本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及五味子提取物、其制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术：
：五味子schisandrachinensis(turcz.)baill.是木兰科五味子属多年生落叶藤本植物，在中医作为滋补强壮剂已有悠久历史。现代药理学研究发现，五味子的几种有效成分如五味子酚、五味子乙素、五味子醇甲等对氧自由基引起的脂质过氧化有明显拮抗作用，但研究多集中在体内组织的抗氧化能力，而对体外的抗氧化能力研究的报道较少。对五味子功效成分的研究主要集中在木质素类成分，主要具有抗肿瘤、抗病毒、保肝等作用。应用方式主要为内服。近来，预防和延缓皮肤衰老越来越都受到人们的重视。其中，抵御紫外线侵害、抗氧化等护肤概念受到消费者认同。同时，在“崇尚自然”的潮流趋势下，以植物来源的天然功能性化妆品，受到消费者的青睐。目前的提取方法主要针对五味子中的木质素类成分，而忽略了五味子中黄酮类成分的抗氧化作用。且五味子提取物的制备方法中常用到氯仿、丙酮等有机溶剂，对环境有一定污染，且制备过程存在安全隐患。因此，提供一种五味子提取物的制备方法具有重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种五味子提取物及其制备方法。该方法在提取五味子中木质素类成分的同时，提取了五味子中的黄酮类成分，对原材料的利用更加充分，显著提高了收率。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种五味子提取物的制备方法，包括如下步骤：步骤1：取五味子预处理，与乙醇混合后提取，收集提取液；步骤2：取步骤1获得的所述提取液过滤、浓缩后获得浸膏；步骤3：取步骤2制得的所述浸膏与乙醇混合后经大孔吸附树脂纯化，分别经水洗、醇洗，收集醇洗脱液；步骤4：取步骤3制得的所述洗脱液浓缩、冷冻干燥。在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述提取包括第一提取和第二提取；所述第一提取采用15～25倍量(w/w)的50～80％(v/v)乙醇，超声0.5～1h后回流提取0.5～2h；所述第二提取采用5～15倍量(w/w)的50～80％(v/v)乙醇，回流提取0.5～1h，收集所述第一提取的提取液和所述第二提取的提取液，合并，即为步骤1获得的所述提取液。在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述过滤为减压抽滤，所述减压抽滤采用孔径为30～50μm的滤纸；所述减压抽滤的真空度为-0.02mpa～-0.06mpa。在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述浓缩为减压浓缩，所述减压浓缩为60-80℃、真空度为-0.02mpa～-0.06mpa的条件下浓缩至1～2倍药材投料量。在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述浸膏与乙醇的体积比为1:(2～5)，所述乙醇的浓度为30～50％(v/v)。在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述大孔吸附树脂包括hpd450或sp825l，所述大孔吸附树脂的用量为2～5倍药材投料量；所述浸膏的上样速度为2～6bvh。在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述水洗的洗脱量为4～8bv，水洗速度为4～8bvh。在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述醇洗采用的乙醇浓度为50～80％(v/v)，所述醇洗的洗脱量为4～6bv，醇洗速度为2～4bvh。在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述浓缩为减压浓缩，所述减压浓缩为在60～80℃、真空度为-0.02mpa～-0.06mpa的条件下浓缩至0.5～2倍药材投料量；步骤4中所述冷冻干燥的温度为-30～-50℃，真空度为-0.06mpa～-0.08mpa。本发明还提供了上述制备方法制得的五味子提取物。本发明还提供了上述制备方法制得的五味子提取物在制备化妆品中的应用。本发明还提供了一种具有抗氧化、抵御紫外线和或抗衰老功效的护理品，包含所述的制备方法制得的五味子提取物。对五味子提取物的功效测试应用了uvb-角质形成细胞和uva-成纤维细胞两个模型。紫外线(uv)包括中波紫外线(uvb，波长280nm～320nm)和长波紫外线(uva，波长320nm～400nm)。uvb作用的靶细胞主要是位于皮肤表皮层的角质形成细胞；uva具有较强的穿透力，部分能穿过表皮层到达真皮层，对真皮层中的成纤维细胞造成损伤。uv照射皮肤细胞导致活性氧(ros)产生，而细胞内的抗过氧化物酶，如超氧化物歧化酶(sod)，可以清除细胞内产生的ros，减轻细胞氧化损伤。活性氧与抗过氧化物酶之间存在一个动态平衡，紫外线等外界刺激诱导ros产生，损伤抗过氧化物酶活性，打破动态平衡，造成细胞氧化损伤，细胞活力下降，进一步引发皮肤炎症和光老化等皮肤问题。因此，依据皮肤科学和文献报道，选择细胞活力、活性氧量、超氧化物歧化酶活性来评价五味子提取物抗氧化、抵御紫外线的作用。超氧化物歧化酶(sod)是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它催化细胞内的超氧阴离子自由基转化为氧气和过氧化氢，过氧化氢在其他酶如过氧化氢酶(cat)和过氧化物酶(pod)等的作用下会立即将其分解为完全无害的水。从实验结果可以看出，与溶剂对照组相比，uva和uvb辐照后超氧化物歧化酶(sod)的酶活力均极显著性降低(p<0.01)，uv辐照产生氧化应激损伤，使得抗氧化酶的酶活显著性降低，进一步导致机体内积累大量自由基，从而损伤机体。然而与sc(0.1％dmsouvb+)相比，与非酶性抗氧化剂α-生育酚、l(+)-抗坏血酸、实施例1制得的五味子提取物1、实施例2制得的五味子提取物2，在测试浓度下均使超氧化物歧化酶sod的酶活力显著性升高(p<0.05)。与sc(0.1％dmsouva+)相比，非酶性抗氧化剂α-生育酚、l(+)-抗坏血酸、实施例2制得的五味子提取物2、实施例3制得的五味子提取物3在测试浓度下均使超氧化物歧化酶sod的酶活力显著性升高(p<0.05)。试验结果表明，α-生育酚、l(+)-抗坏血酸和五味子提取物均能促进sod的活性，通过促进细胞自身的抗氧化酶来防止细胞受到氧化损伤。细胞活力和ros含量是评价抗氧化功效的两个重要指标，实验结果显示，uva和uvb均会显著地增加ros含量并降低细胞活力，在uvb-角质形成细胞模型上，五味子提取物在测试浓度下均显著地提高了细胞活力，并且均降低了ros含量。在uva-成纤维细胞模型上，五味子提取物在测试浓度下，均能显著地降低ros含量并增加细胞活力。从细胞活力、活性氧量、超氧化物歧化酶活性三个指标来看，五味子提取物通过清除活性氧自由基(ros)，促进超氧化物歧化酶活性，来重建活性氧与抗过氧化物酶之间的动态平衡，进而保护细胞抵御氧化损伤，防止细胞凋亡，从而发挥抗氧化、抵御紫外线和或抗衰老的功效，且其作用在测试条件下接近或优于α-生育酚和l(+)-抗坏血酸。本发明的有益效果包括但不限于：1)本发明在提取五味子中木质素类成分的同时，提取了五味子中的黄酮类成分，对原材料的利用更加充分；2)本发明中，用人表皮角质形成细胞和人真皮成纤维细胞对五味子提取物的抗氧化功效进行了验证，并以维生素c和α-生育酚为阳性对照，五味子提取物的活性接近阳性对照。3)本发明提供的制备方法，除乙醇外未用到其它有机溶剂，安全环保。4)本发明提供的制备方法工艺操作简便，适用于工业化生产，且总收率较现有技术高。具体实施方式本发明公开了一种五味子提取物及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的五味子提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)预处理：捡除可见杂质，粉碎机粉碎，肉眼无可见的完整五味子；粉碎至90％以上的药材通过40目筛；(2)提取：包括二次提取。第一次提取：加入15～25倍五味子质量的50～80％乙醇，超声0.5～1h后回流提取0.5～2h；第二次提取：加入5～15倍五味子质量的50～80％乙醇，回流0.5～1h；(3)过滤：在真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下采用孔径为30～50μm的滤纸减压抽滤；(4)浓缩：在温度为60-80℃、真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至1～2倍药材投料量；(5)稀释上柱：浸膏冷却后加入2～5倍浸膏量30～50％的乙醇稀释，采用hpd450/sp825l树脂，树脂的用量为2～5倍投料量(湿树脂)，上样速度为2～6bv/h；(6)水洗：以速度为4～8bv/h进行水洗，水洗量为4～6bv；(7)醇洗：选用浓度为50～80％乙醇水溶液，以2～4bv/h的洗脱速度进行洗脱，洗脱量为4～6bv；(8)浓缩：在温度为60～80℃，真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至0.5～2倍药材投料量；(9)冷冻干燥：在温度为-30～-50℃，真空度为-0.06mpa～-0.08mpa的条件下真空冷冻干燥至粉末；(10)粉碎过筛：冻干后粉碎机粉碎，过100目筛。本发明提供的五味子提取物及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，五味子药材产地为吉林。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：五味子提取物1的制备方法(1)预处理：捡除可见杂质，粉碎机粉碎，肉眼无可见的完整五味子；粉碎至90％以上的药材通过40目筛；(2)提取：包括二次提取。第一次提取：加入15倍五味子质量的80％乙醇，超声0.5h后回流提取2h；第二次提取：加入15倍五味子质量的50％乙醇，回流0.5h；(3)过滤：在真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下采用孔径为40微米的滤纸减压抽滤；(4)浓缩：在温度为60℃、真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至2倍药材投料量；(5)稀释上柱：浸膏冷却后加入3倍浸膏量30％的乙醇稀释，采用hpd450树脂，树脂的用量为2倍投料量(湿树脂)，上样速度为4bv/h；(6)水洗：以速度为8bv/h进行水洗，水洗量为5bv；(7)醇洗：选用浓度为50％乙醇水溶液，以3bv/h的洗脱速度进行洗脱，洗脱量为5bv；(8)浓缩：在温度为80℃，真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至0.5倍药材投料量；(9)冷冻干燥：在温度为-40℃，真空度为-0.06mpa～-0.08mpa的条件下真空冷冻干燥至粉末；(10)粉碎过筛：冻干后粉碎机粉碎，过100目筛，得五味子提取物1。实施例2：五味子提取物2的制备方法(1)预处理：捡除可见杂质，粉碎机粉碎，肉眼无可见的完整五味子；粉碎至90％以上的药材通过40目筛；(2)提取：包括二次提取。第一次提取：加入25倍五味子质量的70％乙醇，超声1h后回流提取1.5h；第二次提取：加入5倍五味子质量的70％乙醇，回流1h；(3)过滤：在真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下采用孔径为30微米的滤纸减压抽滤；(4)浓缩：在温度为70℃、真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至1.5倍药材投料量；(5)稀释上柱：浸膏冷却后加入2倍浸膏量50％的乙醇稀释，采用sp825l树脂，树脂的用量为3.25倍投料量(湿树脂)，上样速度为6bv/h；(6)水洗：以速度为6bv/h进行水洗，水洗量为6bv；(7)醇洗：选用浓度为65％乙醇水溶液，以4bv/h的洗脱速度进行洗脱，洗脱量为6bv；(8)浓缩：在温度为70℃，真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至1.0倍药材投料量；(9)冷冻干燥：在温度为-30℃，真空度为-0.06mpa～-0.08mpa的条件下真空冷冻干燥至粉末；(10)粉碎过筛：冻干后粉碎机粉碎，过100目筛，得五味子提取物2。实施例3：五味子提取物3的制备方法(1)预处理：捡除可见杂质，粉碎机粉碎，肉眼无可见的完整五味子；粉碎至90％以上的药材通过40目筛；(2)提取：包括二次提取。第一次提取：加入20倍五味子质量的50％乙醇，超声1h后回流提取0.5h；第二次提取：加入10倍五味子质量的80％乙醇，回流1h；(3)过滤：在真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下采用孔径为50微米的滤纸减压抽滤；(4)浓缩：在温度为80℃、真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至1倍药材投料量；(5)稀释上柱：浸膏冷却后加入5倍浸膏量30％的乙醇稀释，采用hpd450树脂，树脂的用量为5倍投料量(湿树脂)，上样速度为2bv/h；(6)水洗：以速度为4bv/h进行水洗，水洗量为4bv；(7)醇洗：选用浓度为80％乙醇水溶液，以2bv/h的洗脱速度进行洗脱，洗脱量为4bv；(8)浓缩：在温度为60℃，真空度为-0.02～-0.06mpa的条件下减压浓缩至2.0倍药材投料量；(9)冷冻干燥：在温度为-50℃，真空度为-0.06mpa～-0.08mpa的条件下真空冷冻干燥至粉末；(10)粉碎过筛：冻干后粉碎机粉碎，过100目筛，得五味子提取物3。实施例4：对制得的五味子提取物进行检测4.1外观:用目视测定，与标准样品(经质检合格)对比无明显差异。4.2气味:用嗅觉评定，与标准样品对比无明显差异。4.3ph值:取本品0.1g，加dmso试剂2.0g，再加水至100g，混匀，按照ph值测定法(中国药典2015年版四部通则0631)检测，ph值应介于2.5～5.5之间。4.4干燥失重:按照干燥失重测定法(中国药典2015年版四部通则0831)烘干法测定。4.5五味子醇甲含量测定:高效液相色谱法i.色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:水(65:35)为流动相，流速(1ml/min)，柱温30℃，检测波长为250nm。ii.对照品溶液的制备:精密称取五味子醇甲适量，用甲醇溶解配制成每毫升约含五味子醇甲50μg的溶液，即得。iii.供试品溶液的制备:精密称定本品约0.2g，置于100ml容量瓶中，加适量50％甲醇溶解(必要时可超声助溶)，再用50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。iv.测定:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算；除水分后本品应含五味子醇甲不得低于3％。4.6总黄酮含量测定:紫外-可见分光光度法i.5％亚硝酸钠溶液:称取5.0g亚硝酸钠，加纯化水溶解，定容于100ml容量瓶中，摇匀，避光保存。ii.10％硝酸铝溶液:称取10.0g硝酸铝，加纯化水溶解，定容于100ml容量瓶中，摇匀，避光保存。iii.4％氢氧化钠溶液:称取4.0g氢氧化钠，加纯化水溶解，定容于100ml容量瓶中，摇匀，保存。iv.对照品溶液的制备:取芦丁对照品适量，精密称定，加85％乙醇适量超声溶解，再加85％乙醇定容至刻度，制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。v.标准曲线的制备:精密吸取芦丁标准溶液0.5ml，1.5ml，2.5ml，3.5ml，4.5ml置10ml容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠溶液0.4ml混匀，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.4ml，放置6min，再加入4％氢氧化钠溶液4ml，加水稀释至刻度，放置15min，以试剂空白为参比，在波长510nm处测定吸光度。vi.待测液的制备:精密称定本品约0.2g，置于100ml容量瓶中，加适量50％甲醇溶解(必要时可超声助溶)，再用50％甲醇定容至刻度，取1ml置10ml容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，再取1ml置10ml容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠溶液0.4ml混匀，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.4ml，放置6min，再加入4％氢氧化钠溶液4.0ml，加水稀释至刻度，放置15min，即得。vii.测定法:取上述已显色的待测溶液，以试剂空白为参比，在510nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算供试品含量(％)。viii.计算：式中:w:原样品浓度，单位(％)；c0:样品稀释后紫外检测到的浓度，单位(μg/ml)；m:称样量，单位(g)。4.7微生物限度测定:参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)中规定的检验方法测定。储存条件:置避光、阴凉、干燥处密封保存。保质期:暂定24个月。检测结果：表1表2此工艺生产制备的五味子提取物既含有五味子木脂素(五味子醇甲＞3％)，同时含有＞30％的五味子黄酮。实施例5：基于人角质形成细胞的抗氧化实验1.待测样品信息表3待测样品信息样品名称样品类型理化性质颜色储存条件溶解性五味子提取物1化妆品原料粉末紫红色常温避光dmso五味子提取物2化妆品原料粉末棕红色常温避光dmsol(+)-抗坏血酸化学品(阳性对照)粉末白色常温避光水α-生育酚化妆品原料液体淡黄色常温避光dmso2.测试系统：角质形成细胞keratinocyte，由广东博溪生物科技有限公司生产提供。实验分组与方案：参照实验分组，具体的给药方案参见表4。表43.试验步骤3.1细胞准备在6孔板中接种表皮细胞，然后将孔板置于37℃，5％co2培养箱培养过夜。3.2配液根据实验分组配制相应浓度的待测活性物，其配制分别为：五味子提取物1：先用dmso配制100mg/ml的母液，然后用kc培养液稀释1000倍得到100μg/ml的工作液，再将100μg/ml的工作液稀释5倍得到20μg/ml的工作液，同时补加dmso，使得工作液中dmso的含量为0.1％。五味子提取物2、α-生育酚和l(+)抗坏血酸配制方法同五味子提取物1，工作液中dmso的含量为0.1％。3.3给药待6孔板中的表皮细胞铺板率达到50％左右时给药。给药前将孔板进行标记，实验分为给药组和溶剂对照组，6孔板每组设5个复孔(用于sod检测)。给药后将孔板放入37℃，5％co2培养箱继续培养。3.4uvb照射给药后24h，在显微镜下观察细胞。然后将每个6孔板用pbs清洗3次后每孔加700μl/孔pbs，移入uvb辐照仪正下方的方框内，打开6孔板的盖子开始计时。照射完后再用pbs清洗细胞，清洗完后加入kc培养液，将孔板置于37℃，5％co2培养箱继续培养。3.5收样培养24h后进行收样处理，6孔板：首先弃掉旧培养基，再用pbs清洗细胞，然后每孔中加入100μlripa裂解液裂解细胞，最后用移液枪将裂解的细胞悬液收集在1.5ml的ep管中，用于sod的检测分析。3.6sod检测首先用bca检测试剂盒进行蛋白含量的测定，然后根据超氧化物歧化酶sod检测试剂盒操作说明进行sod含量的检测分析。3.7ros检测：辐照结束后用pbs清洗细胞，加入1ml/孔浓度为25μmdcfh-da探针，37℃细胞培养箱孵育30min；弃掉含dcfh-da的培养液，用pbs清洗3次，胰酶消化细胞后，pbs清洗细胞1次，加入一定量新鲜pbs重悬细胞，进行流式上机检测。3.8细胞活力检测：细胞孵育24h后弃掉上清，pbs清洗2遍，加入2mlmtt工作液，37℃避光孵育。4h后弃掉mtt工作液，每孔加1.5mldmso，进行浸提。浸提结束后，从6孔板中每孔吸取200μldmso浸提液加入空的96孔板中，每个6孔板中的孔在96孔板上设置2个复孔，于酶标仪490nm读取od值。4、统计方法应用graphpadprism作图，结果表示为mean±sd。各组间多重比较采用one-wayanova单因素方差统计分析。所有的统计分析均为双尾。p<0.05被认为具有差异显著性，其中*p<0.05**p<0.01，p值越小越显著。5.试验结果5.1sod检测结果基于uvb刺激角质形成细胞keratinocyte的氧化损伤模型，通过检测sod酶活的变化来判定待测活性物的抗氧化功效，sod的检测结果见表5。表5uvb照射后sod活力样品名称sod活力(u/mgprot)sd值p值sc(0.1％dmsouvb-)18.6830.267/sc(0.1％dmsouvb+)13.8080.3850.000****α-生育酚20μg/ml15.5921.0040.045#l(+)-抗坏血酸20μg/ml15.7100.2230.009##五味子提取物120μg/ml15.8700.6230.008##五味子提取物220μg/ml16.8710.9870.007##注：**示与sc(0.1％dmsouvb-)相比，p<0.01；##示与sc(0.1％dmsouvb+)对比，p<0.01；#示与sc(0.1％dmsouvb+)对比，p<0.05。与溶剂对照组相比，sc(0.1％dmsouvb+)中超氧化物歧化酶(sod)的酶活力极显著性降低(p<0.01)，与sc(0.1％dmsouvb+)相比，α-生育酚、l(+)-抗坏血酸、实施例1制得的五味子提取物1和实施例制得的五味子提取物2在测试浓度下均能显著地促进sod酶的活力(p﹤0.05)。5.2ros检测结果表6不同处理条件下ros含量检测结果实验结果显示，与sc(0.1％dmsouvb-)相比，sc(0.1％dmsouvb+)ros含量显著性增加。与sc(0.1％dmsouvb+)相比，α-生育酚(20μg/ml)、五味子提取物2(20μg/ml)能显著性地降低ros含量(p﹤0.05)。5.3细胞活力检测结果表7细胞活力实验结果实验结果显示，与sc(0.1％dmsouvb-)相比，sc(0.1％dmsouvb+)细胞活力显著降低。与sc(0.1％dmsouvb+)相比，α-生育酚(20μg/ml)、五味子提取物1(20μg/ml)、五味子提取物2(20μg/ml)能显著性地增加细胞活力(p﹤0.05)，对于uvb引起的角质形成细胞氧化损伤有保护作用。实施例6：基于人成纤维细胞的抗氧化实验1、待测样品信息表8待测样品信息样品名称样品类型理化性质颜色储存条件溶解性五味子提取物2化妆品原料固体紫红色常温避光dmso五味子提取物3化妆品原料固体棕红色常温避光dmsol(+)-抗坏血酸化学品(阳性对照)固体白色常温避光水α-生育酚化妆品原料液体淡黄色常温避光dmso2、测试系统：所用细胞为成纤维细胞，由广东博溪生物科技有限公司通过细胞原代、传代培养获得。实验分组与方案：实验分组参照实验分组，具体的给药方案参见表9。表9抗氧化功效评价实验分组3.试验步骤3.1sod检测①、细胞接种：取对数生长期细胞消化后接种至6孔板中，37℃，co2培养箱孵育过夜。②、受试物配制：按抗氧化功效评价实验分组(表9)配制不同浓度的受试物。③、给药处理：根据表3实验具体设计，待细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每组设6个复孔。37℃、5％的co2培养箱中孵育培养24h。④、uva辐照：弃掉旧培养液，用pbs清洗三遍，根据实验分组进行相应的uva辐照处理，其中sc(0.1％dmsouva-)组不辐照；sc(0.1％dmsouva+)和样品组进行uva辐照，辐照剂量为10j/cm2；辐照结束后用pbs清洗细胞，加入新鲜培养基，将6孔板放置在37℃、5％的co2培养箱中培养24h。⑤、收样：孵育培养24h后，弃掉孔中上清。pbs清洗细胞后将6孔板放置于冰上，每孔加入200μlripa裂解液，用移液枪将裂解的细胞悬液收集在1.5ml的ep管中，并将其贮存于-80℃，用于sod的检测分析。⑥、sod检测：首先用bca检测试剂盒进行蛋白含量的测定，然后根据超氧化物歧化酶sod检测试剂盒操作说明进行sod含量的检测分析。3.2ros检测：辐照结束后用pbs清洗细胞，加入1ml/孔浓度为25μmdcfh-da探针，37℃细胞培养箱孵育30min；弃掉含dcfh-da的培养液，用pbs清洗3次，胰酶消化细胞后，pbs清洗细胞1次，加入一定量新鲜pbs重悬细胞，进行流式上机检测。3.3细胞活力检测：细胞孵育24h后弃掉上清，pbs清洗2遍，加入2mlmtt工作液，37℃避光孵育。4h后弃掉mtt工作液，每孔加1.5mldmso，进行浸提。浸提结束后，从6孔板中每孔吸取200μldmso浸提液加入空的96孔板中，每个6孔板中的孔在96孔板上设置2个复孔，于酶标仪490nm读取od值。4、实验结果4.1sod检测结果基于uva刺激人成纤维细胞的氧化损伤模型，通过检测sod酶活的变化来判定待测活性物的抗氧化功效，sod的检测结果见表10。表10不同处理条件下sod活力的检测结果备注：以上结果使用ipp软件进行分析，分别统计各条图片的iod/area值，最后进行各组间对比。注：**示与sc(0.1％dmsouva-)对比，p<0.01。#示与sc(0.1％dmsouva+)对比，p<0.05；##示与sc(0.1％dmsouv+a)对比，p<0.01；，l(+)-抗坏血酸在浓度为20μg/ml时sod酶活力极显著性升高(p＜0.01)。实验结果显示，与sc(0.1％dmsouva-)相比，sc(0.1％dmsouva+)组sod酶活力极显著性降低(p＜0.01)；与sc(0.1％dmsouva+)相比，α-生育酚、l(+)-抗坏血酸、实施例2制得的五味子提取物2、实施例3制得的五味子提取物3在浓度为20μg/ml时sod酶活力极显著性升高(p＜0.01)。4.2ros检测结果表11不同处理条件下ros含量检测结果实验结果显示，与sc(0.1％dmsouva-)相比，sc(0.1％dmsouva+)ros含量显著性增加。与sc(0.1％dmsouva+)相比，α-生育酚(20μg/ml)五味子提取物1(20μg/ml)、五味子提取物2(20μg/ml)能显著性地降低ros含量(p﹤0.05)。4.3细胞活力检测结果表12细胞活力实验结果实验结果显示，与sc(0.1％dmsouva-)相比，sc(0.1％dmsouva+)细胞活力显著降低。与sc(0.1％dmsouva+)相比，α-生育酚(20μg/ml)、l(+)-抗坏血酸(20μg/ml)、五味子提取物1(20μg/ml)、五味子提取物2(20μg/ml)能显著性地增加细胞活力(p﹤0.05)，对于uva引起的角质形成细胞氧化损伤有保护作用。实施例7：五味子提取物的急性眼刺激试验检测方法：oecdtg437《bovinecornealopacityandpermeabilitytestmethod》(2017)1.试验材料1.1牛眼：测试当天上午取自广州地区屠宰场，并置于冰冷hbss溶液中运往实验室。1.2培养条件：32±1℃1.3试剂和对照：阳性对照(pc)：无水乙醇阴性对照(nc)：超纯水溶剂对照(sc)：5.0％dmso水溶液测试样品1(ta1)：用5.0％dmso水溶液将实施例1制得的五味子提取物1溶解为1.0％的浓度；测试样品2(ta2)：用5.0％dmso水溶液将实施例2制得的五味子提取物2溶解为2.0％的浓度；mem培养基：含1％新生牛血清(gibco,lot:1517922)的无酚红和含酚红mem培养基。hbss：含双抗荧光素钠溶液：用含ca2+和mg2+的dpbs缓冲液配制，浓度为4mg/ml。2.试验步骤2.1角膜的制备：选择无损伤的角膜沿巩膜边缘2～3mm处剪下，将角膜固定在预热的角膜夹持器上，表面朝上，前后室用预热的无酚红mem培养基填满，32±1℃培养箱中平衡1～2h。2.2测量基础浊度值：平衡结束后将角膜从培养箱中取出，以新鲜无酚红mem培养基更换前后室旧培养基。用basfopacitometer3.0浊度仪测定所有角膜基础浊度值。2.3加样：每组使用3个平行角膜，移除前室液体，于角膜上皮侧加入测试样品0.75ml(包括nc、pc和sc)，并放置于32±1℃培养箱中孵育10±1min。暴露结束后，将前室中的测试样品用含酚红mem培养基清洗至少3次至样品无残留。pc组、nc组和sc组采用相同操作。2.4后孵育：清洗后用新鲜的无酚红mem培养基填充前后室，并置于32±1℃培养箱后孵育120±5min。2.5测量暴露后浊度值：以新鲜无酚红mem培养基更换前后室旧培养基，再次用basfopacitometer3.0浊度仪测定所有角膜的浊度值。2.6渗透性测试：移除前室培养基并加入1.0ml4mg/ml荧光素钠溶液，夹持器竖直放回培养箱中孵育90±5min后，收集后室中的培养基并转移360μl/孔到96孔板中，在490nm下测定吸光度值。3.数据分析计算试验组、阳性及阴性对照组相应的浊度变化值和od值，并通过阴性对照组进行校正。按以下公式计算体外评分(ivs)：体外评分＝平均校正浊度值+15×平均校正od值ivsunghs≤3nocategory>3,<55nopredictioncanbemade≥55category14.试验结果表13急性眼刺激试验(bcop)结果组别平均校正浊度值平均校正od值ivsunghs分类nc0.355±0.1360.052±0.003------------pc18.698±2.4801.391±0.10539.564±3.408nopredictioncanbemadesc0.070±0.127-0.000±0.0020.066±0.107nocategoryta10.724±0.5740.053±0.0031.522±0.610nocategoryta20.250±0.1910.042±0.0050.882±0.144nocategory5.试验结论根据oecdtg437-2017的判定标准，在本次试验条件下，测试样品五味子提取物1(1％浓度)、五味子提取物2(2％浓度)属于为nocategory(unghs分类)，即无急性眼刺激。实施例8：五味子提取物的光毒性试验检测方法：oecdtg432invitro3t3nruphototoxicitytest1.试验材料1.1细胞系：balb/c3t3，来源：检疫局(第25代)1.2培养液：含10％新生牛血清的dmem培养基。1.3培养条件：37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养。1.4溶液及对照：阴性对照(nc)：为dmem培养液阳性对照(pc)：为十二烷基硫酸钠(sds)测试样品(ta)：用50％dmso水溶液稀释实施例3制得五味子提取物3至浓度为10％，然后采用hbss稀释为1000ppm，再依次稀释为465.12ppm、216.33ppm、100.62ppm、46.80ppm、21.77ppm、10.12ppm、4.71ppm，共8个浓度。中性红培养液：终浓度为50μg/ml，以dmem配制。中性红解吸液：按体积比配制，含冰醋酸：乙醇：超纯水＝1:50:49。2.试验步骤2.1细胞培养：将细胞以1×104个/100μl/孔的密度接种于于96孔培养板中。每次实验制备两个板，继续培养18-24h。细胞培养24h直至形成半融合单层。2.2细胞染毒：去除培养液，用150μl缓冲液轻洗两次。每孔加入100μl含适当浓度受试物或对照(溶剂和阳性对照)，在暗处孵育60min。2.3紫外暴露：两块培养板随机选择，一块为处理板(+irr)，在光毒仪下暴露50min(暴露剂量5j/cm2)，另一块作为对照板(-irr)置于暗盒室温放置50min。2.4后孵育：暴露结束后，去除溶液，用150μl缓冲液洗两次。加入100μl培养基孵育过夜(18～24h)。2.5中性红测试：相差显微镜察细胞生长情况、形态和细胞单层的完整性。记录细胞形态和生长的变化。用150μl预温的缓冲液轻洗细胞2次。加100μl含50μg/ml中性红培养液，孵育3h。孵育后，去除中性红培养液，用150μl缓冲液清洗细胞1-2次。每孔准确加入150μl中性红解吸液，避光振荡10-15min后在540nm波长下测量吸光度。2.6数据分析：数据以电子格式保存，使用phototox.usb软件进行曲线拟合，获取受试物pif值和mpe值。3.试验结果表14光毒性试验结果4.试验结论根据oecdtg432(2004)的判定标准，在本次试验条件下，测试样品“五味子提取物3”的pif值为c1.000，mpe值为-0.168，判断其不具有光毒性。实施例9：五味子提取物的单次封闭性斑贴试验1.试验材料1.1斑贴器：北京百亿怡达科技开发有限公司，批号：2018061.2试剂和对照：阴性对照(nc)：超纯水溶剂对照(sc)：2.5％dmso水溶液测试样品(ta)：用50％dmso水溶液稀释实施例1制得的五味子提取物1至浓度为10％，浓度为10％样品用纯水稀释至浓度为0.5％2.试验步骤2.1受试者表15斑贴试验受试者总人数女性男性年龄皮肤类型33201320岁—60岁正常2.2样品准备固体样品：25mg加入斑贴室中液体样品：25μl加入含有滤纸的斑贴室中粉末样品：加入足够量的蒸馏水或石蜡油，并将25mg放入斑贴室中。2.3试验内容表16斑贴试验内容2.4结果观察48小时后去除斑贴器，用清水冲洗，30分钟后进行临床观察并评分。根据表17评估红斑和水肿情况。每个受试者均有阴性对照(超纯水)，当阴性对照没有引起皮肤反应时，验证该实验数据有效。表17红斑和水肿评分表其他反应的强度(干度，脱屑率，粗糙度，反射率)根据表18评估。表18其他反应评分表分数分类0.5可疑/非常轻微1轻度2中度3重度2.5刺激性评估分类刺激指数(vii)：累加获得的评分(红斑+水肿+其他皮肤反应)平均刺激指数(mii)：累加每个受试者的刺激指数(vii)，除以受试者人数刺激指数根据表19计算。表19刺激指数表刺激指数计算方式刺激指数vii∑分数(红斑+水肿+其他反应)平均刺激指数mii∑vii/受试者总数根据表20刺激性评估分类。表20刺激评估表mii分类mii<0.25无刺激性0.25≤mii<0.50非常轻微刺激性0.50≤mii<1轻度刺激性1≤mii<2中度刺激性mii≥2刺激性4.试验结果33位受试者有3人因胶布反应中途退出测试，2位受试者测试区域一部分出现非常轻微的粉红色(e0.5)，其余28位无红斑和无水肿，评分为0。刺激指数(vii)：1.0，平均刺激指数(mii)：0.03。5.试验结论在本实验条件下，测试样品“五味子提取物1(0.5％浓度)”平均刺激指数(mii)为0.03，属于无刺激性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12