一种新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料及其制备方法与应用与流程

本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种新型的硫化铜基高效抗肿瘤复合材料及其制备方法与应用。

背景技术：

癌症是全世界死亡的主要原因，每年造成数百万人死亡。目前基于光疗的癌症治疗手段由于具有便利性和微创性引起了广泛的关注。光热疗法和光动力疗法是两种主要的光疗手段，两者均通过近红外激光激发光敏剂，高效地将光能转换成热能或产生高毒性活性氧簇(通常为羟基自由基(·oh)，单线态氧(1o²))，这两种方法均可以杀灭肿瘤细胞。因此，光热和光动力协同抗肿瘤具有客观的前景。

当前，许多无机纳米材料已被用于光热和光动力协同治疗肿瘤，如金纳米壳，金纳米棒，碳纳米管和石墨等。然而，这种组合策略往往有局限性。因为这些材料的光热疗法和光动力疗法通常需要两种不同的激发波长，导致治疗时间漫长，方法复杂。相比之下，最近发现的硫化铜纳米粒子(cusnps)已被证明在近红外激光下具有高光热转换效率，可用于癌症光热疗法。幸运的是，硫化铜纳米粒子在相同波长下通过光动力效应生成活性氧簇。此外，硫化铜纳米粒子尺寸小，生产成本低和细胞毒性低，这些优势使得硫化铜纳米粒子成为协同光热和光动力治疗肿瘤的理想材料。然而，据我们所知，光动力治疗产生活性氧簇的过程依赖于肿瘤微环境中的过氧化氢(h2o2)的含量，然而体内细胞的过氧化氢含量显著偏低，因此硫化铜纳米粒子的光动力疗法治疗肿瘤的效果并不如人所愿。因此，通过提高肿瘤微环境中的h2o2含量以增强硫化铜纳米粒子对肿瘤的光动力治疗十分必要。

作为一种关键的营养物质，葡萄糖在为肿瘤生长提供能量方面发挥了重要作用。葡萄糖氧化酶(god)可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，这为增强光动力疗法治疗肿瘤提供了可行的策略。另一方面，高效的肿瘤治疗需要将纳米载体选择性地到达特定病变位置并将药物释放到靶向肿瘤细胞或肿瘤组织中。在众多纳米载体中，介孔材料是优异的纳米结构载体，其能够在介孔结构中负载高度分散的催化材料，确保优异的反应性能和反应物或产物的自由扩散。已经证实介孔二氧化硅纳米粒子(msns)在体外和体内均具有良好的生物相容性。因此，介孔二氧化硅纳米粒子被认为是有潜力的肿瘤治疗纳米载体之一。

为拓展纳米硫化铜基材料在肿瘤治疗中的应用，本发明利用纳米硫化铜在单一波长近红外激光下的光热和光动力效应协同治疗肿瘤，并通过用将纳米硫化铜和葡萄糖氧化酶共同负载到介孔有机硅中。葡萄糖氧化酶能够将肿瘤区域的葡萄糖催化成丰富的过氧化氢，在近红外激光的激发下，过氧化氢可以被纳米硫化铜催化产生更多的活性氧簇，诱导肿瘤细胞凋亡和死亡，进一步地增强纳米硫化铜的光动力效果。这种集光热治疗、光动力治疗一体的抗肿瘤复合材料有望实现更加高效的肿瘤治疗，为纳米硫化铜基抗肿瘤药物的开发提供新方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料及其制备方法与应用。

本发明提供的制备方法在室温条件下，以海藻酸钠为模板和稳定剂绿色制备硫化铜纳米粒子，并将其与葡萄糖氧化酶共负载于介孔有机硅，制备得到集光热治疗、光动力治疗于一体的高效抗肿瘤复合材料。制得的复合材料同时利用硫化铜纳米粒子的光热效应、光动力效应，实现了更加高效的肿瘤治疗。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将氨水滴加到硫酸铜溶液中，得到铜氨络合物溶液(即[cu(nh3)4]²⁺溶液)；

(2)将步骤(1)所述铜氨络合物溶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌处理(常温)，得到复合溶液；

(3)在常温搅拌状态下将硫化钠溶液滴加到步骤(2)得到的复合溶液中，然后搅拌处理(常温)，得到硫化铜纳米粒子溶液；

(4)将介孔有机硅加入到水中，搅拌均匀得到介孔有机硅悬浮液；然后将葡萄糖氧化酶溶液与介孔有机硅悬浮液加入步骤(3)所述硫化铜纳米粒子溶液中，搅拌处理(常温)，离心取沉淀，得到所述新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料。

进一步地，步骤(1)所述氨水的质量百分比浓度为1-10wt％；所述硫酸铜溶液的浓度为0.2-3mg/ml；步骤(1)中所述硫酸铜溶液的溶质硫酸铜与氨水的溶质氨气的摩尔比为1:(1-10)。

进一步地，步骤(2)所述铜氨络合物溶液与海藻酸钠溶液之间的体积比为1:1-2；步骤(2)所述海藻酸钠溶液的浓度为1-10mg/ml。

进一步地，步骤(2)所述搅拌处理的搅拌速率为200-600rpm，搅拌时间为0.5h-5h。

进一步地，步骤(3)所述在搅拌状态下的搅拌速率为200-600rpm；所述硫化钠溶液的浓度为1-10mg/ml；所述硫化钠溶液与复合溶液的体积比为1：2-6；所述硫化铜纳米粒子溶液的浓度为0.2-3mg/ml；所述搅拌处理的搅拌速率为200-600rpm，搅拌处理的时间为0.5-2h。

进一步地，步骤(4)所述介孔有机硅与水的质量体积比为1-10：1mg/l；所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度为1-10mg/ml；步骤(4)所述硫化铜纳米粒子溶液与葡萄糖氧化酶溶液的体积比为15-30:1；所述硫化铜纳米粒子溶液与介孔有机硅悬浮液的体积比为15-30:1。

进一步地，步骤(4)所述搅拌处理的速率为200-600rpm，搅拌处理的时间为8-15h；所述离心的速率为3000-8000rpm，离心的时间为5-15min。

本发明提供一种由上述的制备方法制得新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料。

本发明提供的新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料能够应用于在杀灭肿瘤细胞。

进一步地，所述新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料的应用，包括如下步骤：

将肿瘤细胞接种细胞培养板，将所述新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料溶解于dmso溶液中，加入细胞培养板上，与肿瘤细胞共同孵育，洗涤，更换培养基，采用近红外激光照射，采用实时动态活细胞成像系统监测细胞杀伤情况。

进一步地，步骤(1)中所述硫酸铜溶液的溶质硫酸铜与步骤(2)中所述海藻酸钠溶液的溶质海藻酸钠之间的质量比为1:1-10。

进一步地，步骤(1)中所述硫酸铜溶液的溶质硫酸铜与步骤(3)中所述硫化钠溶液的溶质硫化钠之间的质量比为1:1-10。

进一步地，步骤(4)中所述硫化铜纳米粒子溶液的溶质硫化铜纳米粒子与步骤(4)中所述介孔有机硅之间的质量比为1:1-10。

进一步地，步骤(4)中所述葡萄糖氧化酶溶液的溶质葡萄糖氧化酶与介孔有机硅的质量比为1：1-10。

本发明提供的一种由上述的制备方法制得新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的制备方法利用纳米硫化铜光热效应、光动力效应，并通过葡萄糖氧化酶的加入增强光动力效应，制得新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料，该材料有很好的抗肿瘤效果。

(2)本发明提供的的制备方法，步骤简单、成本低廉、绿色高效。

附图说明

图1a为实施例2制得的硫化铜纳米粒子的tem图；

图1b为实施例2制得的硫化铜纳米粒子的粒径分布图；

图2a为实施例2制得的硫化铜纳米粒子溶液的紫外吸收光谱图；

图2b为实施例2制得的硫化铜纳米粒子的xrd谱图；

图3a和图3b均为实施例2的介孔有机硅的tem图；

图3c和图3d均为实施例2制得的葡萄糖氧化酶和硫化铜纳米粒子共同负载于介孔有机硅的tem图(不同放大倍数)；

图4a为实施例2制备的复合材料在不同浓度下的光热响应曲线；

图4b为实施例2制备的复合材料在不同激光功率下的光热响应曲线；

图5a为实施例2制备的复合材料在使用2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物作捕捉剂在有无葡萄糖或有无近红外激光下的顺磁共振波谱；

图5b为实施例2制备的复合材料在近红外激光下催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色紫外定量分析图；图5c为根据图5b拟合的曲线；

图5d为复合材料在使用5,5-二甲基-1-呲咯啉-n-氧化物作捕捉剂在有无葡萄糖或有无近红外激光下的顺磁共振波谱；

图5e为实施例2制备的复合材料在近红外激光下催化1,3-二苯基异苯并呋喃褪色紫外定量分析图；图5f为根据图5e拟合的曲线；

图5g为实施例2制备的复合材料在不同葡萄糖浓度下葡萄糖氧化酶催化生成过氧化氢的酶促反应动力学曲线；图5h为由5g拟合的michaelis–mentenkinetics拟合方程；图5i为由5g拟合的linerweaver-bruker拟合方程；

图6a为实施例2肿瘤细胞在加入复合材料前的细胞成像图；

图6b为实施例2肿瘤细胞在加入复合材料24h后的细胞成像图；

图6c肿瘤细胞在给药加入复合材料24h后经808nm、1.5w/cm²的近红外激光照射5min的细胞成像图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。

实施例1

实施例1提供的一种新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制浓度为0.4mg/ml的硫酸铜溶液，质量分数为1％的氨水，将氨水滴加到30ml的硫酸铜溶液中，所述硫酸铜溶液的溶质硫酸铜与氨水的溶质氨气的摩尔比为1:1，搅拌均匀制得铜氨络合物溶液；

(2)配制浓度为1mg/ml海藻酸钠溶液，然后与铜氨络合物溶液混合，常温下以200rpm的转速搅拌混合0.5h，铜氨络合物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:1，得到复合溶液；

(3)在常温以200rpm的速率搅拌状态下将质量浓度为2mg/ml的硫化钠溶液滴加至上述复合溶液中，所述硫化钠溶液与复合溶液的体积比为1:2，滴加完毕后搅拌处理即得到硫化铜纳米粒子溶液，搅拌处理的时间为0.5h，搅拌处理的速率为200rpm；

(4)将浓度为0.2mg/ml的硫化铜纳米粒子溶液、浓度为1mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液与浓度为2mg/ml的介孔有机硅悬浮液室温下搅拌混合，搅拌速率为200rpm，搅拌时间为15h，三者体积比为15:1:1，经3000rpm离心5min后取沉淀中得到所述新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料。

实施例2

实施例2提供的一种新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制浓度为1mg/ml的硫酸铜溶液，质量分数为2.5％氨水，将氨水滴加到30ml的硫酸铜溶液中，所述硫酸铜溶液的溶质硫酸铜与氨水的溶质氨气的摩尔比为1:2，搅拌均匀制得铜氨络合物溶液；

(2)配制浓度为4mg/ml海藻酸钠溶液，然后与铜氨络合物溶液混合，常温下以400rpm的转速搅拌混合3h，铜氨络合物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:1，得到复合溶液；

(3)在常温以400rpm的速率搅拌条件下将质量浓度为5mg/ml的硫化钠溶液滴加至上述复合溶液中，所述硫化钠溶液与复合溶液的体积比为1:4，滴加完毕后搅拌处理即得到硫化铜纳米粒子，搅拌处理的时间为1h，搅拌处理的速率为400rpm；

(4)将浓度为0.8mg/ml的硫化铜纳米粒子溶液、浓度为3mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液与浓度为4mg/ml的介孔有机硅悬浮液室温下搅拌混合，搅拌速率为400rpm，搅拌时间为9h，三者体积比为20:1:1，经5000rpm离心10min后于沉淀中得到所述新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料。

实施例3

实施例3提供的一种新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制浓度为2mg/ml的硫酸铜溶液，质量分数为5％的氨水，将氨水滴加到30ml的硫酸铜溶液中，所述硫酸铜溶液的溶质硫酸铜与氨水的溶质氨气的摩尔比为1:5，搅拌均匀制得铜氨络合物溶液；

(2)配制浓度为5mg/ml海藻酸钠溶液，然后与铜氨络合物溶液混合，常温下以400rpm的转速搅拌混合3h，铜氨络合物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:1.5，得到复合溶液；

(3)在常温以400rpm的速率搅拌条件下将质量浓度为7mg/ml的硫化钠溶液滴加至上述复合溶液中，所述硫化钠溶液与复合溶液的体积比为1:4，滴加完毕后搅拌处理即得到硫化铜纳米粒子溶液，搅拌处理的时间为1h，搅拌处理的速率为400rpm；

(4)将浓度为1.5mg/ml的硫化铜纳米粒子溶液、浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液与浓度为7mg/ml的介孔有机硅悬浮液室温下搅拌混合，搅拌速率为400rpm，搅拌时间为10h，三者体积比为：20:1:1，经4000rpm离心10min后于沉淀中得到所述新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料。

实施例4

实施例4提供的一种新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制浓度为2.5mg/ml的硫酸铜溶液，质量分数为10％氨水，将氨水滴加到30ml的硫酸铜溶液中，所述硫酸铜溶液的溶质硫酸铜与氨水的溶质氨气的摩尔比为1:10，搅拌均匀制得铜氨络合物溶液；

(2)配制浓度为10mg/ml海藻酸钠溶液，然后与铜氨络合物溶液混合，常温下以600rpm的转速搅拌混合5h，铜氨络合物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2，得到复合溶液；

(3)在常温以600rpm的速率搅拌条件下将质量浓度为9mg/ml的硫化钠溶液滴加至上述复合溶液中，所述硫化钠溶液与复合溶液的体积比为1:6；滴加完毕后搅拌处理即得到硫化铜纳米粒子溶液，搅拌处理的时间为2h，搅拌处理的速率为600rpm；

(4)将浓度为2.5mg/ml的硫化铜纳米粒子溶液、浓度为9mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液与浓度为8mg/ml的介孔有机硅悬浮液室温下搅拌混合，搅拌速率为600rpm，搅拌时间为8h，三者体积比为30:1:1，经8000rpm离心5min后于沉淀中得到所述新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料。

结果分析：

图1a为实施例2制得的硫化铜纳米粒子的tem图。从图1a可知，本发明提供的方法制得的硫化铜纳米粒子分散均匀、尺寸稳定，粒径约10nm，从高倍照片中可以明显看到纳米粒子的晶格条纹；图1b为实施例2制得的硫化铜纳米粒子的粒径分布，所得纳米粒子粒径分布窄，平均粒径为12.9nm。其他实施例效果与实施例2相似，可参照图1a与图1b。

图2a为实施例2制得的硫化铜纳米粒子溶液的紫外吸收光谱图，从图2a可知，本发明提供的方法制备的硫化铜纳米粒子具有强烈的近红外吸收，与硫化铜纳米粒子的吸收峰位置基本相同(acsnano,2015,9(7):7085-7096)；图2b为实施例2制得的硫化铜纳米粒子的xrd谱图，出现了明显的特征衍射峰，分别对应(101)，(102)，(103)，(006)，(105)，(110)，(108)，(202)，(116)晶面，这与标准卡片jcpds(no.06-0464)相一致，符合硫化铜的晶型。其他实施例效果与实施例2相似，可参照图2a及图2b。

图3a、图3b为实施例2硫化铜纳米粒子与葡萄糖氧化酶共负载于介孔有机硅制得的复合物的tem图，图3c和图3d均为实施例2制得的葡萄糖氧化酶和硫化铜纳米粒子共同负载于介孔有机硅的tem图；从图3a、图3b、图3c及图3d可知，粒径约100nm的介孔有机硅纳米颗粒表面凹凸不平，并具有介孔结构；将硫化铜纳米粒子和葡萄糖氧化酶填充于有机硅的介孔结构后，其表面变得相对光滑、饱满。

从图4a、图4b可以知道实施例2制备的复合材料的体外光热响应性能。图4a复合材料在相应不同硫化铜纳米粒子浓度下的光热响应曲线，由图可以看出，复合材料的浓度越高光热响应性越强。图4b为复合材料不同激光功率下的光热响应曲线，由图可以看出，激光功率越高越高光热响应性越强。图4a及图4b说明所制备的硫化铜基复合材料具有光热效应，能够把近红外激光的能量转换为热能，可应用于光热疗法治疗肿瘤。

图5a为实施例2制备的复合材料使用2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物作捕捉剂在有无葡萄糖或有无近红外激光下的顺磁共振波谱，由图5a可以看出，无近红外激光激发，复合材料均不产生峰，而在近红外激光激发下产生1:2:2:1的峰，说明有羟基自由基(·oh)产生，并且加了葡萄糖后峰的强度显著增强，说明葡萄糖的加入有助于羟基自由基产生。图5b、图5c分别为实施例2制备的复合材料在近红外激光下催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色紫外定量分析图和拟合的曲线，由图5b、图5c可见，在近红外激光照射下，复合材料产生的产生羟基自由基(·oh)能够随着时间递增，且复合一级反应动力学模型。图5d为实施例2制备的复合材料使用1,3二苯基异苯并呋喃作捕捉剂在有无葡萄糖或有无近红外激光下的顺磁共振波谱，由图5d可以看出，无近红外激光激发，复合材料均不产生峰，而在近红外激光激发下产生1:1:1的峰，说明有单线态氧(1o²)产生，并且加了葡萄糖后峰的强度显著增强，说明葡萄糖的加入有助于单线态氧产生。图5e、图5f分别为实施例2制备的复合材料在近红外激光下催化1,3二苯基异苯并呋喃褪色的紫外定量分析图和拟合的曲线，由图5b、图5c可见在近红外激光照射下，复合材料产生的单线态氧(1o²)能够随着时间递增，且符合二级反应动力学模型。图5g为实施例2制备的复合材料氧化葡萄糖产生过氧化氢的酶促反应动力学曲线，过氧化氢产生的量由质量分数为5％硫酸钛溶液根据标准曲线计算得出。由图5g可知实施例2制备的复合材料由于加入了葡萄糖氧化酶，能够随着葡萄糖的加入催化产生过氧化氢，且随着葡萄糖量的增加，过氧化氢的量也增加。图5h、图5i分别为根据图5g拟合的michaels-menten曲线和linerweaver-bruker曲线，能够说明复合材料的酶促反反应符合米氏动力学的模型。从这些图上可看出，实施例2所制备的硫化铜基复合材料具有光动力效果，并能在葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖为双氧水的条件下进一步增强光动力效果，可以应用于光动力疗法治疗肿瘤。其他实施例效果与实施例2相似，可参照图5a、图5b、图5c、图5d、图5e、图5f、图5g、图5h及图5i。

选择人乳腺癌细胞(mcf-7)作为体外实验的靶细胞，采用实时动态活细胞成像系统(incucytezoomreal-timelive-cellimagingsystem,essenbioscience)对体外肿瘤细胞杀灭效果进行考察。将mcf-7乳腺癌肿瘤细胞接种到黑色96孔细胞培养板上，实验时先采用生理盐水对细胞洗涤3次。将实施例2制得的新型硫化铜基高效抗肿瘤的复合材料溶解在dmso中(浓度为6.25μg/ml)，与细胞共同孵育24h；近红外激光照射前，mcf-7细胞经pbs清洗2遍，并换完全培养基(含血清)，然后采用1.5w/cm²的近红外激光，照射细胞5min。此后，对细胞增殖情况以及细胞毒性和细胞杀伤进行监测。图6a、图6b及图6c均为实施例2制得的复合材料用于体外肿瘤治疗的细胞成像图。图6a为肿瘤细胞在给药前没有出现死亡/坏死细胞成像图；图6b为肿瘤细胞在给药24h后，复合材料有进入肿瘤细胞内部的，也有黏附在肿瘤细胞表面的，肿瘤细胞仍然没有出现死亡/坏死的细胞成像图；图6c为肿瘤细胞在给药24h后经808nm、1.5w/cm²的近红外激光照射5min的细胞成像图，从图6c可得到，肿瘤细胞发出荧光，细胞死亡率几乎达到100％。其他实施例效果与实施例2相似，可参照图6a、图6b及图6c。

综上分析可知，本发明提供的制备方法利用海藻酸钠作模板合成硫化铜纳米粒子，并将其与葡萄糖氧化酶共同负载于介孔有机硅中，制备出一种新型的硫化铜基高效抗肿瘤复合材料。此复合材料具有良好的光热转换效果和光动力效果，并能在葡萄糖氧化酶的存在下进一步增强光动力效果，体外细胞实验表面其抗肿瘤效果优异，在肿瘤治疗方面有巨大的应用潜力。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。