免疫调节剂Y-320的新应用、一种抗肿瘤药物组合物的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及免疫调节剂y-320的新应用，即免疫调节剂y-320在作为抗肿瘤化疗药物耐药增敏剂中的应用，以及一种抗肿瘤药物组合物。

背景技术：

癌症是严重威胁人类生命健康的第一大“杀手”，已成为世界范围内亟待解决的公共健康问题。最新研究提示2018年，全球恶性肿瘤新发病例约1810万例，死亡病例约960万例，中国分别约占23.7％和30％。

目前恶性肿瘤的主要治疗手段有手术、放疗和化疗等。对于被确诊为晚期肿瘤的患者而言，化疗是个较好的选择，可能是帮助患者延长生存时间和提高预后生活质量的唯一选择。然而肿瘤耐药往往造成化疗失败，从而导致患者病情恶化甚至死亡。肿瘤耐药分为原发性耐药和获得性耐药。统计数据表明，每年死亡的肿瘤患者中，属原发性耐药的约占61％，属获得性耐药的约占33％。从某种意义上说，90％以上肿瘤患者的死亡与肿瘤耐药相关。因此，如何克服肿瘤耐药是成功治疗恶性肿瘤急需解决的关键问题之一。

肿瘤多药耐药(multidrugresistance，mdr)的产生是一个多机制联合作用的结果，包括abc转运子超家族成员的异常增多，耐药基因的异常表达，药物作用靶点下调等，其中mdr是肿瘤化疗失败的主要原因之一。多年以来，科研工作者对肿瘤耐药的逆转开展了广泛研究。研究证实许多化合物可以在体外有效逆转mdr高表达所导致的肿瘤耐药，主要包括钙离子通道拮抗剂(维拉帕米、尼卡地平，满尼地平)，环孢素类衍生物(环孢菌素)，喹啉类衍生物(奎宁、奎尼丁)，黄酮类衍生物(黄酮醇、异黄酮)、雌激素调节剂类(三苯氧胺、托瑞米芬)等。

il-15可以有效刺激cd4⁺t细胞生成il-17，研究发现免疫调节剂y-320能够有效抑制这一过程，其ic50为20-60nm。免疫调节剂y-320的结构式如下所示：

目前，没有文献报道y-320增强其他抗肿瘤化疗药物有效杀伤耐药肿瘤细胞。

技术实现要素：

本发明提供了免疫调节剂y-320的一种新应用。

免疫调节剂y-320在作为抗肿瘤化疗药物耐药增敏剂中的应用。

优选的，肿瘤为肝癌、胰腺癌、胆管癌或乳腺癌。

优选的，抗肿瘤化疗药物为紫杉醇、长春瑞滨或阿霉素。

优选的，使用时免疫调节剂y-320与抗肿瘤化疗药物联合使用。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，包括抗肿瘤化疗药物和增敏剂，所述增敏剂为免疫调节剂y-320。

优选的，抗肿瘤化疗药物为紫杉醇、长春瑞滨或阿霉素。

本发明经研究发现，免疫调节剂y-320联合紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素等抗肿瘤药物能够有效杀死耐药肿瘤细胞。体外实验选择500nm免疫调节剂y-320对多药耐药肿瘤细胞bads-200的细胞增殖只有较轻抑制作用。单用紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素，bads-200细胞的半数致死量(ic50)分别是1148.1±13.1nm，6736.1±69.4nm，192129.6±463.0nm。500nmy320分别与紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素联合用药后，紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素对bads-200细胞ic50分别是351.9±91.0nm，326.4±90.3nm，5523.3±290.7nm。其逆转系数分别是3.26、20.64、34.79。体外实验选择500nmy-320对多药耐药肿瘤细胞bats-72的细胞增殖亦只有较轻抑制作用。单用紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素，bats-72细胞的ic50分别是152.8±19.6nm，26250.0±694.4nm，1099.5±476.4nm。500nmy-320分别与紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素联合用药后，紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素对bats-72细胞ic50分别是16.2±1.7nm，1111.1±416.7nm，324.1±163.7nm。逆转系数分别是9.43、23.63、3.39。体内实验5mg/kgy-320对于多药耐药肿瘤细胞bats-72异植瘤无明显抑制生长作用，15mg/kg紫杉醇单独作用对bats-72异植瘤的抑制率为6.5％，而两者联合用药的抑制率是77.1％。

本发明研究发现，通过药物媒介将y-320与紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素等抗肿瘤药物组合，用于制备新型抗肿瘤组合药物，有效杀伤肿瘤细胞。其中y-320是所述抗肿瘤药物的增敏剂或耐药逆转剂，所述肿瘤包括所述的肿瘤包括肝癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌等。为有效治疗肿瘤提供新的途径和手段。

附图说明

图1为y-320对bads-200、bats-72细胞毒性检测结果图。

图2为y-320显著增强紫杉醇对bats-72细胞在体内的杀伤作用结果图，其中a：裸鼠肿瘤实物图；b：裸鼠肿瘤质量比较柱状图；c：裸鼠肿瘤生长曲线图。

具体实施方式

实施例1

y-320对bads-200、bats-72细胞毒性检测，选择无明显细胞毒性的安全浓度。

1、实验材料

细胞株：乳腺癌耐药细胞株bads-200、bats-72。

试剂耗材：rpmi-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(hyclone)，100mm培养皿(corning)，96孔板(bd)，mtt(sigma)，dmso(上海国药)，y-320(mce)。

仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。

2、实验方法

bads-200、bats-72细胞分布接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板，每孔总细胞数为4000个；培养24h，加入y-320(处理浓度为10、20、50、100、200、500、1000nm)处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

3、实验结果

结果见图1，500nm的y-320处理72h后，bads-200、bats-72细胞的存活率均大于80％。这说明y-320低于500nm时，处理72h对bads-200、bats-72没有明显的杀伤作用。本发明选择500nmy-320作为增敏剂的安全作用浓度，分别与紫杉醇、长春瑞滨和阿霉素联合用药，检测y-320多化疗药物的增敏作用。

实施例2

y-320显著增强紫杉醇、阿霉素、长春瑞滨对bads-200细胞的杀伤作用。

1、实验材料

细胞株：乳腺癌耐药细胞株bads-200。

试剂耗材：rpmi-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(hyclone)，100mm培养皿(corning)，96孔板(bd)，mtt(sigma)，dmso(上海国药)，y-320(mce)，紫杉醇(索莱宝)，阿霉素(大连美仑)，长春瑞滨(大连美仑)。

仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。

2、实验方法

bads-200细胞接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板的第2-11列，每孔总细胞数为4000个；培养24h，第2列不加任何试剂，第3-11列的细胞每孔都分别依次加入5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nm紫杉醇/0.5、1、2、5、10、20、50、100、200um阿霉素/20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000nm长春瑞滨，同时第4-6行细胞每孔都分别加入500nm的y-320，共处理处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

3、实验结果

表1

结果见表1，体外实验选择500nmy-320对多药耐药肿瘤细胞bads-200的细胞增殖只有较轻抑制作用。单用紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素，bads-200细胞的半数致死量(ic50)分别是1148.1±13.1nm，6736.1±69.4nm，192129.6±463.0nm。500nmy320分别与紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素联合用药后，紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素对bads-200细胞ic50分别是351.9±91.0nm，326.4±90.3nm，5523.3±290.7nm。其逆转系数分别是3.26，20.64，34.79。这些数据证明500nmy-320与紫杉醇、阿霉素、长春瑞滨联合用药，可以显著降低ic50浓度，增强这三种化疗药物对bads-200细胞的杀伤作用。

实施例3

y-320显著增强紫杉醇、阿霉素、长春瑞滨对bats-72细胞的杀伤作用。

1、实验材料

细胞株：乳腺癌耐药细胞株bats-72。

试剂耗材：rpmi-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(hyclone)，100mm培养皿(corning)，96孔板(bd)，mtt(sigma)，dmso(上海国药)，y-320(mce)，紫杉醇(索莱宝)，阿霉素(大连美仑)，长春瑞滨(大连美仑)。

仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。

2、实验方法

bats-72细胞接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板的第2-11列，每孔总细胞数为4000个；培养24h，第2列不加任何试剂，第3-11列的细胞每孔都分别依次加入1、2、5、10、20、50、100、200、500nm紫杉醇/20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000nm阿霉素/0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50um长春瑞滨，同时第4-6行细胞每孔都分别加入500nm的y-320，共处理处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

3、实验结果

表2

结果见表2，体外实验选择500nmy-320对多药耐药肿瘤细胞bats-72的细胞增殖亦只有较轻抑制作用。单用紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素，bats-72细胞的ic50分别是152.8±19.6nm，26250.0±694.4nm，1099.5±476.4nm。500nmy-320分别与紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素联合用药后，紫杉醇、长春瑞滨及阿霉素对bats-72细胞ic50分别是16.2±1.7nm，1111.1±416.7nm，324.1±163.7nm。逆转系数分别是9.43，23.63，3.39。500nmy-320与紫杉醇、阿霉素、长春瑞滨联合用药，可以显著降低ic50浓度，增强这三种化疗药物对bats-72细胞的杀伤作用。

实施例4

y-320显著增强紫杉醇对bats-72细胞在体内的杀伤作用。

1、实验材料

细胞株：乳腺癌耐药细胞株bats-72。

实验动物：4-5周龄无胸腺裸鼠(浙江大学动物房)。

试剂耗材：rpmi-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(hyclone)，100mm培养皿(corning)，y-320(mce)，紫杉醇(索莱宝)。

仪器：细胞培养箱，超净工作台等。

2、实验方法

bats-72接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液；0.25％胰酶消化，用pbs收集细胞，并调节浓度至1×10⁷/ml，将细胞注入无胸腺裸鼠双侧腋下。注入后1天，随机分为4组，采用不同的治疗方案:(1)空白对照组(ctl组)；(2)单独使用y-320，5mg/kg，尾静脉注射(y-320组)；(3)单用紫杉醇，按照15mg/kg，尾静脉注射(ptx组)；(4)y-320与紫杉醇联合用相同的治疗方案(y+p组)。每3天重复一次，共6个周期。每3天测量肿瘤直径(宽度和长度)和小鼠体重，直到动物被处死。动物处死后，切除肿瘤组织并称重。

3、实验结果

结果见图2，体内实验5mg/kgy-320对于多药耐药肿瘤细胞bats-72异植瘤无明显抑制生长作用，15mg/kg紫杉醇单独作用对bats-72异植瘤的抑制率为6.5％，而两者联合用药的抑制率是77.1％。这些数据证明y-320与紫杉醇联合用药，可以显著增强紫杉醇对bats-72细胞在体内的杀伤作用。