醋酸棉酚和化疗药的联合用药物的制作方法

本发明涉及用于治疗肿瘤的联合用药物，具体涉及醋酸棉酚(gossypolaceticacid，gaa)和化疗药的联合用药。

背景技术：

癌症是一类引起人类死亡的主要疾病，每年全球因癌症死亡人数大约为700万。现阶段由于癌症早期诊断和筛查技术的不足，很大一部分癌症病人在初次就诊时就已经是处于肿瘤晚期，丧失了手术切除治愈的机会。化疗以及放疗仍然是现阶段晚期肿瘤的主要治疗手段。然而，在化疗过程中，肿瘤细胞会逐渐获得对药物的耐受性，进而变得对化疗药物不敏感，这也是临床上化疗失败的最主要原因。

bcl2(b-celllymphoma-2)蛋白家族在细胞的抗凋亡过程中发挥着决定性的作用。该蛋白可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡，bcl2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒素的抵抗性。一方面bcl2的过度表达可减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成，进而抑制活性氧损伤(ros)；另一方面，bcl2可以在线粒体膜上与其他蛋白形成孔道复合物，调控线粒体内细胞色素c的释放，控制凋亡的发生。现阶段大量临床试验已经证实，同时靶向抑制bcl2蛋白的分子功能可以极大的促进化疗药物的杀伤效果，一系列的bcl2抑制剂已经进入三期临床。

由于在化疗过程中，肿瘤细胞会出现对药物的耐药性，本领域一直致力于寻找可以靶向抑制bcl2蛋白、具有化疗增敏作用、与化疗药具有协同增效的联合用药物，以进一步提高癌症的治疗效果特别是化疗耐药的肿瘤的治疗效果。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种醋酸棉酚(gossypolaceticacid，gaa)和化疗药的联合用药。该联合用药可以显著抑制肿瘤细胞生长，且具有协同增效作用。

为此，第一方面，本发明提供lrpprc负调控剂在制备降低bcl2表达的药物中的应用。

其中，所述lrpprc负调控剂包括靶向lrpprc的干扰rna、核酸适配体、小分子化合物；优选醋酸棉酚。

其中，所述肿瘤疾病包括肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、肝癌、食管癌、结直肠癌和前列腺癌，优选肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、乳腺导管癌。

第二方面，本发明提供lrpprc负调控剂在制备化疗药抗肿瘤活性增效剂中的应用。

其中，所述lrpprc负调控剂包括靶向lrpprc的干扰rna、核酸适配体、小分子化合物；优选醋酸棉酚。

其中，所述肿瘤疾病包括肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、肝癌、食管癌、结直肠癌和前列腺癌，优选肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、乳腺导管癌。

第三方面，本发明提供lrpprc负调控剂在制备降低或消除肿瘤对化疗药抗性的药物中的应用。

其中，所述lrpprc负调控剂包括靶向lrpprc的干扰rna、核酸适配体、小分子化合物；优选醋酸棉酚。

其中，所述肿瘤疾病包括肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、肝癌、食管癌、结直肠癌和前列腺癌，优选肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、乳腺导管癌。

第四方面，本发明提供一种药物，其包括a)lrpprc负调控剂，以及b)化疗药。

其中，所述lrpprc负调控剂包括靶向lrpprc的干扰rna、核酸适配体、小分子化合物；优选醋酸棉酚。

其中，所述化疗药包括酒石酸长春瑞滨，阿霉素，表阿霉素，吡柔比星，硫酸长春新碱，依托泊苷，替尼泊苷，环磷酰胺，异环磷酰胺，甲氨蝶呤，博来霉素，亚叶酸钙，氟尿嘧啶，氟脲嘧啶脱氧核苷啶，阿糖胞苷，顺铂，卡铂，奥沙利铂，平阳霉素，尼莫司汀，丝裂霉素，达卡巴嗪，羟基喜树碱和紫杉醇中的一种或几种；优选顺铂。

进一步，本发明所述的药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

第五方面，本发明提供所述药物在制备下述产品中的应用：

1)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；2)预防和/或治疗肿瘤疾病的药物。

其中，所述肿瘤细胞为癌细胞，所述癌细胞优选为肺癌细胞、乳腺癌细胞、乳腺导管癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、结直肠癌细胞和前列腺癌细胞，优选肺腺癌细胞、肺鳞癌细胞、乳腺癌细胞、乳腺导管癌细胞。

其中，所述肿瘤疾病包括肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、肝癌、食管癌、结直肠癌和前列腺癌，优选肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、乳腺导管癌。

本文所用药物名或商品名称仅表示其活性成分，不应视为对所述药物来源的限制。

术语“载体”或“赋形剂”可以是制药领域中任何常规的载体和赋形剂。具体的载体和赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的载体或赋形剂包括药学领域常规的载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、溶剂、支持剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以包括香味剂、防腐剂和甜味剂等。

lrpprc(富含亮氨酸的三角状五肽重复基序蛋白)是一种线粒体蛋白，它的突变与细胞色素c氧化酶缺陷(cytochromecoxidasedeficiency)及leigh综合征(leighsyndrome)的发生密切相关。大量研究工作表明lrpprc是一个重要的细胞抗凋亡蛋白，在多种化疗耐药的肿瘤细胞中显著高表达。现阶段研究已经明确lrpprc是一个重要的bcl2调控蛋白。在线粒体中lrpprc可以直接与bcl2相互作用，提高bcl2蛋白的稳定性，增加bcl2的蛋白水平。

本发明筛选到lrpprc的特异性小分子抑制剂醋酸棉酚(gaa)，经本发明探究，gaa可以靶向降解lrpprc从而降低抗凋亡蛋白bcl2的表达，以实现化疗增敏的作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供了gaa和化疗药的联合用药物，用于抑制肿瘤生长时效果显著，并且显著优于二者单独使用，说明二者联合使用可以发挥协同增效的作用。

(2)在本发明已经探明gaa的作用机制的基础上，可知gaa可抑制lrpprc蛋白的表达，从而可以直接降解bcl2蛋白；而bcl2蛋白与肿瘤耐药性有关，靶向抑制bcl2蛋白的分子功能可以极大的促进化疗药物的杀伤效果，所以，将gaa与化疗药联用具有化疗增敏作用，可有效减少肿瘤细胞对化疗药产生的耐药性。

(3)gaa和化疗药已经分别被证实可用于临床治疗，安全性高，故本发明为临床治疗肿瘤疾病提供了一种新的、更有效的治疗方案，临床应用前景良好。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1为肺腺癌细胞系a549的lrpprc和bcl2蛋白的westernblot检测图，其中以actin蛋白的杂交信号作为衡量上样量的内参。其中a图为用si-lrpprc敲降lrpprc(以加入si-nc作为空白对照)后的检测图，b图为加入gaa(以加入dmso作为空白对照)后的检测图。

图2为肺腺癌细胞系a549的生长速率曲线图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例中未注明具体条件者，按照分子生物学与免疫学的常规实验条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1gaa可通过靶向降解lrpprc从而降低bcl2表达

本实施例在肺腺癌细胞系a549中，一方面给细胞转染lrpprc特异性的干扰序列，一方面用gaa进行处理。48h后进行免疫印迹实验，检测lrpprc与bcl2蛋白的表达变化。具体实验步骤如下：

a)向肺腺癌细胞系a549转染lrpprc特异性的sirna干扰序列(si-lrpprc)，同时设置空白对照组，向肺腺癌细胞系a549转染对照序列(si-nc)，培养48h后，收集细胞进行裂解，提取细胞总蛋白，取40μg用于westernblot实验，检测lrpprc和bcl2蛋白的表达水平，以蛋白actin的表达强度作为内参。敲降lrpprc后肺腺癌细胞系a549的lrpprc和bcl2蛋白的westernblot检测结果见图1(a)。

b)向肺腺癌细胞系a549加入终浓度为10μm的小分子化合物gaa进行共培养，同时设置空白对照组(仅加入dmso)，48h后，收集细胞进行裂解，提取蛋白质，取40μg用于westernblot实验，检测lrpprc和bcl2蛋白的表达水平，以蛋白actin的表达强度作为内参。gaa作用后肺腺癌细胞系a549的lrpprc和bcl2蛋白的westernblot检测结果见图1(b)。

如图1(a)所示，敲降lrpprc后，bcl2的蛋白水平发生显著下降。如图1(b)所示，在用lrpprc特异性小分子抑制剂gaa处理后，诱导了lrpprc的降解与bcl2蛋白表达水平的下降。本实施例的敲降实验以及gaa处理实验直接证明gaa可以靶向降解lrpprc从而降低抗凋亡蛋白bcl2的表达。

实施例2gaa与顺铂联用增强抗肿瘤效果

本实施例在肺腺癌细胞系a549中，进行gaa与顺铂的联合用药，评价gaa在lrpprc阳性的肺腺癌细胞系a549中，gaa对顺铂疗效的增敏效果。

将处于对数生长期的肺腺癌细胞系a549用胰酶消化计数，以2000个/孔的密度接种于xcelligencertca-mp系统的96孔板中，培养24h贴壁后开始加药。设置四组，分别为添加gaa(5um)、顺铂(5um)或者gaa(5um)+顺铂(5um)的联用组，以仅添加pbs缓冲液的组作为空白对照组。每30min采集一次每孔的细胞数量数据信息，持续检测72h。根据采集到的细胞数量信息，绘制生长曲线如图2所示。

根据图2，单独施用gaa(5um)或顺铂(5um)都能抑制肺腺癌细胞系a549的生长，但是两者联合使用的时候，抑制效果显著比单药使用更好，说明gaa可以增加化疗药顺铂的敏感性，两者存在协同效果。

实施例3gaa与化疗药物联用具有协同效应

采用标准协同指数计算公式q＝e(a+b)/(e(a)+e(b)-e(a)×e(b))，(e(a+b)为两药联用抑制率，e(a)为a药单用的抑制率，e(a)为b药单用的抑制率)进行gaa与顺铂的协同效应统计，当q值大于1.15时为协同效应。在肺腺癌细胞系a549中，gaa(5μm)、顺铂(5μm)以及两者联用处理细胞72h后的抑制率分别为：e(gaa)＝0.28，e(顺铂)＝0.51，e(gaa+顺铂)＝0.81，q＝1.23，显示为协同效应。

需要说明的是，实施例1-3以肺腺癌细胞为例进行验证，当然，也可以取乳腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、肺鳞癌、胰腺癌、胃癌等细胞，本实施例在此不做限定。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。