上消化道内菌群改善剂的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及上消化道内菌群改善剂。

背景技术：

上消化道由口腔、咽、食管、胃、十二指肠组成，上消化道疾病会给人们的日常生活和工作带来严重的影响。上消化道疾病的首要致病因素就是幽门螺杆菌(helicobacterpylori)，幽门螺旋杆菌是一种微需氧、单级、末端圆钝的螺旋弯曲的细菌，为革兰氏阴性，定植于宿主的胃部，是世界范围内最常见的传染性病原菌之一，人体在感染幽门螺杆菌后，会出现消化道黏膜的侵袭因素与防御因素失衡的情况，因此极易罹患各种上消化道疾病。幽门螺杆菌感染具有潜伏期长及导致的临床症状较为隐蔽等特点，极易被感染者忽视，从而对其健康造成较大的危害。正常情况下人体的胃内的ph大约在1～2，因此极少有细菌能够在胃中存活下来，而幽门螺杆菌能够在此环境下生存主要是依靠其能够产生具有强大活性的脲酶，该种酶即使在胃液中也可以充分发挥分解胃液中少量的尿素而产生氨的作用，在幽门螺杆菌周围形成一片“氨云”，中和胃酸保护细菌不被胃酸杀灭。脲酶占据整个细菌可溶蛋白的10％～15％，其不仅是区别于其他胃肠道微生物的主要特征，也是重要的定植和致病因子，与多种上消化道疾病的发生有密切关系。因此研究幽门螺旋杆菌的最佳有效根除方法对消化道疾病的防治有很重要意义。一方面西药抗生素疗法很容易引起胃肠道菌群失调、而停药后反复发作再感染、特别是耐药菌株迅速增加等一系列副作用问题日益增多。另一方面近年来中医药在治疗幽门螺旋杆菌感染方面的优势逐渐凸显出来。所以研究中药对于幽门螺旋杆菌的根除的有效性对中医方法防治慢性胃炎及其它胃肠道疾病具有重要意义，也可以对制定具有确切疗效和有中医特色的规范化胃癌二级预防治疗方案提供科学依据。授权公告号为cn103356600b的发明专利提供chukrasoneb在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用，chukrasoneb可用于急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病的治疗及在制备治疗急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡药物中得到应用。授权公告号为cn102215852b的发明专利提供对与幽门螺杆菌相关的疾病的治疗、预防或改善有效的、含有唇形科植物、特别是香薷、青紫苏、野拔子的提取物作为有效成分的抗幽门螺杆菌活性剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种含有红景天苷和酪醇的植物提取物在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途，植物提取物中红景天苷和酪醇的提取率高，能高选择性地抑制脲酶活性，对幽门螺杆菌具有优异的生存抑制作用、除菌/排菌作用，可应用于抗幽门螺杆菌的药物中，所制改善剂能抑制幽门螺杆菌的生存及其脲酶活性，维持胃微生态的平衡，改善上消化道内菌群。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

含有红景天苷和酪醇的植物提取物在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途。

脲酶不仅是幽门螺旋杆菌区别于其它胃肠道微生物的主要特征，而且是幽门螺旋杆菌在胃中赖以生存的关键酶，在致病中起决定作用，而镍离子及相关辅助蛋白对脲酶活性极其重要，阻断脲酶活性位点上的镍离子与脲酶亚基的结合能有效抑制脲酶活性。本发明用植物提取物中红景天苷和酪醇的共同存在能够有效下调与镍离子转运的脲酶相关基因表达，阻断脲酶成熟过程，从而高选择性地抑制脲酶活性，而对胃肠道常见革兰氏阳性菌和阴性菌不产生抑制作用；同时对幽门螺杆菌具有优异的增殖抑制作用、除菌/排菌作用，且不影响肠道正常菌群的生长，具有较高的安全性，可应用于抗幽门螺杆菌的药物中，开拓了红景天苷及其苷元酪醇的新用途，为抑制幽门螺杆菌药物提供了新选择。植物提取物的最小抑菌浓度范围为20-200μg/ml。

优选地，含有红景天苷和酪醇的植物提取物为所述抗幽门螺杆菌的药物的有效成分之一或唯一有效成分。

优选地，含有红景天苷和酪醇的植物提取物为红景天属提取物、越桔属提取物、杜鹃花属提取物、女贞属提取物中的一种或几种组合。红景天属、越桔属、杜鹃花属、女贞属等植物中均存在红景天苷和酪醇。另外，本发明中使用的植物可以是采集后的新鲜的状态或经干燥的状态中的任一状态。

优选地，含有红景天苷和酪醇的植物提取物的制备方法为：

将植物粉末中加入提取溶剂，混合均匀后超声波提取获得提取液，稀释后离心，上清液经微滤膜过滤，即可。

更优选地，提取液通过如下方法获得：将乙二醇和高丝氨酸在水中均匀混合，在60-90℃下加热搅拌至形成透明液体，然后在40-50℃下放置10-15h，即可。由于红景天苷和酪醇的极性差异，很难找到一种可以高效同步提取红景天苷和酪醇的溶剂，从而导致酪醇提取不充分，残留于提取残渣中造成资源浪费。本发明所用提取液的黏度和表面张力较低，亲水性和流动性较好，待提取物的传质速率越快且其极性与红景天苷和酪醇相近，提高红景天苷和酪醇在提取液中达到饱和状态时的量，溶出更多的红景天苷和酪醇，从而实现较高提取率的红景天苷和酪醇的同步提取；此外，本发明所用提取液与红景天苷和酪醇均存在较强的氢键相互作用，使得红景天苷和酪醇能够快速分散到提取液中，提高红景天苷和酪醇的提取率。

更优选地，提取液的含水量为40-60％，乙二醇和高丝氨酸的摩尔比1:0.5-0.8。

更优选地，料液比1:10-15(g/ml)，提取温度40-60℃，提取时间10-60min。更进一步优选地，料液比1:12-13(g/ml)，提取温度45-55℃，提取时间20-30min，此条件下，植物为红景天时，红景天苷的提取率至少为21.15mg/g，酪醇的提取率至少为1.81mg/g，由此获得的植物提取物具有更佳的抑制幽门螺杆菌及其脲酶活性的作用，最小抑菌浓度范围为20-50μg/ml，在浓度50μg/disc时能够产生直径45-55mm的抑菌圈。

本发明还提供上消化道内菌群改善剂，包括，上述含有红景天苷和酪醇的植物提取物。本发明改善剂具有抑制幽门螺杆菌的生存及其脲酶活性的作用，维持胃微生态的平衡，进而改善上消化道内菌群，可以简便地进行制造，成本低且安全性高，对人而言，每日给予量为10-500g，给予后2周内发挥上消化道内菌群改善效果，具有速效性，对腹部痛、胃积食、烧心(胃灼热)等功能性胃肠病、或胃食道反流症等上消化道障碍有效。上述改善剂不仅可以直接服用，还可以制成饮食品、健康辅助食品、保健功能食品、补品等功能性食品。

优选地，改善剂用于幽门螺旋杆菌阳性者。

优选地，上消化道内菌群改善是指上消化道内幽门螺旋杆菌减少。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)本发明用植物提取物中红景天苷和酪醇的提取率高，能够有效下调脲酶结构基因urea和ureb的表达，抑制脲酶辅酶基因uree，ureh以及镍离子转运基因nixa，从而阻断镍离子转运入脲酶前体的活性中心的途径，抑制其成熟有关；同时抑制尿素转运基因urei，减少尿素与脲酶的接触，进而抑制其分解作用，从而高选择性地抑制脲酶活性；

2)本发明用植物提取物对幽门螺杆菌具有优异的生存抑制作用、除菌/排菌作用，且不影响肠道正常菌群的生长，具有较高的安全性，可应用于抗幽门螺杆菌的药物中，开拓了红景天苷及其苷元酪醇的新用途，为抑制幽门螺杆菌药物提供了新选择；

3)本发明改善剂具有抑制幽门螺杆菌生存及其脲酶活性的作用，维持胃微生态的平衡，进而改善上消化道内菌群，可以简便地进行制造，成本低且安全性高，具有速效性，对腹部痛、胃积食、烧心(胃灼热)等功能性胃肠病、或胃食道反流症等上消化道障碍有效。

本发明采用了上述技术方案提供上消化道内菌群改善剂，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1为本发明试验例1中红景天苷和酪醇的提取率测定结果；

图2为本发明试验例2中植物提取物体外抑制幽门螺杆菌的试验结果；

图3为本发明试验例3中植物提取物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的抑制作用；

图4为本发明试验例3中植物提取物对幽门螺杆菌脲酶相关基因表达的影响。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

除非另外说明，本发明中所公开的试验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。

红景天苷(c14h22o7，(4-羟基-苯基)-β-d-吡喃葡萄糖苷)相对分子质量300.3，无色透明针状结晶(乙醇)，溶点158-160℃，溶于水、乙醇、正丁醇，微溶于丙酮、乙醚，分子结构式如下：

酪醇(c8h10o2，对羟基苯乙醇)，白色晶体，相对分子质量为138.0分子结构式如下：

本发明的发明人经过大量实验探索实验发现，红景天苷和酪醇共同存在的植物提取物，能够抑制幽门螺杆菌及其脲酶活性，维持胃微生态的平衡，改善上消化道内菌群，从而可以用于治疗幽门螺杆菌感染，特别是用于幽门螺杆菌感染导致的上消化道疾病，在此基础上完成了该发明。

实施例1：

含有红景天苷和酪醇的植物提取物的制备方法：

1)将摩尔比1:0.5的乙二醇和高丝氨酸在水中均匀混合，在60℃下加热搅拌至形成透明液体，然后在40℃下放置10h，即得提取液，提取液的含水量为40％；

2)按料液比1:12(g/ml)将红景天粉末中加入提取溶剂，混合均匀后在温度为45℃、超声波功率为40w下超声波提取20min获得提取液，稀释后离心，上清液用水稀释4倍，并经0.45μm经微滤膜过滤，即得含有红景天苷和酪醇的植物提取物。

实施例2：

含有红景天苷和酪醇的植物提取物的制备方法：

1)将摩尔比1:0.8的乙二醇和高丝氨酸在水中均匀混合，在90℃下加热搅拌至形成透明液体，然后在50℃下放置15h，即得提取液，提取液的含水量为60％；

2)按料液比1:13(g/ml)将红景天粉末中加入提取溶剂，混合均匀后在温度为55℃、超声波功率为50w下超声波提取30min获得提取液，稀释后离心，上清液用水稀释6倍，并经0.45μm经微滤膜过滤，即得含有红景天苷和酪醇的植物提取物。

实施例3：

含有红景天苷和酪醇的植物提取物的制备方法：

1)将摩尔比1:0.6的乙二醇和高丝氨酸在水中均匀混合，在80℃下加热搅拌至形成透明液体，然后在50℃下放置12h，即得提取液，提取液的含水量为40-60％；

2)按料液比1:12.5(g/ml)将红景天粉末中加入提取溶剂，混合均匀后在温度为50℃、超声波功率为50w下超声波提取30min获得提取液，稀释后离心，上清液用水稀释5倍，并经0.45μm经微滤膜过滤，即得含有红景天苷和酪醇的植物提取物。

实施例4：

含有红景天苷和酪醇的植物提取物的制备方法：

与实施例3的不同之处在于：植物粉末为女贞粉末。

实施例5：

含有红景天苷和酪醇的植物提取物的制备方法：

与实施例3的不同之处在于：植物粉末为杜鹃花粉末。

对比例1：

与实施例3相比，本对比例的不同之处为：步骤1)用提取液不含乙二醇。

对比例2：

与实施例3相比，本对比例的不同之处为：步骤1)用提取液不含高丝氨酸。

对比例3：

与实施例3相比，本对比例的不同之处为：步骤1)用提取液不含乙二醇和高丝氨酸。

试验例1：

红景天苷和酪醇的提取率测定

采用高效液相色谱法(hplc)测定红景天苷和酪醇的提取率：

色谱条件：色谱柱：behc18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：甲醇-磷酸水溶液(体积比18)∶，82其中，磷酸水溶液中磷酸体积分数为0.2％；检测波长230nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量20μl。

标准曲线：称取一定量标准品，并用甲醇定容后稀释到相应的倍数。红景天苷的质量浓度梯度为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/l，酪醇的质量浓度梯度为0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300mg/l。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。红景天苷的线性回归方程为y＝9.8711x+89.4572(r²＝0.9967)，红景天苷的线性回归方程为y＝24.0211x-51.2533(r²＝0.9991)，测量样品液的吸光度，以标准曲线来计算多糖含量(c)。结果如表1所示，从图1中可以看出实施例1-3中红景天苷的提取率至少为21.15mg/g，酪醇的提取率至少为1.81mg/g，实施例4亦如此，但是对比例1-3中红景天苷和酪醇的提取率明显下降很多，这说明本发明用提取液能提高红景天苷和酪醇的提取率。

试验例2：

植物提取物对幽门螺旋杆菌的增殖抑制作用

1.幽门螺杆菌的培养与传代

将幽门螺杆菌菌株培养于karmali血平皿中，培养条件为10％co2，5％o2和85％n2，37℃培养3天。幽门螺杆菌出现生长时取出传代，从微氧罐中取出待传代的幽门螺杆菌，放入超净工作台，用接种环刮取足量的幽门螺杆菌菌落至生理盐水中，调整浓度至2×10⁸cfu/ml，100μl涂布于mh加抗生素平皿中，将其与产气袋一同放于培养罐中，37℃培养3d。

2.鉴定

形态学：菌落特征为无色透明，表面光滑湿润。经涂片革兰氏染色后油镜下观察呈弧形或s形。

生化反应：将菌悬液滴入3％的过氧化氢溶液中有气泡产生；将菌悬液滴于尿素酶试纸上，尿素酶试纸变红；通过16srrna测序与ncbi数据库中幽门螺杆菌序列进行比对，相似度高于95％。

3.植物提取物体外抑制幽门螺杆菌的试验

分别收集传代生长的中性和酸性菌株于pbs之中，随后冷冻离心(4℃，5000×g，15min)去除上清液并重悬于pbs中再洗涤2次。将酸性和中性菌株分别置于酸性(ph＝5.3)含10％血清的bhi培养液中，使用麦氏比浊仪调整细菌浓度均为1×10⁸cfu/ml。分别加入实施例3-5、对比例1-3的植物提取物，使受试药物浓度最终分别为50μg/ml，对照组加入等体积的二甲基亚砜；放入微需氧环境中孵育1h。随后取出部分菌液等比例稀释并涂板，再放入微需氧环境中培养3d后进行菌落计数，观察广藿香醇对幽门螺杆菌存活率的影响。结果如图2所示，从图2中可以看出实施例3-5中植物提取物能够抑制幽门螺杆菌的生存，但是对比例1-3中植物提取物对幽门螺杆菌的存活率无明显影响，这说明本发明用植物提取物具有优异的生存抑制作用、除菌/排菌作用。

试验例3：

1.植物提取物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的抑制作用

脲酶活性测定：取试验例2中培养好的菌液置于离心管中，离心分离收集幽门螺旋杆菌，用ph＝7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次，将沉淀下来的幽门螺旋杆菌置于-20℃保存1d，然后取出恢复至室温，加入蒸馏水和蛋白酶抑制剂，超声波振荡2min，离心，上清夜透析除盐，所得到的脲酶溶液加入等体积的甘油，在离心管中加入等体积尿素溶液，混匀，避光，于室温反应20min，然后加入berthelot显色液，先加液后加液，混匀，室温显色10min，吸取反应液在酶标仪上检测其a635，脲酶残余活性(ra,％)＝(a样本-a空白)/(a对照-a空白)×100％。结果如图3所示，从图3中可以看出实施例3-5中植物提取物能够显著抑制幽门螺杆菌的脲酶活性，但是对比例1-3中植物提取物对幽门螺杆菌的脲酶活性无明显影响，这说明本发明用植物提取物具有优异的抑制其脲酶活性作用。

2.rt-qpcr法检测植物提取物对幽门螺杆菌脲酶相关基因表达的影响

脲酶基因簇由多个开放阅读框架构成，其中uree，uref，ureg，ureh为辅助基因，编码脲酶辅助蛋白；urei为幽门螺杆菌脲酶特有的基因，编码脲酶特异性通道蛋白；urea和ureb为结构基因，编码脲酶结构蛋白；细菌体内的脲酶成熟过程由细菌内膜上的高亲和力镍转运蛋白nixa独立从外界摄取ni²⁺进入细菌体内开始，通过形成二聚体的辅酶蛋白uree将ni²⁺传递给由辅酶蛋白uref，ureg和ureh组成的复合体，辅酶蛋白复合体携带ni²⁺与脲酶前体蛋白(由结构蛋白urea和ureb构成)的活性中心结合后将携带的ni²⁺留在脲酶前体蛋白活性中心，促使其成熟并发挥分解尿素的生物学功能。取试验例2中培养好的幽门螺杆菌菌液，经过3次洗涤后去除上清液，加入1mltrizol试剂，参照trizol说明书方法提取细菌的总rna，在超紫外分光光度仪上测a260/a280达到1.8-2.0后，按逆转入试剂盒操作方法得到其cdna，通过q-pcr的方法，以16s为内参基因，检测幽门螺杆菌内urea，ureb，uree，uref，ureg，ureh和nixa的表达水平。引物序列见表1。结果如图4所示，从图4中可以看出，实施例3-5中植物提取物能够显著门螺杆菌内urea，ureb，uree，uref，ureg，ureh和nixa的表达水平，但是对比例1-3中植物提取物对内urea，ureb，uree，uref，ureg，ureh和nixa的表达水平无明显影响，这说明本发明用植物提取物不仅通过影响脲酶结构基因urea和ureb的表达，而且与抑制脲酶辅酶基因uree，ureh以及镍离子转运基因nixa，从而阻断镍离子转运入脲酶前体的活性中心的途径，抑制其成熟有关；同时抑制尿素转运基因urei，减少尿素与脲酶的接触，进而抑制其分解作用，从而高选择性地抑制脲酶活性，即本发明用植物提取物具有优异的抑制其脲酶活性作用。

表1rt-pcr用引物序列

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。