一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片及其制备方法和使用方法与流程

本发明属于生物医药诊断技术领域，涉及一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片及其制备方法和使用方法。

背景技术：

即时诊断是在采样现场即刻进行分析，省去样本在验室检验时复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法，因其快速、简便的优势在医学健康领域引起广泛的关注。检测样本采集是即时检测至关重要的第一步，检测样本采集的质量决定了检测准确性和灵敏度。目前临床检测中用到的体液样本有血液、尿液、唾液和汗液。血液由于富含生物信息，相对采集容易，但采集血液会对肌体造成损伤，并有疼痛感，多次反复采集容易发生伤口感染，对待检测者造成心理负担，不利于长期、频繁检测；其他体液由于其复杂的产生机理，只适用于极少数生化指标的检测。皮肤间质液(interstitialfluid,isf)通过血液经毛细管过滤形成，其组成与血浆相似，已被证明含有许多用于代谢系统和皮肤病学分析的生物标记物，并且其浓度和组分随着生理变化而变化，有可能成为血液代替样本。

皮肤间质液的采样方法较为复杂，目前临床上常用植入皮下的吸液芯、吸疱技术和微量插样管插入皮下采取皮肤间质液，这些采样手段常常会引起患者不适，并且存在潜在感染风险。最近，有研究者使用微针贴片来提取皮肤间质液。微针贴片是一系列微米级的微针，因为无痛、无感染风险和易于使用的特性最初被用来透皮传输药物和疫苗。提取皮肤间质液最常用的微针贴片由硅、玻璃或者金属制成的实心或空心的微针阵列构成，这些类型的微针贴片的关键是在皮肤上产生小孔或通路，通过毛细力或使用负压采集皮肤间质液，这一发明极大促进了皮肤间质液的采样效率。但它还存在以下缺点需要解决：首先，这些微针贴片通常需要额外装置提供负压以获得足够量的间质液；其次，由硅或玻璃制成的微针贴片由于其脆性，在取样过程中可能会在皮肤内断裂，给患者带来潜在的风险；并且使用后会尖锐的针头废弃物可能会造成危害。

水凝胶这种具有化学或物理交联结构、可吸收大量水分的三维高分子材料，已被作为新型微针材料。水凝胶微针有大量的微孔和亲水基团，插入皮下后能迅速溶胀，吸取富含生物分子的皮肤间质液，无需额外辅助装置。例如，聚乙烯醇(polyvinylalcohol,pva)水凝胶微针在干燥时为坚硬的玻璃态，能轻松刺入皮肤，刺入皮下吸取液体之后由玻璃态变为柔软的凝胶态，避免损伤皮下细胞，消除硬质微针在皮下折断的隐患，不会产生明显的疼痛，在使用时对组织造成的损害最小，并且在处理后对环境的威胁最小，是一种理想的采取皮肤间质液进行即时检测的方法。另外，在pva中添加适当比例的其他高分子溶液能大大增加水凝胶微针的溶胀能力，在几分钟内吸取足够的皮肤间质液进行检测。利用水凝胶微针将皮肤间质液提取于体外检测是较为简单、准确和生物相容性好的方法。

但水凝胶微针提取皮肤间质液仍然面临着快速提取与高效回收的问题。针对水凝胶微针提取皮肤间质液的问题，有研究者通过合成高亲水性的水凝胶，制备的可快速有效地提取皮肤间质液，以便及时进行代谢分析。然而，如何将提取到的皮肤间质液从水凝胶微针贴片上有效回收，这一挑战目前仍没有很好的解决方法。虽然利用离心机高速旋转和施加压力的方法能从微针贴片中回收部分皮肤间质液，但这些方法均须使用实验室大型仪器，限制了微针贴片的即时诊断属性，使其无法实现社区、家庭、偏远地区等的即时应用。因此，亟待开发一种无需依赖大型设备的快速提取、高效回收皮肤间质液的微针贴片。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片及其制备方法和使用方法，该水凝胶微针贴片配方组成合理，制备方法简单，使用便捷，对设备要求低，易于操作，能够快速、高效的回收皮肤间质液。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片的制备方法，包括以下步骤：

1)按聚乙烯醇：高亲水性聚合物溶液＝1:(0.2～1)的体积比，将聚乙烯醇和高亲水性聚合物溶液混合，得到混合溶液；

2)将混合溶液注入微针模具中，反复冻融形成聚乙烯醇交联冰晶，干燥后脱模制得水凝胶微针贴片。

优选地，所述聚乙烯醇分子量为27000-186000，质量浓度为5％～50％。

优选地，高亲水性聚合物为多糖、多肽、聚乙烯、醇类、丙烯酸及丙烯酸衍生物中的一种或几种。

优选地，所述微针模具的高度为600～1500μm，底面直径为200～500μm。

优选地，步骤2)中，注入模具采用离心法和/或抽真空法。

优选地，步骤2)中，反复冻融形成聚乙烯醇交联冰晶的具体操作为：

将充满混合溶液的微针模具置于0摄氏度以下，冷冻数小时直至混合溶液形成冰晶交联，然后置于能够融解冰晶的温度中直至冰晶溶解，反复冷冻、融解数次，直至在常温时呈凝胶状态。

本发明公开了采用上述的制备方法制得的用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片，该水凝胶微针贴片能够在合适的温度下溶解在缓冲液中。

本发明还公开了上述用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片的使用方法，将提取有皮肤间质液的水凝胶微针贴片浸入缓冲液中，升温至适合温度使所述水凝胶微针贴片的交联冰晶溶解于缓冲液中，释放出目标物。

优选地，缓冲液为去离子水、生理盐水、酸碱缓冲液和电解质溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将聚乙烯醇和高亲水性聚合物以适合的比例混合，利用聚乙烯醇反复冻融交联形成微针，同时适当比例的高亲水性聚合物溶液能够大大增加水凝胶微针的溶胀能力，使其只需要在几分钟内就能够吸取足够的皮肤间质液供检测使用。同时，由于聚乙烯醇具备良好的反复冻融和可逆交联特性，本发明的水凝胶微针贴片在进行皮肤间质液采集时，创新地采用温和升温的方式，即通过升温处理使聚乙烯醇在升温时解聚交联点(溶解交联冰晶)，从而释放出待测目标物。因此，本发明无需使用任何大型实验设备就能够实现快速、高效回收皮肤间质液。

附图说明

图1为本发明的微针阴模具照片；

图2为本发明制得的水凝胶微针贴片照片；

图3为采用实施例1制备的水凝胶微针贴片采集皮肤间质液后检测目标物葡萄糖的浓度相关性曲线；

图4为采用实施例2制备的水凝胶微针贴片采集皮肤间质液后检测目标物氯离子的浓度相关性曲线；

图5为采用实施例3制备的水凝胶微针贴片采集皮肤间质液后检测目标物乳酸的浓度相关性曲线；

图6为采用实施例4制备的水凝胶微针贴片采集皮肤间质液后检测目标物血清蛋白的浓度相关性曲线。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本发明公开的用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片的制备方法，包括：

1)将聚乙烯醇(pva)与另一种高亲水性聚合物溶液混合；

2)将步骤1)的混合溶液浇注至微针模具中，反复冻融形成pva交联冰晶，干燥后脱模形成水凝胶微针贴片。

优选地，步骤1)中所涉及的聚乙烯醇分子量为27,000-186,000，浓度为5％-50％；高亲水性聚合物溶液为天然和合成两大类：天然的高亲水性聚合物包括多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸，壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚l-赖氨酸、聚l-谷胺酸等)，合成的高亲水性聚合物包括聚氧化乙烯、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚n-聚代丙烯酰胺等)其中一种或多种高分子组合；

所述的混合方法为：搅拌、超声、捏和、射流混合、管道混合；

所述的混合比例为：pva：高分子溶液＝1:0.2至1:1中的任何比例。

优选地，步骤2)中，微针模具形状为：锥型、柱型，高度为600微米至1500微米，底面直径为200微米-500微米；

所述浇筑方法为：离心、抽真空或两者结合；

所述反复冻融的方法为：将充满混合溶液的模具置于可令其形成冰晶的温度中(通常低于0摄氏度)，冷冻数小时直至溶液被形成的冰晶交联，后置于能溶解冰晶的环境中至冰晶溶解，反复多次，直至在常温时呈凝胶状态；

所述的干燥方法为：鼓风干燥箱干燥、烘箱干燥、真空干燥、常温干燥。

制得水凝胶微针贴片后，采用其提取皮肤间质液后，用升温的方法使微针的交联冰晶溶解在缓冲溶液中，释放目标物。

升温方法包括但不限于：明火加热、热域加热、仪器加热；

加热的温度为：高于室温的任何能将微针针尖溶解且不破坏目标物性质的温度；

所述缓冲溶液与待检测目标物有关，包括但不限于去离子水、生理盐水，酸碱缓冲液和电解质溶液。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细描述：

实施例1

一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片的制备方法，包括：

1)由聚乙烯醇(分子量27000，质量分数15％)和壳聚糖溶液按1:0.25的体积比混合而成，制得混合溶液；

2)将混合溶液浇注入由聚二甲基硅氧烷制备而成的阴模模具(如图1所示)中，抽真空使混合溶液液进入到模具孔内，反复冻融使水凝胶交联形成微针，经鼓风干燥箱干燥后，制得水凝胶微针贴片，如图2所示。

使用时，将制得的水凝胶微针贴片刺入皮肤中，刺入皮肤后按压1-10分钟。取出后加入少量磷酸缓冲液(ph＝6.8)，水浴加热使微针溶解释放皮肤间质液中目标物葡萄糖，取出溶液进行检测，回收率为70％，检出限为0.02mm。结果如图3所示，从图3中可以看出，与真实葡糖糖浓度相关性r²＝0.9837。

实施例2

一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片的制备方法，包括：

1)由聚乙烯醇(分子量61000，质量分数为10％)和透明质酸溶液按1:1的体积比混合而成，制得混合溶液；

2)将混合溶液灌注入阴模中，离心使混合溶液进入到模具孔内，反复冻融使水凝胶交联，鼓风干燥箱干燥，制得水凝胶微针贴片。

使用时，将制得的水凝胶微针贴片刺入皮肤。刺入皮肤后按压1-10分钟。取出微针后加入少量磷酸缓冲液(ph＝7.2)，双手握紧试管壁，用体温加热至微针的针尖完全溶解在缓冲液中释放皮肤间质液中目标物氯离子，取出溶液进行检测。

结果如图4所示，回收率为65.8％，检出限1mm，真实氯离子浓度相关性r²＝0.9912。

实施例3

一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片的制备方法，包括：

1)由聚乙烯醇(分子量27000，浓度15％)和聚乙二醇溶液按1:0.5的体积比混合而成，制得混合溶液；

2)将混合溶液灌注入阴模中，离心使混合溶液进入到模具孔内，反复冻融使水凝胶交联，鼓风干燥箱干燥，制得水凝胶微针贴片。

使用时，将制得的水凝胶微针贴片刺入皮肤。刺入皮肤后按压1-10分钟。取出微针后加入少量去离子水，水浴加热至55℃使微针溶解释放皮肤间质液中目标物乳酸，取出溶液进行检测。结果如图5所示，回收率为76.9％，检出限5mm，真实乳酸浓度相关性r²＝0.9822。

实施例4

一种用于采集皮肤间质液的水凝胶微针贴片的制备方法，包括：

1)由聚乙烯醇(分子量27000，浓度15％)和聚丙烯酰胺溶液按1:0.2的体积比混合而成，制得混合溶液；

2)将混合溶液灌注入阴模中，离心使混合溶液进入到模具孔内，反复冻融使水凝胶交联，鼓风干燥箱干燥，制得水凝胶微针贴片。

使用时，将制得的水凝胶微针贴片刺入含牛血清蛋白的模拟皮肤。刺入皮肤后按压1-10分钟。取出微针后加入少量去离子水，水浴加热至60℃使微针溶解释放皮肤间质液中目标物血清蛋白，取出溶液进行检测。结果如图6所示，回收率为66.9％，检出限5mg/ml，真实血清蛋白浓度相关性r²＝0.9853。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。