本发明涉及组织工程领域，更具体地，涉及一种合成角膜及其制备方法和应用。
背景技术：
角膜是人们认识世界的窗户，由于多种原因导致的角膜性失明，使全球每年约有1000万人因角膜疾患而致盲，重见光明的有效方法是角膜移植，然而供体角膜资源匮乏，无法满足患者的需求。随着科学技术的发展，组织工程制备的人工角膜有望成为新的角膜替代品用于治疗疾病。迄今，组组工程角膜主要有一下几种：第一种是有机物合成类，如聚羟基乙酸、壳聚糖、硫酸软骨素等加上细胞形成的有机合成角膜，这类的优点是材料来源广，缺点是机械强度不够、无角膜的曲光性，难以用于移植；第二种是临时替代类，如动物(猪、兔等)去抗原角膜支架、羊膜、丝素等天然支架加上细胞形成的角膜，优点是能满足机械强度要求，缺点是支架中角膜细胞分布不均，但对于基质层盲症患者有效(刘祖国，2012)；第三种是全层角膜类(范先群，2007)，如动物角膜、人角膜、多层角膜等，优点是拥有角膜的功能，缺点是来源限制及排斥反应。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种合成角膜的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将角膜内皮细胞穿透性接种在无菌去抗原动物角膜内皮层的基质侧，培养得到15～27μm厚的内皮层；将基质细胞穿透性接种在无菌去抗原动物角膜基质层，培养得到400～550μm厚的基质层；将角膜上皮细胞接种在无菌去抗原动物角膜上皮层的基质侧，培养得到50～68μm厚的上皮层；将所述内皮层、基质层和上皮层按照人角膜自然顺序依次叠加，联合培养即得所述合成角膜。
在本发明一个优选实施方式中，所述无菌去抗原动物角膜内皮层、所述无菌去抗原动物角膜基质层和所述无菌去抗原动物角膜上皮层来源为猪、牛或羊，优选为猪。
在本发明一个优选实施方式中，所述角膜内皮细胞的接种密度为33～81点/cm2，培养至接触度为80％～90％。
所述无菌去抗原动物角膜内皮层的厚度为10～21μm，优选为12μm。
在本发明一个优选实施方式中，所述基质细胞的接种密度为71～146点/cm2，培养至接触度为70％～80％。
所述无菌去抗原动物角膜基质层的厚度为350～490μm，优选为460μm。
在本发明一个优选实施方式中，所述角膜上皮细胞的接种密度为65～110点/cm2，培养至接触度为80％～90％。
所述无菌去抗原动物角膜上皮层的厚度为38～59μm，优选为53μm。
其中，在本发明中，无菌去抗原动物角膜基质层来源于动物角膜，机械或手工(撕去)分离内皮层和上皮层，中间层为基质层，经去抗原、灭菌即可。
其中，本发明的去抗原动物角膜内皮层、基质层和上皮层，可以使用本领域中常用的方法来除杂、除dna、除rna以及脱抗原。其中，更优选地是经过十二烷基硫酸钠、中性蛋白酶、dna酶、rna酶、无离子水等一系列处理。
其中，本发明的灭菌是去抗原的动物角膜内皮层、基质层和上皮层分别依次经过次氯酸处理7-15min，无菌水清洗，新吉尔灭处理10-20min，无菌水洗涤后再经生理盐水处理。其中，更优选地是，将得到的内皮层、基质层和上皮层依次经过0.8ppm次氯酸消毒10分钟，无菌水洗3次，0.2％新吉尔灭消毒15分钟，无菌水洗2次，医用级生理盐水处理2次，得到无菌去抗原动物角膜内皮层、基质层和上皮层。
在本发明一个优选实施方式中，所述角膜内皮细胞在含有egf和20％fbs的dmem培养基中培养。即将接种了角膜内皮细胞的无菌去抗原动物角膜内皮层在含有egf和20％fbs的dmem培养基中培养。
在本发明一个优选实施方式中，所述基质细胞在含有10％fbs的dmem培养基中培养。即将接种了基质细胞的无菌去抗原动物角膜基质层在含有10％fbs的dmem培养基中培养。
在本发明一个优选实施方式中，所述角膜上皮细胞在含有f12、egf和hcgs的dmem培养基中培养。即将接种了角膜上皮细胞的无菌去抗原动物角膜上皮层在含有f12、egf和hcgs的dmem培养基中培养。
在本发明一个优选实施方式中，上述培养条件均为：37℃，饱和湿度，5％co2培养箱中培养，每2-3天换2/3培养液，直至细胞达到接触要求，即角膜内皮细胞、基质细胞以及角膜上皮细胞的培养条件均为上述培养条件。
在本发明一个优选实施方式中，上述方法中联合培养为将所述内皮层、基质层和上皮层按照人角膜自然顺序依次叠加后，加含10％fbs的dmem培养基刚好漫过上层，培养10d以上即得所述合成角膜。
本发明所用无菌去抗原动物角膜内皮层、上皮层及基质层可以自行加工或为市售商品。
在本发明一个优选实施方式中，细胞的制备包括如下步骤：
将离体的角膜缘残块经无菌生理盐水充分清洗，以75％医用酒精中浸泡3分钟，生理盐水洗1次后，在0.1％新吉尔灭中消毒4分钟，再用pbs溶液洗2次，用机械方法剥离内皮层、上皮层、基质层，分别收集于不同的器皿中，用机械及胰酶消化法分离细胞，离心收集细胞；
将上述细胞或是市售的细胞按照不同细胞类型，用相应的培养基，在37℃，饱和湿度，5％co2培养箱中培养，每2-3天换2/3培养液，直至细胞90％接触，用胰酶-edta溶液消化收集细胞，用dmem培养基稀释到8*104/ml。
本发明的另一目的为提供由上述制备方法得到的合成角膜。
本发明的再一目的为提供上述制备方法或由上述制备方法制得的合成角膜在制备治疗角膜性失明患者的移植物中的应用。
综合考虑角膜的组织相容性、透明度、机械强度、种子细胞来源、形态、曲光度等问题，本发明得到的合成角膜利用动物角膜的支架结构，在其中及内皮层、上皮层中培养相应的细胞，以解决组织工程角膜所遇到的问题，最终培养成有生物活性的合成角膜，这种可以直接用于角膜移植，使患者重见光明。本发明中的制备方法可以实现角膜批量生产，以满足大量角膜性失明患者的移植需求。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
本实施例提供了一种合成角膜，具体制备方法如下：
1、无菌去抗原猪角膜内皮层、基质层和上皮层
1)用机械(或手撕)的方法分离猪角膜内皮层和上皮层，中间为基质层，经过十二烷基硫酸钠、中性蛋白酶、dna酶、rna酶、无离子水等一系列处理，得到去抗原的角膜内皮层、基质层和上皮层；
2)去抗原的内皮层、基质层和上皮层依次经过0.8ppm次氯酸消毒10分钟，无菌水洗3次，0.2％新吉尔灭消毒15分钟，无菌水洗2次，医用级生理盐水处理2次，得到无菌去抗原猪角膜内皮层、基质层和上皮层。也可以用刨层机分离上述三层。得到的无菌去抗原猪角膜内皮层、基质层和上皮层的厚度分别为12μm、460μm、53μm。
2、种子细胞
1)种源来自人角膜手术的缘残块或捐献者角膜；
2)将步骤1)来源的组织经无菌生理盐水充分清洗，以75％医用酒精浸泡3分钟，生理盐水洗1次后，在0.1％新吉尔灭中消毒4分钟，再用pbs溶液洗2次，用机械方法剥离内皮层、基质层、上皮层，分别收集于器皿中，分别剪碎后，在37℃条件下用胰酶消化1-2h，离心收集细胞；
3)将步骤2)所得到的角膜内皮细胞用含有egf和20％fbs的dmem培养基、基质细胞用含有10％fbs的dmem培养基、角膜上皮细胞有含有f12、egf、hcgs的dmem培养基，在37℃、饱和湿度、5％co2培养箱中培养，每3天换2/3培养液，直至细胞90％接触，用胰酶-edta溶液消化收集细胞，用dmem培养基稀释到8*104/ml。
3、合成角膜的制备方法
1)将无菌去抗原猪角膜内皮层展放于培养皿内，基质侧向上，用针按33～81点/cm2穿透性扎膜，按照0.7ml/cm2加培养基，37℃孵育1小时以上，吸去培养基，加角膜内皮细胞和培养基，培养得到厚度为23μm的内皮层；将无菌去抗原猪角膜基质层展放于培养皿内，用针按71～146点/cm2穿透性扎膜，按照1.5ml/cm2加培养基，37℃孵育1小时以上，吸去培养基，加角膜基质细胞和培养基，培养得到厚度为510μm的基质层；将无菌去抗原猪角膜上皮层展放于培养皿内，基质侧向上，用针按65～110点/cm2扎膜，按照0.7ml/cm2加培养基，37℃孵育1小时以上，吸去培养基，加角膜上皮细胞和培养基，培养得到厚度为62μm的上皮层。将接种后的各细胞在37℃、饱和湿度、5％co2培养箱中培养，每3天换2/3培养液，直至内皮层细胞和上皮层细胞达到80％～90％接触，基质层细胞达到70％～80％接触。
2)将步骤1)培养的细胞层取下，内皮层置于底层(基质侧向上)、基质层处于中间、上皮层(基质侧向下)为顶层叠放于一个新培养皿中，加含10％fbs的dmem培养基至顶层之上少许，在37℃、饱和湿度、5％co2条件下培养，每3天换一次培养基，培养12天，得到合成角膜。
3)将步骤2)合成角膜取出，根据患者实际情况，切取、修整合成角膜，此时的合成角膜即可用于移植。
实施例2
本实施例提供了一种合成角膜，具体制备方法与实施例1相同，不同仅在于，在种子细胞的步骤1)和2)中收集细胞直接来源于市售或干细胞，包括角膜内皮细胞、角膜基质细胞和角膜上皮细胞。
实施例3
本实施例提供了一种合成角膜，具体制备方法与实施例1相同，不同仅在于，本实施例中种子细胞为狗角膜细胞替代人角膜细胞，制备得到合成狗角膜。
实施例4
本实施例提供了一种合成角膜，具体制备方法与实施例1相同，不同仅在于，在合成角膜的制备方法的步骤1)中培养得到的内皮层厚度为15μm，基质层厚度为410μm，上皮层厚度为53μm。
对比例1
本对比例提供了一种合成角膜，具体制备方法与实施例1相同，不同仅在于，在合成角膜的制备方法的步骤1)中无菌去抗原猪角膜内皮层和上皮层的基质侧接种细胞时翻转，即基质侧向下接种细胞。本对比例得到的合成角膜出现明显的上、中、下分三层现象，这将导致角膜移植时出现层间分离或空泡现象，移植成功率降低。
对比例2
本对比例提供了一种合成角膜，具体制备方法与实施例1相同，不同仅在于，在合成角膜的制备方法的步骤2)中无内皮层，仅将基质层和上皮层叠加。本对比例得到的合成角膜的韧性只有实施例1的35％。
应用例1
去除双角膜盲患者一只(右)眼睛的角膜，然后移植入实施例1制备得到的合成角膜。15天后移植角膜基本透明，40天后移植角膜透明，而且后方虹膜纹理可见，视线不清，70天后视线基本清晰，移植创口组织相容性较好、韧性、曲光度与正常角膜相似；患者未移植侧(左)眼睛依然失明。
应用例2
将实施例3制得的合成狗角膜移植到狗身上检验其效果，具体方法是：用6号孔钻取合成狗角膜，放入角膜保存液中4℃保存；试验狗用100℃热棒灼烫两侧角膜各20秒，然后左侧眼睛用红霉素眼膏护理，右侧用5号孔钻去除狗角膜，移植入实施例3中的合成狗角膜。
15天后，左眼角膜混浊，透明度下降，右侧基本透明；40天后，左眼角膜不透明，右侧透明，而且后方虹膜纹理清晰可见，创口组织相容性较好，韧性、曲光度趋于正常。
对比应用例
首先用与实施例3相同的制备方法制备得到合成狗角膜，与实施例3的区别仅在于，合成狗角膜时基质层的厚度为120μm。
检验其效果的具体方法是：用6号孔钻取合成狗角膜，放入角膜保存液中4℃保存；试验狗用100℃热棒灼烫两侧角膜各20秒，并去除狗角膜，然后左侧眼睛移植入实施例3中的合成狗角膜，右侧眼睛移植入本对比应用例中的合成狗角膜。
15天后，左眼角膜基本透明，但不光滑圆润，韧性和弹力比正常低；右侧角膜基本透明，而且光滑圆润，韧性和弹力与正常相似；40天后，左、右侧角膜透明，瞳孔明显，后方虹膜纹理清晰可见，创口组织相容性较好，但左侧角膜韧性、弹力、曲光度明显低于右侧。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。