肉毒毒素AHc疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型的制作方法

本发明涉及一种肉毒毒素ahc疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型。

背景技术：

肉毒毒素(botulinumneurotoxin，bont)是由肉毒梭菌在厌氧的环境中产生的神经外毒素，是一种毒性极强的蛋白类毒素。肉毒毒素是典型a-b型神经外毒素，通过抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱囊泡的释放，阻断神经肌肉接头处的冲动传导，最终会导致骨骼肌麻痹，呼吸衰竭而死，是已知毒性最强的蛋白。

肉毒毒素是由轻链(50kda)和重链(100kda)组成的双链结构，由二硫键连接。轻链是毒性成分。重链是神经细胞的毒性受体，本身不具有活性，是介导毒素的跨膜转运及进入细胞所必需的。肉毒毒素有两个跨膜，还有两个二硫键，一个二硫键位于分子内，一个二硫键位于分子间。天然肉毒毒素和血凝素、非毒素非血凝素蛋白一起构成前体毒素(毒素复合物)，分子量大约300kda～900kda，前体毒素具有良好的稳定性，可长期保存而不失去活性。

肉毒毒素依据毒素抗原性的不同，分为7种血清型(a型、b型、c型、d型、e型、f型和g型)，其中a、b、e和f型可以导致人类中毒，其中以a型的毒性最强，是生物毒素和化学毒物中毒性最强的物质，引起的临床症状也远远重于b型和e型。bonts毒性大，性质稳定，极容易被制备成生物战剂应用，严重危害公众健康与安全。研究肉毒毒素气溶胶的致病机制与免疫保护，对反生物武器战争和反恐怖袭击具有重要的军事意义。

疫苗接种是预防肉毒梭菌中毒的最有效的医学对策。目前的商业疫苗是类毒素(即灭活的全毒素)。类毒素疫苗具有副作用，例如局部和全身反应，其在接受第二次注射的个体中增加。bonts的毒理作用、疫苗保护效果的评价等研究都离不开动物模型的建立。目前，针对液体气溶胶或干粉气溶胶等的研究多采用小鼠口鼻暴露和全身暴露模型，这两种方法虽然对实验动物无创伤，但是无法精确定量给药剂量，样品在暴露塔中损耗较大且容易发生沉降。而且相关的仪器设备体积大、价格不菲。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种肉毒毒素ahc疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型。

本发明提供了一种a型肉毒神经毒素疫苗，其有效成分为特定溶液的气溶胶；所述特定溶液中含有特定蛋白和黏膜免疫佐剂；所述特定蛋白为ahc蛋白或具有ahc蛋白的融合蛋白；特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比为1:0.5-1.5。

特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比具体可为1:1。

具有ahc蛋白的融合蛋白为在ahc蛋白的n末端和/或c末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与ahc蛋白可以直接融合连接，也可以通过1-10个氨基酸残基的连接肽融合连接。具有ahc蛋白的融合蛋白具体可为ahc-his6蛋白。ahc-his6蛋白具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

所述特定溶液中，还含有缓冲液。所述缓冲液可为pbs缓冲液。所述缓冲液更具体可为ph7.2、0.01m的pbs缓冲液。

所述特定溶液具体可由特定蛋白(特定蛋白溶液)、黏膜免疫佐剂和缓冲液组成。

每50微升所述特定溶液中，具体可含有20μg特定蛋白和20μg黏膜免疫佐剂。

所述黏膜免疫佐剂具体可为cpg。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗a型肉毒神经毒素中毒的套件，包括特定蛋白、黏膜免疫佐剂和液体气溶胶肺递送装置；所述特定蛋白为ahc蛋白或具有ahc蛋白的融合蛋白；特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比为1:0.5-1.5。

特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比具体可为1:1。

具有ahc蛋白的融合蛋白为在ahc蛋白的n末端和/或c末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与ahc蛋白可以直接融合连接，也可以通过1-10个氨基酸残基的连接肽融合连接。具有ahc蛋白的融合蛋白具体可为ahc-his6蛋白。ahc-his6蛋白具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

所述黏膜免疫佐剂具体可为cpg。

本发明还保护一种a型肉毒神经毒素疫苗，其有效成分为特定蛋白溶液的气溶胶；所述特定蛋白为ahc蛋白或具有ahc蛋白的融合蛋白。

具有ahc蛋白的融合蛋白为在ahc蛋白的n末端和/或c末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与ahc蛋白可以直接融合连接，也可以通过1-10个氨基酸残基的连接肽融合连接。具有ahc蛋白的融合蛋白具体可为ahc-his6蛋白。ahc-his6蛋白具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

所述特定溶液中，还含有缓冲液。所述缓冲液可为pbs缓冲液。所述缓冲液更具体可为ph7.2、0.01m的pbs缓冲液。

所述特定溶液具体可由特定蛋白(特定蛋白溶液)和缓冲液组成。

每50微升所述特定溶液中，具体可含有20μg特定蛋白。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗a型肉毒神经毒素中毒的套件，包括特定蛋白和液体气溶胶肺递送装置；所述特定蛋白为ahc蛋白或具有ahc蛋白的融合蛋白。

具有ahc蛋白的融合蛋白为在ahc蛋白的n末端和/或c末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与ahc蛋白可以直接融合连接，也可以通过1-10个氨基酸残基的连接肽融合连接。具有ahc蛋白的融合蛋白具体可为ahc-his6蛋白。ahc-his6蛋白具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗a型肉毒神经毒素中毒的疫苗，包括特定蛋白和黏膜免疫佐剂；所述特定蛋白为ahc蛋白或具有ahc蛋白的融合蛋白；特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比为1:0.5-1.5。

特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比具体可为1:1。

具有ahc蛋白的融合蛋白为在ahc蛋白的n末端和/或c末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与ahc蛋白可以直接融合连接，也可以通过1-10个氨基酸残基的连接肽融合连接。具有ahc蛋白的融合蛋白具体可为ahc-his6蛋白。ahc-his6蛋白具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

所述黏膜免疫佐剂具体可为cpg。

所述疫苗为肺递送疫苗。

本发明还保护特定蛋白、黏膜免疫佐剂和肺递送装置在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防和/或治疗a型肉毒神经毒素中毒；所述特定蛋白为ahc蛋白或具有ahc蛋白的融合蛋白；特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比为1:0.5-1.5。

特定蛋白和黏膜免疫佐剂的质量配比具体可为1:1。

具有ahc蛋白的融合蛋白为在ahc蛋白的n末端和/或c末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与ahc蛋白可以直接融合连接，也可以通过1-10个氨基酸残基的连接肽融合连接。具有ahc蛋白的融合蛋白具体可为ahc-his6蛋白。ahc-his6蛋白具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

所述黏膜免疫佐剂具体可为cpg。

以上任一所述ahc蛋白为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；

(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

本发明还保护一种制备肉毒毒素致毒动物模型的方法，包括如下步骤：将肉毒毒素溶液通过液体气溶胶肺递送给试验动物，得到肉毒毒素致毒动物模型。该模型可直接将受试物以气溶胶形式递送至小鼠肺部，针对性强，重复性好，可以准确定量研究受试物对小鼠的保护效果。

所述肉毒毒素为a型肉毒神经毒素。

所述试验动物为小鼠。所述试验动物具体为balb/c小鼠。

肉毒毒素的攻毒剂量为125ng/kg-375ng/kg体重。肉毒毒素的攻毒剂量具体可为125ng/kg体重、187.5ng/kg体重、250ng/kg体重、312.5ng/kg体重或375ng/kg体重。

所述肉毒毒素溶液单次递送给试验动物，递送剂量为每只试验动物50μl。

本发明选择了一种重组蛋白ahc亚单位疫苗，并首次采用肺递送免疫方式研究了ahc亚单位疫苗的体内和体外功效。证明我们的候选疫苗可以保护小鼠免受致命的a型肉毒毒素攻击，经气管进行肺递送可以将样品直接到达肺部靶器官，作用直接，节约药物，为吸入感染与治疗提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1为低剂量亚组的生存率。

图2为中剂量亚组的生存率。

图3为高剂量亚组的生存率。

图4为血清中igg抗体的浓度。

图5为血清igg1中抗体的浓度。

图6为血清中igg2a抗体的浓度。

图7为血清中igg2b抗体的浓度。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

balb/c小鼠(spf级雌性，6-7周)：北京维通利华实验动物技术有限公司；实验动物许可证号：scxk(京)2016-0006)。

手持式液体气溶胶肺递送装置：北京慧荣和科技有限公司的肺部液体定量雾化器。

如无特殊说明，实施例中所用的pbs缓冲液均为ph7.2、0.01m的pbs缓冲液。

实施例1、蛋白的制备

一、a型肉毒神经毒素(bont/a)的制备

制备a型肉毒神经毒素。按照文献(《一种方便易用的a型肉毒毒素活性检测方法的建立》，刘婧)中记载的方法进行制备。采用a型肉毒梭菌(clostridiumbotulinumtypea)62a，先进行增菌和产毒培养，然后进行沉淀和抽提，然后进行硫酸铵沉淀(60％的饱和度)与去除核酸，然后进行凝胶过滤与离子交换层析，得到a型肉毒神经毒素溶液。具体步骤见文献。

取a型肉毒神经毒素溶液，bca法测定蛋白浓度，蛋白浓度为0.15mg/ml。

二、ahc蛋白的制备

ahc蛋白即a型肉毒神经毒素的重链中的无毒50kd羧基端片段。ahc蛋白如序列表的序列1所示，序列表的序列2所示的dna分子编码序列表的序列1所示的ahc蛋白。

1、重组载体ptig-trx的构建

重组载体ptig-trx：将载体pet-22b(+)中的特异dna片段取代为序列表的序列4所示的dna分子，得到重组载体ptig-trx。特异dna片段指的是载体pet-22b(+)中自ndei酶切识别序列开始至his6标签编码序列后的终止密码子结束。

序列表的序列4所示的dna分子中，第4-360位核苷酸为trx基因的编码框，第360-1676位核苷酸为ahc-his6蛋白的编码框。

trx基因编码硫氧还蛋白。硫氧还蛋白是参与新生蛋白肽链折叠的辅助蛋白，当重组蛋白与之共表达时，它可促进下游正在折叠的目的蛋白通过异构反应获得正确的折叠，另外，也能够增强胞内蛋白质的二硫键的形成，使表达产物不易形成包涵体。

ahc-his6蛋白是在ahc蛋白的c末端融合his6标签得到的(它们之间具有2个氨基酸残基的间隔)，如序列表的序列3所示。

2、将重组载体ptig-trx导入大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌接种至含100mg/ml氨苄青霉素的液体lb培养基，37℃、250rpm培养至对数生长期(od600nm约为0.4-0.6)。

4、完成步骤3后，在体系中加入iptg并使其在体系中的浓度为0.2mmol/l，然后30℃、250rpm诱导培养5小时，然后收集菌体沉淀。

5、取步骤4得到的菌体沉淀，进行超声破碎，收集上清液。

6、取步骤5得到的上清液，采用ni-nta亲和层析柱(购自法玛西亚公司)并参照说明书进行蛋白纯化，将纯化收集的溶液转移到透析袋中，在pbs缓冲液中进行透析，得到ahc-his6蛋白溶液。

7、蛋白浓度检测

取ahc-his6蛋白溶液，bca法测定蛋白浓度，蛋白浓度为3.092mg/ml。

实施例2、a型肉毒神经毒素溶液气溶胶肺递送感染的半数致死剂量研究

采用改进寇式法(karber)测定a型肉毒神经毒素对小鼠的半数致死剂量(ld50)。

设置5个剂量的攻毒组，即第1组至第5组，每组5只balb/c小鼠(每只小鼠体重15-17g)。处理过程：先腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉(麻醉前3h禁食和禁饮，戊巴比妥钠的使用剂量为60mg/kg体重，1％戊巴比妥钠用生理盐水配制)；完全麻醉后，小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，右手用小镊子轻夹住小鼠舌部并向上提起，左手拿带光源的小鼠喉镜使其声门暴露，看见气管入口后将手持式液体气溶胶肺递送装置的喷雾头插入气管快速攻毒(每只小鼠的攻毒体积均为50μl)；攻毒完成后退出喷雾头和喉镜，并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。攻毒采用实施例1制备的a型肉毒神经毒素溶液的稀释液(溶剂为pbs缓冲液)，第1组至第5组的攻毒剂量依次为375ng/kg体重、312.5ng/kg体重、250ng/kg体重、187.5ng/kg体重、125ng/kg体重。

设置空白对照组，5只balb/c小鼠(每只小鼠体重15-17g)，用等体积pbs缓冲液代替a型肉毒神经毒素溶液的稀释液。

每24小时作为1天，分别于攻毒0时刻，攻毒1天后、攻毒2天后、攻毒3天后、攻毒4天后、攻毒5天后、攻毒6天后、攻毒7天后，记录存活小鼠数量，计算死亡率，结果见表1。采用改进寇式法公式计算半数致死剂量(ld50)。半数致死剂量为287.8ng/kg体重。

表1

每24小时作为1天，分别于攻毒0时刻，攻毒1天后、攻毒2天后、攻毒3天后、攻毒4天后、攻毒5天后、攻毒6天后、给药7天后，观察并记录小鼠病症(虚脱，不活动，毛发直立，息肉样，拒绝进食或饮水，以及某些情况下的上睑下垂等)。小鼠在攻毒6-12小时后出现虚脱，不活动，毛发直立，息肉样，拒绝进食或饮水，对外部刺激后反应迟钝等症状。随后部分小鼠症状逐渐加重，攻毒剂量越高的组别中，有临床症状小鼠数量越多。

实施例3、ahc蛋白疫苗液体气溶胶吸入免疫研究

cpg，全称为classbcpgoligonucleotide(b类cpg寡核苷酸)，具有免疫激活功能，是针对人或小鼠tlr9的免疫刺激剂，是一种典型的黏膜免疫佐剂。实施例中所用的cpg，为sigma公司产品目录号为tlrl-2006的产品，该产品的网址链接为：https://www.invivogen.com/odn2006。

铝佐剂https://www.invivogen.com/alhydrogel。

一、分组免疫处理

balb/c小鼠(共80只)随机分成四组，三个试验组和一个对照组。

试验组1(15只)，又称液体气溶胶ahc组或肺递送组：免疫cpg和ahc-his6蛋白(由实施例1制备的ahc-his6蛋白溶液提供)，单次免疫剂量为“cpg20μg/只，ahc-his6蛋白20μg/只”，单次免疫体积为50微升/只(用pbs缓冲液补足体积)。试验组1采用手持式液体气溶胶肺递送装置进行免疫。免疫过程：先腹腔注射麻醉1％戊巴比妥钠进行麻醉(麻醉前3h禁食和禁饮，戊巴比妥钠的使用剂量为60mg/kg体重，1％戊巴比妥钠用生理盐水配制)；完全麻醉后，小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，右手用小镊子轻夹住小鼠舌部并向上提起，左手拿带光源的小鼠喉镜使其声门暴露，看见气管入口后将手持式液体气溶胶肺递送装置的喷雾头插入气管快速免疫；免疫完成后退出喷雾头和喉镜，并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。

试验组2(15只)，又称液体气溶胶cpg组或cpg组：免疫cpg，单次免疫剂量为“cpg20μg/只”，单次免疫体积为50微升/只(用pbs缓冲液补足体积)。试验组2采用手持式液体气溶胶肺递送装置进行免疫，方法同试验组1。

试验组3(15只)，又称皮下ahc组或皮下组：免疫铝佐剂和ahc-his6蛋白(由实施例1制备的ahc-his6蛋白溶液提供)，单次免疫剂量为“铝佐剂100μg/只，ahc-his6蛋白20μg/只”，单次免疫体积为100微升/只(用pbs缓冲液补足体积)。试验组3采用皮下两点注射的方法进行免疫。

三个试验组的免疫次数均为3次，每次免疫间隔3周。

对照组(15只)，又称空白组，不进行任何免疫。

二、攻毒处理

步骤一的三个试验组的小鼠，第三次免疫完成2周后，进行攻毒。

对照组的小鼠平行时间进行攻毒。

每组的15只小鼠分成3个亚组，每个亚组5只，分别进行攻毒。攻毒过程：先腹腔注射麻醉1％戊巴比妥钠进行麻醉(麻醉前3h禁食和禁饮，戊巴比妥钠的使用剂量为60mg/kg体重，1％戊巴比妥钠用生理盐水配制)；完全麻醉后，小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，右手用小镊子轻夹住小鼠舌部并向上提起，左手拿带光源的小鼠喉镜使其声门暴露，看见气管入口后将手持式液体气溶胶肺递送装置的喷雾头插入气管快速攻毒(每只小鼠的攻毒体积均为50μl)；攻毒完成后退出喷雾头和喉镜，并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。攻毒采用实施例1制备的a型肉毒神经毒素溶液的稀释液(溶剂为pbs缓冲液)。低剂量亚组攻毒剂量为27倍ld50剂量。中剂量亚组攻毒剂量为270倍ld50剂量。高剂量亚组攻毒剂量为2700倍ld50剂量。ld50即实施例2中计算得到的287.8ng/kg体重。

三、存活率

攻毒后观察14天，每天记录小鼠存活情况。

低剂量亚组的生存率见图1。

中剂量亚组的生存率见图2。

高剂量亚组的生存率见图3。

经过三次ahc免疫的小鼠，在被a型肉毒神经毒素(27倍或270倍ld50)致毒后，生存率可达100％，而对2700倍ld50a型肉毒神经毒素具有部分免疫保护作用。未经过ahc免疫的小鼠则生存率为0％，可见ahc经肺递送方式给药具有与皮下注射传统免疫途径的效果相当的保护效力。

四、血清抗体水平测定

三个时间点如下：一免(即第二次免疫前2天)，二免(即第三次免疫前2天)，三免(即攻毒前2天)。分别于三个时间点，每组随机取4只小鼠，通过眼眶静脉丛采血，室温放置约2h后，4000rpm离心10min，分离血清，分装后于-80℃冻存备用。

采用间接elisa法检测血清中6种特异性抗体(igg、igg1、igg2a、igg2b、igm、iga)。包被原为实施例1的步骤一的1制备的ahc-his6蛋白，包被浓度为3μg/ml。二抗分别为：hrp标记的山羊抗鼠igg、hrp标记的山羊抗鼠igg1、hrp标记的山羊抗鼠igg2a、hrp标记的山羊抗鼠igg2b、hrp标记的山羊抗鼠iga、hrp标记的山羊抗鼠igm，均为abcam公司产品。显色液为tmb显色液。结果以p/n≥3为阳性。

空白组：在三个时间点，小鼠血清中均未检测到6种特异性抗体。cpg组：在三个时间点，小鼠血清中均未检测到6种特异性抗体。肺递送组：在三个时间点，小鼠血清中均未检测到igm和iga，但均检测到较高水平的igg、igg1、igg2a和igg2b。皮下组：在三个时间点小鼠血清中均未检测到igm和iga，时间点1小鼠血清中未检测到igg2a和igg2b、仅检测到igg和igg1，时间点2和时间点3小时血清中均检测到较高水平的igg、igg1、igg2a和igg2b。

结果见图4至图7(*，0.01<p<0.05；**0.001<p<0.01；***0<p<0.001)。

结果表明，ahc作为亚单位疫苗接种后能够刺激小鼠产生特异性的免疫反应，并且在加强免疫后抗体滴度达到很高的水平，而这种特异性抗体的产生在对bont/a的保护过程中起着至关重要的作用。

sequencelisting

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>肉毒毒素ahc疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型

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