一种超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法与流程

本发明属于植物天然成分提取技术领域。具体地，涉及一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法。

背景技术：

紫果西番莲(passifloraedulissims)是西番莲科西番莲属藤本植物，在我国云南、广东、广西等省份大规模种植，其果汁香味怡人，风味独特，在饮料市场上占有重要地位。西番莲果在提取果汁后，产生占整果质量11％左右的种籽，种籽含油量约为20％，目前国内外对西番莲种籽利用的研究主要集中于籽油的开发。紫果西番莲籽有效成分的研究表明，其含有蛋白质、不饱和脂肪酸、黄酮等有效成分。黄酮类化合物具有抗菌、抗氧化自由基、抗癌等药理活性，对人类疾病治疗有很大的辅助作用。西番莲种籽油粕中含有大量的黄酮，然而针对提取籽油后产生的副产物—油粕，研究和利用鲜见报道，因此选择一种提取效率高，有效成分损失少的提取工艺，是本发明的关键技术之一。

中国专利文献cn104606262a公开了一种从西番莲果皮提取总黄酮的方法，将果皮粉末加入乙醇溶液浸泡后进行超声波辅助提取，抽滤得到的滤液经蒸发得到粗黄酮颗粒，加入蒸馏水对粗黄酮颗粒进行溶解，经过滤蒸发得到黄酮颗粒。其超声时间较长，且黄酮类化合物难溶于水使溶解不完全，导致黄酮提取含量较低。中国专利文献cn102225080a公开了一种乙醇-微波浸泡浸提法提取百香果叶黄酮类化合物的方法，百香果干叶粉末中加入乙醇溶液升温浸提0.5h后进行微波提取，之后继续进行恒温水浴浸提，浸提结束后经过滤，真空浓缩得到浓缩液。其料液比的比值过大，使原料和溶剂两相间黄酮的浓度差过小，传质推动力过低，不利于黄酮溶出，导致黄酮提取含量较低。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法。该方法以西番莲种籽油粕为原料，提取其中的天然活性黄酮物质，延伸西番莲加工产业链。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法，包括如下步骤：

s1.将西番莲种籽于55～70℃干燥至恒重，粉碎，过孔径为0.250～0.425mm的筛，得到种籽粉末；

s2.取所述种籽粉末并加入石油醚，控制种籽粉末与石油醚的质量体积比6：42～58，85～95℃冷凝回流70～85min进行脱脂，蒸发浓缩回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

s3.向上述种籽油粕中加入乙醇-水溶液，于75～85℃恒温水浴条件下进行超声波提取，得到混合液；

s4.将上述混合液进行微波提取，过滤，得到总黄酮提取液。

本发明集成利用超声波提取技术的振动作用和空化效应，微波提取技术的破壁和加热作用，使提取效率大大增加，同时具有提取工艺简便，提取溶剂无污染的优点。本发明得到的总黄酮提取含量为35.57～122.61mg/g。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，所述种籽油粕的装载量为1.0～2.0g。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，所述种籽油粕的装载量为1.0g。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为50％～90％。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为80％。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，所述种籽油粕、乙醇-水溶液的料液比为1：20～1：60g/ml。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，所述种籽油粕、乙醇-水溶液的料液比为1：50g/ml。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，超声时间为10～60min；超声功率为200～500w。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，超声时间为50min，超声功率为300w。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s3中，超声波提取次数为2～3次。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s4中，微波功率为160～480w；微波时间为30～150s。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s4中，微波功率为320w，微波时间为90s。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s4中，所述过滤为微孔滤膜或减压抽滤，所述减压抽滤的真空度为-0.08～-0.1mpa；得到抽滤减压粗提液后用蒸馏水洗涤种籽油粕残渣2～3次，合并滤液。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s4中，所述减压抽滤的真空度为-0.09～-0.1mpa。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s1中，西番莲种籽的干燥温度为60～65℃。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s1中，粉碎后过孔径0.300～0.355mm的筛。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤s2中，控制种籽粉末与石油醚的质量体积比6：50～55。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，种籽油粕、乙醇-水溶液的料液比为1：56.02g/ml，乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为73.78％，超声时间为50min，超声功率为300w，微波功率为160w，微波时间为90s。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述方法还包括对步骤s4得到的总黄酮提取液进行纯化，所述纯化步骤为：将步骤s4得到的总黄酮提取液浓缩至无乙醇味，将浸膏冷冻干燥为粉末，采用ab-8大孔树脂湿法装柱进行分离纯化，其工艺条件为：上样液总黄酮浓度为1.0～2.0mg/ml，调节上样溶液ph为3～3.5，以7～9r/min流速上样，以树脂湿重：上样量为25mg：110～120ml的比例配制树脂与总黄酮的吸附液；上样结束后用90～100ml蒸馏水进行水洗除杂，之后用90～100ml的70％～75％乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为10～12r/min。

本发明中，总黄酮回收率为86～90％，纯化后的总黄酮纯度达到72～85％。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，以树脂湿重：上样量为25mg：115～120ml的比例配制树脂与总黄酮的吸附液。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述冷冻干燥为真空冷冻干燥。所述冷冻干燥为将浸膏于-80～-60℃下真空冷冻干燥12～24h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)从西番莲种籽油粕中提取黄酮，实现其药用价值，可将西番莲利用价值最大化。

(2)本发明集成利用超声波提取技术的振动作用和空化效应，微波提取技术的破壁和加热作用，使提取效率大大增加，同时具有提取工艺简便，提取溶剂无污染的优点。

(3)本发明得到的总黄酮提取含量为35.57～122.61mg/g，总黄酮回收率为86～90％，纯化后的总黄酮纯度达到72～85％，黄酮提取含量较高。

附图说明

图1为步骤s3油粕粉末、乙醇-水溶液的料液比对黄酮提取含量的影响。

图2为步骤s3乙醇-水溶液中乙醇体积分数对黄酮提取含量的影响。

图3为步骤s3超声时间对黄酮提取含量的影响。

图4为步骤s3超声功率对黄酮提取含量的影响。

图5为步骤s4微波功率对黄酮提取含量的影响。

图6为步骤s4微波时间对黄酮提取含量的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法

(1)粉碎：将西番莲种籽于55℃干燥至恒重，用粉碎机将烘干的西番莲种籽粉碎，过0.250mm筛，得到种籽粉末；

(2)脱脂：称取6.0g种籽粉末放入滤纸筒，在石英杯中加入石油醚42ml，95℃冷凝回流70min进行脱脂，旋转蒸发回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

(3)超声波提取：称取上述种籽油粕1.0g，按料液比1：20g/ml加入乙醇体积分数为50％的乙醇-水溶液，设置超声功率200w，于80℃恒温水浴条件下提取60min，得到混合液；

(4)微波提取：将上述混合液置于微波处理器中，设置微波功率160w提取150s，采用微孔滤膜过滤后得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为57.49mg/g。

实施例2一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法

(1)粉碎：将西番莲种籽于70℃干燥至恒重，用粉碎机将烘干的西番莲种籽粉碎，过0.425mm筛，得到种籽粉末；

(2)脱脂：称取6.0g种籽粉末放入滤纸筒，在石英杯中加入石油醚58ml，85℃冷凝回流85min进行脱脂，旋转蒸发回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

(3)超声波提取：称取上述种籽油粕1.0g，按料液比1：60g/ml加入乙醇体积分数为90％的乙醇溶液，设置超声功率500w，于80℃恒温水浴条件下提取10min，得到混合液；

(4)微波提取：将上述混合液置于微波处理器中，设置微波功率480w提取30s，采用微孔滤膜过滤后得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为84.90mg/g。

实施例3一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法

(1)粉碎：将西番莲种籽于60℃干燥至恒重，用粉碎机将烘干的西番莲种籽油粕粉碎，过0.300mm筛，得到种籽粉末；

(2)脱脂：称取6.0g种籽粉末放入滤纸筒，在石英杯中加入石油醚50ml，85℃冷凝回流70min进行脱脂，旋转蒸发回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

(3)超声波提取：称取上述种籽油粕1.0g，按料液比1：50g/ml加入乙醇体积分数为80％的乙醇溶液，设置超声功率300w，在80℃恒温水浴条件下提取30min，超声波提取次数为2次，得到混合液；

(4)微波提取：将上述混合液置于微波处理器中，设置微波功率320w提取90s，采用微孔滤膜过滤得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为110.34mg/g。

实施例4一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法

(1)粉碎：将西番莲种籽于65℃干燥至恒重，用粉碎机将烘干的西番莲种籽粉碎，过0.355mm筛，得到种籽粉末；

(2)脱脂：称取6.0g种籽粉末放入滤纸筒，在石英杯中加入石油醚55ml，85℃冷凝回流70min进行脱脂，旋转蒸发回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

(3)超声波提取：称取上述种籽油粕1.0g，按料液比1：56.02g/ml加入乙醇体积分数为73.78％的乙醇溶液，设置超声功率300w，在80℃恒温水浴条件下提取50min，超声波提取次数为3次，得到混合液；

(4)微波提取：将上述混合液置于微波处理器中，设置微波功率160w提取90s，采用微孔滤膜过滤后得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为117.53mg/g。

实施例5一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法

按照实施例4的方法进行提取西番莲种籽油粕总黄酮，其中前三步与实施例4相同，第(4)步将前三步所得混合液置于微波处理器中，设置微波功率160w提取90s，真空度-0.09～-0.1mpa条件下进行减压抽滤，得到抽滤减压粗提液后用蒸馏水洗涤种籽油粕残渣2～3次，合并滤液得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为120.36mg/g。

实施例6一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法

(1)粉碎：将西番莲种籽于60℃干燥至恒重，用粉碎机将烘干的西番莲种籽粉碎，过0.425mm筛，得到种籽粉末；

(2)脱脂：称取6.0g种籽粉末放入滤纸筒，在石英杯中加入石油醚50ml，85℃冷凝回流70min进行脱脂，旋转蒸发回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

(3)超声波提取：称取上述种籽油粕1.0g，按料液比1：56.02g/ml加入乙醇体积分数为73.78％的乙醇溶液，设置超声功率300w，在80℃恒温水浴条件下提取50min，超声波提取次数3次，得到混合液；

(4)微波提取：将上述混合液置于微波处理器中，设置微波功率160w提取90s，真空度-0.08～-0.09mpa条件下进行减压抽滤，得到抽滤减压粗提液后用蒸馏水洗涤种籽油粕残渣2～3次，合并滤液得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为120.89mg/g；

(5)纯化：将步骤s4得到的总黄酮提取液浓缩至无乙醇味，将浸膏于-80～-60℃下真空冷冻干燥12～24h为粉末；采用ab-8大孔树脂湿法装柱，配制上样液总黄酮浓度为1.0mg/ml，调节上样溶液ph为3，以9r/min流速上样，以树脂湿重：上样量为25mg：100ml的比例配制树脂与总黄酮的吸附液；上样结束后用90ml蒸馏水进行水洗除杂，之后用90ml70％乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为10r/min。总黄酮回收率为88.12％，纯化后的总黄酮纯度为70.14％。

实施例7一种采用超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法

(1)粉碎：将西番莲种籽于60℃干燥至恒重，用粉碎机将烘干的西番莲种籽粉碎，过0.425mm筛，得到种籽粉末；

(2)脱脂：称取6.0g种籽粉末放入滤纸筒，在石英杯中加入石油醚55ml，85℃冷凝回流70min进行脱脂，旋转蒸发回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

(3)超声波提取：称取上述种籽油粕1.0g，按料液比1：56.02g/ml加入乙醇体积分数为73.78％的乙醇溶液，设置超声功率300w，在80℃恒温水浴条件下提取50min，超声波提取次数3次，得到混合液；

(4)微波提取：将上述混合液置于微波处理器中，设置微波功率160w提取90s，真空度-0.09～-0.10mpa条件下进行减压抽滤，得到抽滤减压粗提液后用蒸馏水洗涤种籽油粕残渣2～3次，合并滤液得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为122.61mg/g；

(5)纯化：将步骤s4得到的总黄酮提取液浓缩至无乙醇味，将浸膏冷冻干燥为粉末；ab-8大孔树脂湿法装柱，配制上样液总黄酮浓度为2.0mg/ml，调节上样溶液ph为3.5，以7r/min流速上样，以树脂湿重：上样量为25mg：120ml的比例配制树脂与总黄酮的吸附液；上样结束后用100ml蒸馏水进行水洗除杂，之后用100ml70％乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为12r/min。总黄酮回收率为90.32％，纯化后的总黄酮纯度为75.47％。

对比例1

(1)粉碎：将西番莲种籽于60℃干燥至恒重，用粉碎机将烘干的西番莲种籽粉碎，过0.425mm筛，得到种籽粉末；

(2)脱脂：称取6.0g种籽粉末放入滤纸筒，在石英杯中加入石油醚50ml，85℃冷凝回流70min进行脱脂，旋转蒸发回收石油醚，收集脱脂后的种籽油粕；

(3)超声波提取：称取上述种籽油粕1.0g，按料液比1：56.02g/ml加入乙醇体积分数为73.78％的乙醇溶液，设置超声功率300w，在80℃恒温水浴条件下提取50min，超声波提取次数3次，得到混合液；

(4)微波提取：将上述混合液置于微波处理器中，设置微波功率160w提取90s，真空度-0.08～-0.09mpa条件下进行减压抽滤，得到抽滤减压粗提液后用蒸馏水洗涤种籽油粕残渣2～3次，合并滤液得到总黄酮提取液，其总黄酮提取含量为121.63mg/g。

(5)纯化：将步骤s4得到的总黄酮提取液浓缩至无乙醇味，将浸膏冷冻干燥为粉末；采用ab-8大孔树脂湿法装柱，配制上样液总黄酮浓度为1.0mg/ml，调节上样溶液ph为6，以9r/min流速上样，以树脂湿重：上样量为25mg：110ml的比例配制树脂与总黄酮的吸附液；上样结束后用90ml蒸馏水进行水洗除杂，之后用90ml70％乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为8r/min。总黄酮回收率为74.61％，纯化后的总黄酮纯度为66.19％。

实施例8提取工艺优化

1、单因素实验

(1)方法

根据实施例1的方法提取西番莲种籽油粕总黄酮，选取乙醇体积分数为50～90％、料液比为1：20～60g/ml、超声时间为10～60min、超声功率200～500w、微波功率160～480w、微波功率30～150s作为影响因素，考察各因素对黄酮提取含量的影响，每个试验处理3次重复。

(2)结果

1)考察料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/ml)对黄酮提取含量的影响，结果如图1所示，在料液比1∶20～50(g/ml)范围内，随着料液比的比值下降，黄酮提取含量明显增加，料液比为1∶50(g/ml)时黄酮提取含量较佳。

2)考察乙醇体积分数50％、60％、70％、80％、90％对黄酮提取含量的影响，结果如图2所示，在供试范围内，黄酮提取含量随乙醇体积分数增大呈现先增加后下降的趋势，提取率在乙醇体积分数为80％时达到峰值；当乙醇体积分数超过80％时，黄酮提取含量反而下降。

3)考察超声时间10、20、30、40、50、60min对黄酮提取含量的影响，结果如图3所示，黄酮提取含量随着超声时间的延长而增大，当超声时间大于30min时，提取率增加缓慢，因为有效成分在超声处理30min后已大部分溶出，继续延长时间，对提升黄酮提取含量影响微弱。故选择超声时间30min为宜。

4)考察超声功率200、250、300、350、400、450、500w对黄酮提取含量的影响，如图4所示，超声功率在200～300w范围内，随着超声功率增大，黄酮提取含量逐渐升高，当超声功率为300w时，提取量达到峰值，之后增大超声功率，黄酮提取含量下降。

5)考察微波功率160、240、320、400、480w对黄酮提取含量的影响，结果如图5所示，随着微波功率的增大，黄酮提取含量呈先升高后降低的趋势，在微波功率为160w时，提取率达到最大。

6)考察微波时间30、60、90、120、150s对黄酮提取含量的影响，结果如图6所示，随着微波时间的延长，类黄酮提取含量逐渐增大，当微波时间为90s时达到最大值，进一步延长微波时间，提取量反而下降。

2、响应面组合试验

(1)方法

以黄酮提取含量为响应值，从上述单因素试验中，选取对黄酮提取含量影响更为显著的乙醇体积分数(a)、料液比(b)、超声时间(c)、微波功率(d)为自变量，建立四因素三水平中心组合实验设计。

响应面实验方案及结果见表1和表2。

表1响应面试验自变量因素水平表

表2响应面设计方案及实验结果

通过designexpert8.0软件分析得出最佳工艺，其中料液比为1：56.02g/ml，乙醇体积分数为73.78％，超声时间为50min，微波功率为160w。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。