包含乌地那非作为活性成分的用于增强脂肪干细胞的生发诱导能力的组合物的制作方法

本申请要求2018年5月30日提交的韩国专利申请第10-2018-0062118号的优先权，本申请参考引用了上述申请的全部内容。

该研究得到了国家研究基金会(nrf-2016r1d1a1b03932050)的资助。nc也得到了韩国政府资助的国家研究基金会(nrf-2017r1a6a3a11035599)的支持。

本发明涉及通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞的生发诱导能力的增强效果，以及通过在上述脂肪干细胞中表达水平增加的白细胞介素-4(il-4)以及白细胞介素-12b(il-12b)的生发诱导能力的增强效果，同时，提供包含通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞作为活性成分的用于预防、治疗脱发或用于促进生发的组合物。

背景技术：

首先，人的毛发起到保护头皮免受紫外线等外部刺激的防御作用，并用于表现人的外在形象的美感。然而，在现代社会中，由于环境污染和强紫外线等自然因素、压力及荷尔蒙失衡等生理学因素，频繁发生脱发现象，而且，与过去局限于成年男性不同，不论男女老少都出现脱发现象，因此迫切需要用于预防及治疗其的材料。

作为产生毛发的身体内的生理器官的毛囊(hairfollicle)参与毛发的生长至维持、脱落过程，重复毛发生长周期，可使毛发生长及维持。最近，随着脱发现象增加，并对促进生发及毛发生长的需求增加，对毛囊活性的关注也随之增加。

目前，fda批准的可促进生发及毛发生长的代表性药物有米诺地尔(minoxidil)和非那雄胺(finasteride)。然而，这些药物具有全身生毛以及性功能降低等副作用，具体的作用机制尚不明确。因此，目前致力于开发促进在毛囊中毛乳头细胞的增殖、增加生长因子的表达并对人体稳定的药物。

能够起到这种稳定的药物作用的候选物，可以提出脂肪干细胞。脂肪来源干细胞(adipose-derivedstemcells)为间充质干细胞，其表现出皮肤伤口愈合及抗老化的效果。据报告，通过用缺氧或维生素c预处理的脂肪干细胞，确认小鼠的毛发生长周期由休止期转变为生长期，脂肪干细胞可诱导毛发再生能力(非专利文献1、非专利文献2)。另外，曾有报告，可通过调节脂肪干细胞的活性，可进一步增加脂肪干细胞具有的生发诱导能力(专利文献1)。

因此，本发明人致力于开发在具有毛发生长促进效果的脂肪干细胞中，能够进一步增强毛发生长的诱导能力的方法，结果，当通过处理乌地那非(udenafil)来培养脂肪干细胞时，确认脂肪干细胞中白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的表达水平增加，脂肪干细胞诱导毛囊细胞的成熟并可增加生发诱导能力，并确认白细胞介素-4以及白细胞介素-12b也自行诱导毛囊细胞的成熟，进而可增加毛发生长的诱导能力，从而完成了本发明。

现有技术文献

专利文献1：kr10-1686229b1

非专利文献1：won，chonghyun，etal.“脂肪组织来源干细胞对毛发生长的促进作用”皮肤科学杂志57.2(2010)：134-137。

非专利文献2：kim，jihye，etal.“维生素c对脂肪干细胞增殖和预处理作用的分子机制”干细胞和发育23.12(2014)：1364-1376。

技术实现要素：

本发明的目的为提供可进一步增强脂肪干细胞所表示的毛发生长的诱导能力的方法。

本发明的再一目的为提供包含生发诱导能力进一步增加的脂肪干细胞的，用于预防、治疗脱发或用于促进生发的组合物。

本发明的另一目的为提供在生发诱导能力进一步增加的脂肪干细胞中表达水平增加的因子，即，包含白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的用于预防、治疗脱发或用于促进生发的组合物。

本发明的还一目的为提供包括在添加有乌地那非(udenafil)或其药学上可接受的盐的培养基中培养脂肪干细胞的步骤的脂肪干细胞的增殖方法。

本发明的又一目的为提供包括预防、治疗脱发或促进生发的方法，上述方法包括处理乌地那非(udenafil)或其药学上可接受的盐的脂肪干细胞或培养液施用于个体的步骤。

为了实现上述目的，本发明提供包含乌地那非(udenafil)或其药学上可接受的盐作为活性成分的用于增强脂肪干细胞的生发诱导能力的组合物。

并且，本发明提供脂肪干细胞的增殖方法，包括在添加有乌地那非(udenafil)或其药学上可接受的盐的培养基中培养脂肪干细胞的步骤。

在本发明的优选一实施例中，上述乌地那非可具有以下化学式1的结构。

化学式1

在本发明的优选一实施例中，上述乌地那非可以诱导脂肪干细胞中白细胞介素-4以及白细胞介素-12b表达水平增加。

在本发明的优选一实施例中，上述乌地那非可以以0.1μm至1mm的浓度处理于脂肪干细胞。

并且，本发明提供包含通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞或其培养液作为活性成分的，用于预防、治疗脱发或用于促进生发的药学组合物。

并且，本发明提供预防、治疗脱发或促进生发的方法，上述方法包括将用以乌地那非或其药学上可接受的盐的脂肪干细胞或培养液施用于个体的步骤。

并且，本发明提供用于预防、改善脱发或用于促进生发的化妆品组合物，上述组合物通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞或其培养液作为活性成分。

并且，本发明提供用于预防、治疗脱发或用于促进生发的药学组合物，上述组合物包含在通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞中表达水平增加的细胞因子作为活性成分。

同时，本发明提供用于预防、改善脱发或用于促进生发的化妆品组合物，上述组合物包含在通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞中表达水平增加的细胞因子作为活性成分。

在本发明的优选一实施例中，上述细胞因子可以为选自由白细胞介素-4以及白细胞介素-12b组成的组中的一种以上。

本发明提供包含乌地那非(udenafil)作为活性成分的，用于增强诱导脂肪干细胞的毛发生长的组合物。当在脂肪干细胞培养基中通过处理乌地那非进行培养时，脂肪干细胞中白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的表达水平增加，从而可通过进一步促进毛囊细胞的成熟来诱导毛发生长。相对于通过未处理乌地那非来培养的脂肪干细胞所表现的诱导能力，这种生发诱导能力显著增加，因此，通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞可使用为用于预防、改善脱发或用于增强毛发生长组合物的活性成分。并且，当将在通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞中所表达的白细胞介素-4以及白细胞介素-12b涂敷于皮肤组织时，可以诱导毛发生长，因此白细胞介素-4以及白细胞介素-12b可作为用于预防、改善脱发或用于增强毛发生长组合物的活性成分来使用。

附图说明

图1为在将通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞皮下注射的小鼠背部中确认生发效果的结果。

图2为观察将通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞皮下注射的小鼠背部的毛囊组织的结果。

图3为确认在通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞中表达的白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的信使核糖核酸(mrna)表达水平的结果。

图4为在涂敷白细胞介素-4肽或白细胞介素-12b肽的小鼠背部中确认毛发生长效果的结果。

图5为通过在从小鼠鼻中获得的毛囊细胞处理白细胞介素-4肽或白细胞介素-12b肽来确认毛发生长诱导效果的结果。

图6为确认通过处理乌地那非的脂肪干细胞的增殖及迁移的增加的结果。图6的a部分：乌地那非处理后7天期间的生存细胞数确认结果；图6的b部分-d部分：通过处理乌地那非的细胞迁移的确认结果；图6的e部分：通过处理乌地那非的血管形成确认结果。

图7为确认处理白细胞介素-4或白细胞介素-12b的脂肪干细胞的增殖及迁移效果的结果。图7的a部分：处理白细胞介素-4或il12b后7天期间的生存细胞数确认结果；图7的b部分-e部分：通过处理乌地那非的细胞迁移确认结果。

图8为通过处理白细胞介素-4或白细胞介素-12b的毛乳头细胞的增殖效果的确认结果。

具体实施方式

以下，对本发明中使用的术语进行说明。

本发明的术语“脱发”是指毛发完全脱落在头皮外的现象。正在处于脱发中的人，具有生长期变短、休止期长的毛发周期，在本发明中的通过处理乌地那非来培养的脂肪干细胞可通过增加用于诱导毛囊细胞的成熟的诱导能力来诱导毛发的生长，从而显示改善脱发效果。

本发明的术语“生发”是指毛发从头皮生长出来，具体是指通过在脱发的部位或没有毛发的部位(无毛部位)形成毛囊来诱导毛发生长。这与在本领域中表示毛发的长度变长(即，毛发生长)的“育发”或“养发”具有相同的含义。

以下，对本发明进行详细说明。

本发明提供包含乌地那非(udenafil)作为活性成分的，用于增强脂肪干细胞的生发诱导能力的组合物。

并且，本发明提供脂肪干细胞的增殖方法，上述方法包括在添加有乌地那非或其药学上可接受的盐的培养基中培养脂肪干细胞的步骤。

本发明的乌地那非为5型磷酸二酯酶抑制剂(pde5inhibitor)，当通过阴茎海绵体动脉流入到平滑肌时，可通过抑制5型磷酸二酯酶的活性并防止细胞内环磷酸鸟苷(cgmp)的非活性化，来使活性持续很长时间，从而可促进对性刺激的勃起反应，因此一直被用作勃起功能障碍的治疗剂。更具体地，优选地，上述乌地那非具有以下化学式1的结构。

化学式1

当将上述乌地那非通过在脂肪干细胞的培养液中处理来进行培养时，可诱导脂肪干细胞的刺激，由此，可使脂肪干细胞的白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的表达水平增加。具体地，优选地，上述乌地那非以0.1μm至1mm的浓度处理于脂肪干细胞，但并不限于此，可由本领域技术人员以适当的浓度调节并添加至脂肪干细胞的培养液中。

本发明的组合物可包含乌地那非的药学上可接受的盐。当将上述乌地那非以药学上可接受的盐的形态使用时，由药学上可接受的游离酸(freeacid)形成的酸加成盐是有用的。酸加成盐从无机酸，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸或亚磷酸、无毒有机酸，如脂肪族单羧酸酯及二羧酸酯、苯基-取代的链烷酸酯、羟基链烷酸酯及链烷二酸酯、芳香族酸类、脂肪族磺酸、芳香族磺酸类获得。这种药学上无毒的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、溴化物、碘化物、氟化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸酯、甲酸酯、异丁酸酯、癸酸酯、庚酸酯、丙炔酸酯、草酸酯、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、丁炔-1，4-二酮、己烷-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸酯、羟基苯甲酸酯、甲氧基苯甲酸酯、邻苯二甲酸酯、对苯二甲酸酯、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、乙酸苯酯、丙酸苯酯、丁酸苯酯、柠檬酸酯、乳酸酯、β-羟基丁酸酯、乙醇酸酯、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐或者扁桃酸盐。

本发明的酸加成盐可通过常规的方法获得，例如，将上述乌地那非溶解于过量的酸性水溶液中，并将此盐可通过使用甲醇、乙醇、丙酮或乙腈等水混溶性有机溶剂进行沉淀来制备。通过加热相同量的乌地那非及水中的酸或醇，然后蒸发并干燥此混合物，或通过抽滤析出的盐来制备。

并且，可通过使用碱制备药学上可接受的金属盐。例如，碱金属或碱土金属盐通过以下方法获得，即，例如，将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤不溶性化合物盐，并蒸发、干燥滤液来获得碱金属或碱土金属。此时，在制药上用金属盐制备钠盐、钾盐或钙盐比较合适。并且，通过将碱金属或碱土金属盐与适当的银盐(例如，硝酸银)反应获得相应的银盐。

并且，本发明的上述乌地那非不仅包含药学上接受的盐，还包含可通过常规方法制备的所有盐、水合物以及溶剂化物。

本发明的加成盐可通过常规的方法制备，例如，可以将乌地那非溶解于丙酮、甲醇、乙醇或乙腈等水混溶性有机溶剂中，加入过量的有机酸或加入无机酸的酸水溶液之后，通过沉淀或结晶来制备。随后，在此混合物中，蒸发溶剂或过量的酸并进行干燥以获得加成盐，或者可通过抽滤析出的盐来制备。

并且，本发明提供用于预防、治疗脱发或用于促进生发的药学组合物，其包含通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞或其培养液作为活性成分。

在本发明中，“脱发”或“脱发疾病”根据形态、症状或原因包括斑秃(alopeciaareata)、雄性遗传脱发(androgeneticalopecia)、休止期脱发(telogeneffluvium)、创伤性、拔毛癖(trichotilomania)、压力性性(pressurealopecia)等生长期脱发、秕糠性、梅毒性(alopeciasyphlltiac)、脂溢性脱发(alopeciaseborrhecia)、症状性、非瘢痕性、瘢痕性以及以及先天性脱发等，但并不限于此。

关于上述乌地那非以及其药学上可接受的盐，已有描述过用于增强脂肪干细胞的生发诱导能力的组合物，因此省略重复描述。

在将本发明的组合物用作药物的情况下，在临床给药时，包含处理乌地那非或其药学上可接受的盐的脂肪干细胞作为活性成分的药学组合物可以通过以各种口服或非口服的形式制剂化来给药，但不限于此。

例如，用于口服给药的制剂具有片剂、丸剂、硬/软胶囊、液剂、悬浮剂、乳化剂、糖浆、颗粒、酏剂等，这些剂型除活性成分外还可包含稀释剂(如：乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)、润滑剂(如：二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，可根据情况可包含淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐等崩解剂或沸腾混合物和/或吸收剂、着色剂、香味剂以及甜味剂。

可非口服给药包含处理本发明的乌地那非或其药学上可接受的盐的脂肪干细胞作为活性成分的药学组合物，上述可非口服给药可通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮给药等注射的方法。此时，优选地，可根据所适用的疾病的种类确定给药途径。例如，本发明的医药组合物用于促进生发或用于预防及治疗脱发，因此，优选地，以局部施用于皮肤的方式给药。因此，本发明的用于促进生发的医药组合物优选为用于局部给药的注射剂，但并不限于此。为了制剂化成用于非口服给药的剂型，可通过将上述脂肪干细胞与稳定剂或缓冲剂一同混合于水来制备成溶液或悬浮液，可将其制备成安瓿或小瓶单位剂型。上述组合物被灭菌和/或可包含防腐剂、稳定剂、水和剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂等助剂以及其它治疗上有用的物质，并可根据常规方法之混合、颗粒化或涂敷方法制备。

优选地，当本发明的医药组合物包含有效量的脂肪干细胞或其培养液时，可提供用于预防、治疗脱发或生发促进效果。在本发明中，“有效量”是指具有用于预防、治疗脱发或生发促进效果的组合物的量。包含在本发明的组合物的脂肪干细胞或其培养液的有效量可根据组合物作为商品化的形态、上述化合物施用于皮肤的方法以及在皮肤上停留的时间等而不同。例如，在上述组合物作为用于预防或治疗脱发的准药品来进行商品化的情况下，相对于日常在皮肤上使用的化妆品的商品化，可包括更高浓度的脂肪干细胞或其培养液。

同时，本发明提供用于预防、改善脱发或用于促进生发的化妆品组合物，其包含通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞或其培养液作为活性成分。

同时，本发明提供的用以乌地那非或其药学上可接受的盐处理的脂肪干细胞或其培养液也可以作为用于预防、改善脱发或用于促进生发的医药品来提供。

关于上述乌地那非以及其药学上可接受的盐，已有描述过用于增强脂肪干细胞的生发诱导能力的组合物，因此省略重复描述。

本发明的化妆品组合物包含处理乌地那非或其药学上可接受的盐的脂肪干细胞或其培养液作为活性成分，与皮肤学上可接受的赋形剂一同可制备成基础化妆品组合物(化妆水、乳霜、精华、如洗面奶及卸妆水等洗颜剂、面膜、身体护理油)、彩妆组合物(粉底、口红、睫毛膏、粉底)、头发产品组合物(洗发水、护发素、修护润发精华素、啫喱水)以及香皂等形态。此外，能够以适当的化妆品组合物的剂型来提供，例如，悬浮液、微乳液、微胶囊、微粒或离子形式(脂质体)、非离子卵泡分散剂形式、软膏、精华、喷雾剂或遮瑕棒等形态。并且，也可以以泡沫(foam)形态或还包含压缩的推进剂的浮质组合物的形态制备。

上述赋形剂可包括但不限于皮肤软化剂、皮肤渗透增强剂、着色剂、芳香剂、乳化剂、增稠剂以及溶剂。并且，还可包括香料、色素、杀菌剂、抗氧化剂、防腐剂及保湿剂等，并可包括用于改善物性的增稠剂、无机盐、合成高分子材料等。例如，在利用本发明的化妆品组合物制备洗颜剂以及香皂的情况下，可通过将上述脂肪干细胞或其培养液添加到普通洗颜剂及香皂基质中来容易地制备。在制备乳霜的情况下，可通过将脂肪干细胞添加到典型的水包油型(o/w)的乳霜基质中来制备。可以进一步添加香料、螯合剂、色素、抗氧化剂、防腐剂等和用于改善物性的蛋白质、矿物质、维生素等合成材料或天然材料。

包含在本发明的化妆品组合物的脂肪干细胞或其培养液的含量不限于此，但是，相对于整个组合物总重量，优选为0.001重量百分比至10重量百分比，更优选为0.01重量百分比至5重量百分比。在上述含量小于0.001重量百分比的情况下，不能期待所预期的用于预防、改善脱发或生发促进效果，在大于10重量百分比的情况下，在安全性或制剂上的制备方面具有困难。

当将本发明的脂肪干细胞或其培养液用作化妆品组合物或准药品组合物的活性成分来使用时，可以直接添加表现出用于预防、改善脱发或促进生发促进效果的上述脂肪干细胞或其培养液，或与其他准药品或准药品成分一同使用，也可以按照普通方法适当地使用。可以根据用途适当确定活性成分的混合量。

本发明的用于预防、改善脱发或用于促进生发的准药品对其剂型没有特别的限制，作为表现出用于预防、改善脱发或生发促进效果，能够以本领域公知的准药品的形态来进行各种剂型化。上述作为剂型化的产品具有隔离霜、防晒霜、防晒乳、防晒喷雾、生发油、生发水，发膏，喷雾型发胶、摩丝、发胶、修护润发精华素、洗发水、护发素、发膜、焗油膏、眉毛增长剂、睫毛增长剂、睫毛营养剂、宠物洗发水、宠物护发素、洗手液、洗涤肥皂、肥皂、消毒清洁剂、湿巾、面膜、软膏、贴剂或过滤填料等，包括所有普通意义上的准药品。

并且，本发明提供用于预防、治疗脱发或用于促进生发的药学组合物，其包含在通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞中表达水平增加的细胞因子作为活性成分。

同时，本发明提供用于预防、改善脱发或用于促进生发的化妆品组合物，其包含在通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞中表达水平增加的细胞因子作为活性成分。

关于上述乌地那非以及其药学上可接受的盐，已有描述过用于增强脂肪干细胞的生发诱导能力的组合物，因此省略重复描述。

关于本发明的药学组合物或化妆品组合物，已有描述过关于包含上述通过处理乌地那非或其药学上可接受的盐来培养的脂肪干细胞或其培养液的组合物，因此省略重复描述。

在本发明的药学组合物或化妆品组合物中，上述细胞因子是指在处理乌地那非的培养基培养的脂肪干细胞中信使核糖核酸(mrna)或肽(蛋白质)的表达水平增加的细胞因子。具体而言，更优选地，上述细胞因子为白细胞介素-4、白细胞介素-12b或其两者，但并不限于此。

以下，将参照实施例更详细说明本发明。对于本领域的普通技术人员而言，这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围不应被这些实施例所限制是显而易见的。

实施例1

确认乌地那非(udenafil)对生发的促进效果

确认通过乌地那非刺激的脂肪干细胞能否表现出毛发增殖诱导效果。

1-1.确认通过乌地那非受刺激的脂肪干细胞对毛发生长的诱导效果

首先，对脂肪干细胞预处理乌地那非来制备受刺激的脂肪干细胞。在100nm培养皿中接种并培养脂肪干细胞(adiposestemcell)，第二天，在培养基中处理1μm的乌地那非并进一步培养3天或4天。然后，使用胰蛋白酶消化贴壁培养的脂肪干细胞后，用离心机获得。在100μl的磷酸盐缓冲液(pbs)中，将获得的脂肪干细胞混合并制备。

然后，完全除去6周龄的c3h小鼠的背部毛发，将上述制备好的脂肪干细胞向每个小鼠通过皮下注射注入1×10⁴。注射后15天期间，观察小鼠的背部并确认毛发的生长，然后剃刮毛发后称重并拍照。

其结果，如图1所示，确认了在注射了预处理乌地那非的脂肪干细胞的小鼠实验组(asc^udenafil)中具有毛发生长的效果，其显著高于注射了未经预处理脂肪干细胞的小鼠实验组(asc^ctrl)。

1-2.观察根据通过乌地那非刺激的脂肪干细胞的毛囊细胞组织

为了进行组织学分析制备了组织样品。将在上述实施例1-1中完成观察的小鼠背部的皮肤切成长度×宽度＝1cm×1cm的正方形后，在常温下的福尔马林中浸泡1天以固定组织。第二天，将其置于样品收集盒中并在流水中洗涤15分钟后，制备了石蜡块。

使用美尔血清素(mayerhematoxilin)方法，用苏木精-伊红(h&e)染色法对制备好的组织的石蜡块进行染色后观察了组织。将石蜡块静置于65℃温度下的培养基中10分钟左右以溶解石蜡后，在3次不同的二甲苯中各浸泡10分钟后，在100％、90％、80％以及70％的乙醇中依次浸泡1分钟以洗涤，最后在水中洗涤3分钟左右。然后，在苏木素(hematoxylin)中浸泡9分钟左右，在流水中洗涤3分钟，再次，在曙红y(eosiny)中浸泡90秒左右，并在流水中洗涤3分钟。再次，在70％、80％、90％以及100％的乙醇中依次浸泡2分钟以脱水，并在二甲苯中浸泡10分钟共3次后，在常温下进行干燥并盖上盖玻片以制作观察载玻片。用显微镜观察了观察载玻片并确认了染色的毛囊细胞的组织。

其结果，如图2所示，确认了相对于未注射脂肪干细胞的对照组(control)以及直接注射未经预处理乌地那非的脂肪干细胞的对照组(asc^ctrl)的毛囊细胞组织，在注射预处理乌地那非的脂肪干细胞的实验组(asc^unadefil)中增加了成熟毛囊细胞。

实施例2

确认通过乌地那非刺激脂肪干细胞的效果

2-1.确认通过乌地那非的生长因子的表达水平的变化

确认了在处理乌地那非的脂肪干细胞中可以表现生发效果，此外，为了具体确认生发效果是否由处理乌地那非的脂肪干细胞引起的，确认了毛发生长因子之白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的表达水平。

具体地，如在上述实施例1-1中的执行，在脂肪干细胞中处理并培养乌地那非。完成培养后，获得细胞并通过处理三唑(美国英杰(invitrogen)生命技术有限公司出品，纽约(ny)，美国(usa))来从细胞中提取了核糖核酸(rna)。将提取的核糖核酸(rna)作为模板，使用多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸(oligodt)以及helixcript^tm热反向转录系统(thermoreversetranscriptionsystem)(美国纳米螺旋(nanohelix)公司出品，威斯康星州(wi)，美国(usa)))通过反转录聚合酶链式反应(pcr)合成互补脱氧核糖核酸(cdna)，将合成的互补脱氧核糖核酸(cdna)以及brightgreenqpcrmastermix-rox(美国爱必梦(abm)公司出品，纽约(ny)，美国(usa))通过添加到用于确认生长因子的实时荧光定量核酸扩增检测系统(qpcr)分析96孔板[rt²互补脱氧核糖核酸第一链合成试剂盒(rt²firststrandcdnasynthesiskit)(美国凯杰(qiagen)公司出品，马里兰州(md)，美国(usa)]中，来执行实时荧光定量核酸扩增检测系统(qpcr)反应。使用对应于由qiagen提供的rt²互补脱氧核糖核酸第一链合成试剂盒(rt²firststrandcdna)的程序来分析实时荧光定量核酸扩增检测系统(qpcr)的执行结果，并分别确认处理乌地那非的脂肪干细胞内白细胞介素-4及白细胞介素-12b的表达水平。

其结果，如图3所示，确认了相对于未处理乌地那非的脂肪干细胞(对照(control))，在处理乌地那非的脂肪干细胞中，白细胞介素-4的信使核糖核酸(mrna)表达水平高约4倍左右，白细胞介素-12b的信使核糖核酸(mrna)表达水平高约6倍左右。

2-2.确认白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的生发效果

由于在上述实施例2-1中，确认了处理乌地那非的脂肪干细胞中，白细胞介素-4及白细胞介素-12b的表达水平增加，因此，还确认了白细胞介素-4或白细胞介素-12b本身具有的毛发生长的诱导效果。

具体地，完全除去6周龄的c3h小鼠的背部毛发，将100ng/ml的白细胞介素-4肽或白细胞介素-12b肽每天一次涂敷于小鼠背部。涂敷白细胞介素-4肽或白细胞介素-12b肽13天至14天并确认毛发的生长之后，拍照片并获得背部皮肤组织，用苏木精-伊红(h&e)染色并观察了组织。

其结果，如图4所示，确认了施用白细胞介素-4肽或白细胞介素-12b肽的小鼠的背部生发效果增加，毛囊组织也明显成熟。

2-3.确认白细胞介素-4以及白细胞介素-12b的毛发生长的诱导效果

并且，通过解剖5周龄的c57b1/6小鼠的鼻子毛囊以获得毛囊细胞，并转移至48孔培养板，然后将白细胞介素-4肽或白细胞介素-12b肽以5ng/ml浓度或20ng/ml浓度进行处理并培养3天。完成培养后，拍摄毛囊组织并测定从此生长的毛发的长度。

其结果，如图5所示，确认了当将鼻子毛囊细胞与白细胞介素-4或白细胞介素-12b一同培养时，相对于未处理组，从毛囊细胞生长的毛发的长度更长，从而确认了白细胞介素-4以及白细胞介素-12b具有毛发生长的诱导效果。

实施例3

对脂肪干细胞的增殖及迁移的乌地那非的效果

3-1.培养人体脂肪来源干细胞

如先前研究中所述(kimetal.，2007；yietal.，2014)，人脂肪干细胞(humanascs)通过皮下脂肪抽离：简言之，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤脂肪，加入0.075％胶原酶并将混合物培养45分钟。在37℃温度下，轻轻摇动。离心后，利用100μm的尼龙网过滤沉淀物。然后，用含有α最低必需培养基(α-mem)(美国海克隆(hyclone)公司出品，洛根(logan)，犹他州(ut)，美国(usa))、10％的胎牛血清(fbs)及1％的抗生素(美国吉布科(gibco)公司出品)的必需培养基传代培养细胞3代。然后，将培养基更换为α最低必需培养基、10％的胎牛血清和1％的青霉素/链霉素(美国吉布科(gibco)公司出品)，传代4次。对于所有实验，脂肪干细胞使用第5～7代。利用流式细胞术进行脂肪干细胞的表征。脂肪干细胞对cd44、cd73、cd90、cd105、人白细胞抗原(hla)-i和足糖萼蛋白样蛋白(podxl)呈阳性，但是对cd34和cd45等造血标志物呈阴性(kimetal.，2007)。如前一项研究(yietal.，2014)所述，检测了多能分化潜能，脂肪干细胞可分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。在37℃的温度下，将脂肪干细胞维持在加湿的5％的co2培养箱中。

3-2.分析细胞生长(cellgrowthassay)

对于细胞生长分析，将脂肪干细胞以每孔板5×10³个细胞接种在12孔板中，用乌地那非(0.1μm、0.5μm或1μm)处理并培养7天。脂肪干细胞又以每孔板1×10⁴个细胞接种于12孔板中，用合成肽，将白细胞介素-4或白细胞介素-12b(100ng/ml)处理并培养7天。然后将细胞使用胰蛋白酶消化，用台盼蓝(美国西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品，密苏里州(mo)，美国(usa))染色，并使用血细胞计数器每天计数。

3-3.分析划痕伤口-愈合(scratchwound-healingassay)

将脂肪干细胞接种到6孔板中并培养至融合。使用无菌的1ml的移液管尖端刮擦细胞单层。然后用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤培养物以除去细胞，再将细胞与乌地那非、白细胞介素-4以及白细胞介素-12b在无血清培养基中培养3天。使用蔡司(zeiss)observer.d1显微镜观察细胞向划痕区域(伤口闭合)的迁移。每孔板获取多个图像，并在3天内监测伤口内的平均细胞数。

3-4.分析穿透小室迁移(transwellmigrationassay)

将脂肪干细胞接种到60mm的平板中并用乌地那非、白细胞介素-4或白细胞介素-12b处理3天。将饥饿1天(1.5×10⁴细胞/孔板)的脂肪干细胞悬浮在无血清培养基中并接种在预涂有基质胶(1/60稀释液，美国碧迪(bd)公司的基质胶，加利福尼亚州(ca)，美国(usa))的穿透小室膜插入物(美国碧迪(bd)falcon(bdfalcon，加利福尼亚州(ca)，美国(usa))的上侧。将具有胎牛血清的正常血清加入下板作为化学引诱物。将培养物培养1天以允许向穿透小室迁移。然后移除插入物，并使用棉签清洁其上表面并用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤以除去非迁移细胞。将插入物用0.1％的福尔马林/10％的结晶紫溶液(美国西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品)染色20分钟，并在蔡司(zeiss)observer.d1显微镜下分析细胞数。每个插入物获得多个图像(15～20)，并计算平均细胞计数。

3-5.分析使用基质胶的管形成(tubeformationassayusingmatrigel)

在试验中，用基质胶(1/2稀释液，bd基质胶，美国加利福尼亚州)包被12孔板并在37℃温度下干燥2小时。将用内皮细胞基础培养基-2(ebm-2，美国龙沙(lonza)公司出品，马里兰州(md)，美国(usa))和乌地那非处理的脂肪干细胞涂布在涂有基质胶的孔板中，并在37℃温度下培养16小时。使用蔡司(zeiss)observer.d1显微镜分析管的数量。

3-6.确认根据乌地那非的处理脂肪干细胞的增殖以及迁移效果

尽管脂肪干细胞分泌促进毛发生长的各种生长因子(wonetal.，2010；festaetal.，2011；jeongetal.，2013；kimetal.，2014；kimetal.，2015；jinetal.，2016)，但使用生发药预处理脂肪干细胞尚未得到促进毛发生长的需求。首先，研究了乌地那非对人类脂肪干细胞生长和迁移的影响。计算了乌地那非治疗后7天的活细胞数，发现乌地那非时间和剂量依赖性地增加脂肪干细胞生长(图6的a部分)。为了研究乌地那非对脂肪干细胞迁移的影响，使用插入和划痕伤口愈合测定进行了穿透小室迁移测定。结果显示，在两种测定中，乌地那非剂量依赖性地增加脂肪干细胞(图6的b部分-d部分)。最初，认为在脂肪干细胞中应用预处理的乌地那非可通过抑制环磷酸鸟苷降解来刺激血管扩张并增加血流量(gopaletal.，2001)。因此，检查了乌地那非是否影响脂肪干细胞中的血管形成。结果显示，16小时后，乌地那非增加了新生管的数量(图6的e部分)，表明脂肪干细胞管形成活性增加。总之，这些结果表明，乌地那非可通过增强脂肪干细胞增殖和迁移来促进毛发生长。

实施例4

确认白细胞介素-4以及白细胞介素-12b对脂肪干细胞的增殖以及迁移的效果

为了检查白细胞介素-4和白细胞介素-12b是否影响脂肪干细胞增殖，在白细胞介素-4或白细胞介素-12b处理后追踪活细胞数7天。发现白细胞介素-12b时间和剂量依赖性性地增加脂肪干细胞增殖，而白细胞介素-4不是(图7的a部分)。

此外，为了探索白细胞介素-4和白细胞介素-12b是否影响脂肪干细胞迁移，进行了穿透小室迁移和划痕伤口愈合测定。两种测定均显示白细胞介素-4和il12b剂量依赖性地增加脂肪干细胞迁移(图7的b部分-e部分)。

总之，这些结果表明白细胞介素-4和白细胞介素-12b可通过增加脂肪干细胞迁移和部分增殖来促进毛发生长。为了阐明乌地那非处理的脂肪干细胞中白细胞介素-4和白细胞介素-12b的增加如何在毛发合成细胞如毛乳头细胞(dp细胞)中起作用，检测了白细胞介素-4和白细胞介素-12b对毛乳头细胞的影响。实际上，每种白细胞介素-4或白细胞介素-12b蛋白的处理都会增加毛乳头细胞的生长(图8)。上述结果表明从脂肪干细胞释放的白细胞介素-4或白细胞介素-12b增加了毛乳头细胞的生长，从而刺激毛发生长。