一种提取纯化桦褐孔菌三萜的方法与流程

本发明属于桦褐孔菌三萜制备方法技术领域，具体涉及一种提取纯化桦褐孔菌三萜的方法。

背景技术：

桦褐孔菌(inonotusobliquus)是一种珍贵的药用真菌,属于多孔菌科,褐卧孔菌属,分布于我国东北地区、芬兰、波兰、俄罗斯及日本等地。桦褐孔菌在民间常用来治疗肝癌、子宫癌、胃癌、高血压和糖尿病等疾病。三萜是桦褐孔菌中非常重要的一类化学成分,具有非常重要的生物活性。但是目前在提纯时由于存在溶剂浸润困难，耗时较长，提纯的效率很低。为了进一步提高提纯的效率、成本，以及提纯的质量，满足工业提纯的目的，急需一种有效的提纯方法。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提高一种提取纯化桦褐孔菌三萜的方法。

本发明的技术方案为：

一种提取纯化桦褐孔菌三萜的方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理

选择成熟干燥的桦褐孔菌，清水冲洗表面杂质后在45℃干燥至含水量为2-5％，粉碎成桦褐孔菌粉末；

(2)原料浸泡

按桦褐孔菌粉末质量与提取溶剂体积之比为1:2.5-3g/ml的比例加入提取溶剂，在45-50℃下浸泡材料0.5-1.5小时，制成样品；

(3)装柱

将步骤(2)中浸泡过的桦褐孔菌粉末与提取溶剂在室温下装入层析柱中，按照常规方法洗脱出桦褐孔菌三萜；

(4)循环柱层析提取

采用至少三根层析柱依次连续洗脱，上一根层吸柱的洗脱液直接进入下一根层吸柱进行洗脱，直至完成提取；

(5)大孔树脂预处理

依次用95％酒精、盐酸和naoh溶液分别浸泡xad-2大孔树脂12小时，然后往层析柱中装入xad-2大孔树脂，然后以1.5bv/小时的流速用蒸馏水充分洗涤5bv，制成大孔树脂层析柱；

(6)大孔树脂层析柱层析纯化

使用时先将提取液以1.5bv/小时的流速加入预处理或再生后的大孔树脂层析柱，加样品于大孔树脂层析柱中，加样时柱大孔树脂柱内不得产生气泡、断层；

(7)蒸馏水除杂

待样品完全流入柱内后，用蒸馏水以2bv/小时流速洗涤树脂柱3bv，洗去大部分杂质，不损失三萜；

(8)洗脱

用3bv的体积分数为80％的乙醇溶液从大孔树脂层析柱中洗脱三萜，收集洗脱液，洗脱过程中，三萜以暗黄色条带向下移动，可作为层析洗脱时的目测指标，收集三萜洗脱液；

(9)静置除杂

将收集好的三萜洗脱液密封，避光在低温冷藏箱中放置12小时后减压过滤或离心过滤除去沉淀；

(10)减压浓缩

取步骤(9)滤液或离心的上清液，在40-45℃条件下减压浓缩至除去乙醇；

(11)干燥

取步骤(10)减压浓缩后的浓缩液真空冷冻干燥12小时得亮黄色粉末，即为桦褐孔菌三萜。

进一步地，本发明所述步骤(1)中桦褐孔菌粉末的细度为40目。

进一步地，本发明所述步骤(2)中提取溶剂为质量百分数为40-60％的异丙醇水溶液。

进一步地，本发明所述步骤(3)中层析柱为xad-2大孔树脂柱，层析柱洗脱时柱中材料的高度应为柱直径的5倍，洗脱流速为1bv/小时。

进一步地，本发明所述步骤(5)中盐酸和naoh溶液的浓度为0.1mol/l。

进一步地，本发明所述步骤(5)中析柱中装入xad-2大孔树脂的高度为层析柱直径的10-15倍。

进一步地，本发明所述步骤(6)中样品的体积不超过大孔树脂层析柱体积的4.5倍量。

进一步地，本发明所述步骤(8)中的洗脱流速为1bv/小时。

进一步地，本发明所述步骤(9)中避光在低温冷藏箱的温度为4℃。

进一步地，本发明所述步骤(11)中取步骤(10)减压浓缩后的浓缩液先在-20℃预冷2小时后再经-80℃真空冷冻干燥。

本发明采用上述技术方案，将桦褐孔菌捣碎40目的桦褐孔菌粉末，这样既不会由于粉末过细，造成溶剂流动困难，提取柱压增大；也不会由于过粗造成提取溶剂浸润困难，耗时较长不利于工业化应用。

本发明采用循环柱层析提取，桦褐孔菌三萜提取率可达90％。极大地提高了桦褐孔菌三萜的提取率；

本发明静置除杂时首先避光在4℃低温冷藏箱中放置12小时后减压过滤或离心过滤除去沉淀，洗脱液中乙醇浓度为80％因此无需再调整异乙醇浓度，直接低温静置即可进一步除去了洗脱液中残留的多糖及蛋白杂质，提高桦褐孔菌三萜纯度。

附图说明

图1为本发明实施例桦褐孔菌三萜循环柱层析提取流程图；

图2为本发明实施例不同提取溶剂对桦褐孔菌三萜提取率的影响；

图3为本发明实施例不同异丙醇体积分数对桦褐孔菌三萜提取率的影响；

图4为本发明实施例不同ph提取液对桦褐孔菌三萜提取率的影响；

图5为本发明实施例不同温度对桦褐孔菌三萜提取率的影响；

图6为本发明实施例溶剂吸附及提取动力学；

图7为本发明实施例径高比1:5对桦褐孔菌柱层析提取率的影响；

图8为本发明实施例径高比1:10对桦褐孔菌柱层析提取率的影响；

图9为本发明实施例径高比1:15对桦褐孔菌柱层析提取率的影响；

图10为本发明实施例洗脱流速1bv/h对桦褐孔菌三萜柱层析提取率的影响；

图11为本发明实施例洗脱流速1.5bv/h对桦褐孔菌三萜柱层析提取率的影响；

图12为本发明实施例洗脱流速2bv/h对桦褐孔菌三萜柱层析提取率的影响；

图13为本发明实施例桦褐孔菌三萜循环柱层析提取曲线；

图14为本发明实施例为浸泡提取与循环柱层析提取结果比较。

具体实施方式

实施例1

一种提取纯化桦褐孔菌三萜的方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理

选择成熟干燥的桦褐孔菌，清水冲洗表面杂质后45℃干燥12h至含水量为2-5％之间，捣碎成小块粉碎至40目，材料不宜过细，否则溶剂流动困难，提取柱压增大；材料过粗会造成提取溶剂浸润困难，耗时较长不利于工业化应用；

(2)原料浸泡

按提取材料干重与提取溶剂之比或料液比为1:2.95比例加入提取溶剂，提取溶剂为50％异丙醇水溶液，50℃下浸泡材料1小时至材料充分吸胀。如果材料前期未完全干燥，可根据材料含水量调整至上述料液比；

(3)装柱

将充分吸胀的桦褐孔菌与浸泡溶剂一起转入层析柱或类似容器中，室温下，用柱层析洗脱的方法将三萜从层析柱内的桦褐孔菌中洗脱出来，为达到高效率提取的目的，洗脱过程必须严格按照柱层析中物质洗脱的方法；层析柱中材料的高度应为柱直径的5倍，洗脱流速为1bv/小时，柱内液面必须始终高于材料；

(4)循环柱层析提取

柱内流出的洗脱液以1个柱体积为单位收集，第1根柱的提取液上xad-2大孔树脂柱吸附后流出的平液由于含有60％异丙醇，可直接用于第2根提取柱的提取，依次类推；大规模连续生产时，用3根或更多层析柱组合成一条连续自动的生产线，可以不间断收取提取液进入下一道大孔树脂分离工序，经检测经过循环柱层析提取，桦褐孔菌三萜提取率可达90％，如图1所示具体的流程图，为进一步证明异丙醇的提取率，本发明对甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和水对提取效率进行了对比，对比结果见图2，从图中可以看出异丙醇对桦褐孔菌三萜的提取率最高，可达0.14mg/ml。

(5)大孔树脂的预处理

xad-2大孔树脂依次用95％使用酒精、0.1mol/l盐酸、0.1mol/lnaoh分别浸泡12小时后装入层析柱至层析柱中树脂的高度为柱直径的10～15倍，蒸馏水以1.5bv/小时的流速充分洗涤5bv；

(6)大孔树脂柱层析纯化

将提取液以1.5bv/小时的流速加入预处理或再生后的大孔树脂柱，加样体积以不超过大孔树脂柱体积的4.5倍量为佳，加样时柱大孔树脂柱内不得产生气泡、断层；加样时柱内的的流出液以柱体积为单位分开收集，三萜被xad-2大孔树脂吸附后，大孔树脂柱流出的平液主要为50％异丙醇，可直接用于下一根提取柱中三萜提取；

(7)蒸馏水洗除杂

待样品完全流入柱内后，用蒸馏水以2bv/小时流速洗涤树脂柱3bv，洗去大部分杂质，不损失三萜；

(8)洗脱

用3bv的80％乙醇从大孔树脂柱中洗脱三萜，洗脱流速1bv/小时，收集洗脱液。如果大孔树脂柱层析技术进一步优化，加样、蒸馏水洗除杂等过程控制良好，可使洗脱液体积减少0.5～1bv，洗脱过程中，三萜以暗黄色条带向下移动，可作为层析洗脱时的目测指标，经检测桦褐孔菌总三萜回收率可达81.23％；

(9)静置除杂

将收集好的三萜洗脱液密封，避光在4℃低温冷藏箱中放置12小时后减压过滤或离心过滤除去沉淀，洗脱液中乙醇浓度为80％，因此无需再调整异乙醇浓度，直接低温静置即可进一步除去了洗脱液中残留的多糖及蛋白杂质；

(10)减压浓缩

滤液或离心上清液40～45℃减压浓缩至除去乙醇；

(11)干燥

减压浓缩后的浓缩液可在-20℃预冷2小时后再经-80℃真空冷冻干燥12小时得亮黄色粉末，经检测冷冻干燥途径下所得的桦褐孔菌三萜纯度均可达70％或以上，含水量仅为3％到4.5％。

本发明对不同异丙醇体积分数对桦褐孔菌三萜提取率的影响进行了研究，结果见图3，从图3可知，随异丙醇体积分数的增大，溶剂对桦褐孔菌三萜的提取呈先增大后减小的趋势，异丙醇体积分数为50％时，提取率最高。

本发明对体积分数为50％的异丙醇在不同ph提取液对桦褐孔菌三萜提取率的影响进行了研究，结果见图4，从图4可知，ph对桦褐孔菌三萜的溶剂提取效果影响较显著，以ph7，50％的异丙醇水溶液为提取溶剂时提取率最高，综上所述，确定桦褐孔菌三萜最佳提取溶剂为ph7，50％异丙醇水溶液。

本发明对不同温度对桦褐孔菌三萜提取率的影响进行了研究，结果见图5，从图5可知，当温度为50℃时桦褐孔菌三萜的提取速率最大，其三萜总浓度可达0.25mg/ml。

本发明对在50℃下，采用ph7、50％异丙醇提取时，提取材料对提取溶剂的吸附动力学曲线及多酚提取动力学曲线进行了研究，结果见图6，从图6可知，在浸泡提取时间达到60分钟时，溶剂吸附及多酚的溶出浓度达到平衡，每g提取材料可吸附2.95毫升ph7、50％异丙醇。因此后续柱层析提取时选择材料浸泡时间为60分钟，浸泡料液比为1:2.95。

本发明对径高比1:5对桦褐孔菌柱层析提取率的影响进行了研究，结果见图7，由图7可知洗脱至10ml时三萜最高浓度可达0.58mg/ml，洗脱至50ml时桦褐孔菌中的三萜洗脱完全。

本发明对径高比1:10对桦褐孔菌柱层析提取率的影响进行了研究，结果见图8，由图8可知洗脱至20ml时三萜最高浓度可达0.74mg/ml，洗脱至100ml时桦褐孔菌中的三萜洗脱完全。

本发明对径高比1:15对桦褐孔菌柱层析提取率的影响进行了研究，结果见图9，由图9可知总三萜最高浓度不明显，而且其变化幅度比较大，直至洗脱至250ml也没有洗脱完全。

综上所述，柱直径与柱床高度比为1：5时，仅需50ml即可洗脱完全，因此为最佳柱层析提取径高比。

本发明对洗脱流速1bv/h对桦褐孔菌三萜柱层析提取率的影响进行了研究，结果见图10，由图10可知总三萜浓度达到0.58mg/ml，洗脱至40ml时桦褐孔菌中的三萜几乎洗脱完全。

本发明对洗脱流速1.5bv/h对桦褐孔菌三萜柱层析提取率的影响进行了研究，结果见图11，由图11可知总三萜浓度达到0.45mg/ml，洗脱至50ml时桦褐孔菌中的三萜几乎洗脱完全。

本发明对洗脱流速2bv/h对桦褐孔菌三萜柱层析提取率的影响进行了研究，结果见图12，由图12可知总三萜浓度达到0.4mg/ml，洗脱至60ml时桦褐孔菌中的三萜几乎洗脱完全。

综上所述，当洗脱流速为1bv/h时，桦褐孔菌柱层析提取速率最高。

本发明对循环柱层析提取时不同批次提取柱中桦褐孔菌三萜的洗脱曲线进行了研究，结果见图13，从图13可知，随着提取液的循环次数增加，洗脱液中三萜浓度越来越低。同时我们可以发现，在每个循环柱中的最高浓度波动比较小，较小的浓度波动由利于工业化生产过程中的质量控制。

本发明对浸泡提取与循环柱层析提取结果比较进行了研究，结果见图14，从图14可知，采用循环柱层析提取，三萜提取率显达到5.4mg/g显著好于传统浸泡提取4.6mg/g。