞密度为6×10⁵/ml的骨髓基质干细胞、旋转培养时间72小时和转速60转/分钟。

实施例二，可注射性凝胶载体的构建

将海藻酸钠和纤维蛋白原以体积比1:3进行混合以形成凝胶载体，其中，海藻酸钠的质量浓度为0.1％-4％，纤维蛋白原的浓度为5-30mg/ml。

优选的，将海藻酸钠与纤维蛋白原经伽马射线灭菌后，制备成质量浓度为1％的海藻酸钠和浓度为20mg/ml的纤维蛋白原，之后1％海藻酸钠和20mg/ml纤维蛋白原以体积比1:3进行混合形成凝胶载体。

实施例三，不同细胞密度的单个细胞与细胞微球在凝胶载体中的存活率

将细胞密度分别为0.5×10⁷/ml、1×10⁷/ml、2×10⁷/ml、5×10⁷/ml、10×10⁷/ml和20×10⁷/ml的单个细胞和细胞微球分别接种于凝胶载体中，凝胶载体的体积为0.5ml，置于6孔细胞培养板中，添加含有10％胎牛血清的dmem培养液10ml，每3天更换培养液，培养14天，14天后打碎凝胶并收集细胞，使用台盼蓝拒染法检测细胞存活率。检测结果参见图5，图5为单个细胞与细胞微球在凝胶载体中的存活率对比图，在相同细胞密度的情况下，当细胞密度超过1×10⁷/ml时，细胞微球在凝胶载体中的存活率远超过单个细胞，证明了细胞微球具有强大的耐缺氧能力，当细胞密度达到1×10⁸/ml时，骨髓基质干细胞微球仍可以存活，但单个细胞的存活率很低，几乎无法存活，说明以细胞微球作为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料能够在提高细胞接种密度的同时，保证了细胞存活率，从而提高了骨形成效率。

实施例四，种子细胞与凝胶载体的复合

将种子细胞、粒径范围1-200um为β-磷酸三钙和细胞因子加入到可注射性凝胶载体中，再灌装入1号注射器中，其中，种子细胞的细胞密度为2×10⁸/ml，凝胶载体的量为150ul，细胞因子的量为150ul；将浓度为100u/ml的凝血酶和浓度为2％的氯化钙以体积比2:1混合装入2号注射器中，凝血酶和氯化钙体积总和为100ul；将1号注射器和2号注射器通过医用三通连接，将1注射器中的混合物通过医用三通推注到2注射器中进行混合，再将2注射器中的混合物通过医用三通推注到1注射器中，实现混合固化与灌装，获得可注射型组织工程骨修复材料。

实施例五，动物植入实验

取8周龄balb/cnude免疫缺陷小鼠，经6％水合氯醛麻醉后，分别将具有细胞密度为2×10⁷/ml的单个细胞的可注射型组织工程骨修复材料和具有细胞密度为2×10⁸/ml的细胞微球的可注射型组织工程骨修复材料植入到不同小鼠皮下，6周后拍x光片并取材，进行he和masson染色，观察骨组织形态。参见图6、图7、图8、图9、图10和图11，图6为种子细胞为单个细胞的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的x光片图，图7为种子细胞为细胞微球的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的x光片图，图8为分别以单个细胞与细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料成骨情况的灰度值，图9为种子细胞为单个细胞的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图，图10为种子细胞为细胞微球的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图，图11为分别以单个细胞与细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料成骨情况的骨面积对比图。在x光片下，以细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料形成的骨组织在x光片下骨密度更高，以细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料成骨的灰度值大于40，而以单个细胞为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料成骨的灰度值小于20；对染色后的材料进行观察，以细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料形成的新生骨小梁明显多于以单个细胞为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料形成的新生骨小梁，以细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料成骨的骨面积接近40％，而以单个细胞为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料成骨的骨面积小于20％；因此，以细胞微球为种子细胞的可注射型组织工程骨修复材料的成骨效果更好。

实施例六，不同细胞因子组合的成骨效果鉴定

将具有不同剂量的细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料分别植入到不同小鼠皮下，6周后取材，进行he和masson染色，观察骨组织形态。参见图12，图12是分别具有不同细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料的成骨的骨面积对比图，在相同剂量下，以bmp-2、bmp-6和tgfβ3组合作为细胞因子的成骨面积更高；bmp-2、bmp-6和tgfβ3组合的细胞因子的剂量为5μg/ml时，成骨效应最低，bmp-2、bmp-6和tgfβ3组合的细胞因子的剂量为20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml时，成骨效应接近，因此bmp-2、bmp-6和tgfβ3组合的细胞因子的加入剂量优选为20μg/ml。

a：选用浓度为20mg/ml的bmp-2、浓度为20mg/ml的bmp-6和浓度为20mg/ml的tgfβ3组合作为细胞因子；

b：选用浓度为30mg/ml的bmp-2和浓度为30mg/ml的tgfβ3组合作为细胞因子；

c：选用浓度为30mg/ml的bmp-6和浓度为30mg/ml的tgfβ3组合作为细胞因子；

d：选用浓度为30mg/ml的bmp-2和浓度为30mg/ml的bmp-6组合作为细胞因子；

e：选用浓度为60mg/ml的bmp-2作为细胞因子。

将分别含有a、b、c、d、e细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料分别植入到不同小鼠皮下，6周后取材，进行he和masson染色，观察骨组织形态。参见图13、图14、图15、图16、图17和图18，图13为含有a细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图，图14为含有b细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图，图15为含有c细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图，图16为含有d细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图，图17为含有e细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料植入裸鼠体内后成骨情况的masson染色图，图18为分别加有a、b、c、d、e细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料成骨情况的骨面积对比图。对染色后的材料进行观察，含有a细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料的新生骨小梁最多，骨面积接近40％，而含有b细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料成骨的骨面积接近30％，含有c细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料成骨的骨面积接近20％，含有d细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料成骨的骨面积接近20％，含有e细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料成骨的骨面积接近10％，因此，加有a细胞因子的可注射型组织工程骨修复材料的成骨效果最好，因此浓度为20mg/ml的bmp-2、浓度为20mg/ml的bmp-6和浓度为20mg/ml的tgfβ3组合作为细胞因子相较与其他四种细胞因子组合更利于成骨。

本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。