环状RNAcirc-Ankib1在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用的制作方法

本发明属于神经再生和修复技术领域，具体涉及一种环状rnacirc-ankib1在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。

背景技术：

周围神经损伤通常由拉伸性、缺血性、穿透性、挤压性等创伤性损伤引起。与中枢神经系统不同，周围神经系统损伤后轴突具有一定的内在再生能力。schwann细胞是周围神经系统中重要的胶质细胞，在神经系统中发挥重要作用。周围神经损伤后，schwann细胞增殖迁移形成细胞索带，同时会通过合成分泌神经营养因子，激活免疫反应等为损伤后的神经再生提供适宜的微环境。从分子的角度研究神经再生过程中的关键因素和途径，有利于发现新的治疗靶点。

环状rnacircularrnas(circrnas)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(a)尾巴、并以共价键形成环形结构的rna.。circrnas能通过作为microrna的分子海绵、剪接和转录调节因子等方式调节基因表达，参与多种生物学过程。

目前关于circrnas的研究主要集中在癌症方面，是一种非常有前景的生物标记物甚至是治疗靶点。在神经系统发育中circrnas也发挥着重要的作用，可以影响神经元的迁移和轴突生长。但到目前为止circrnas在周围神经系统损伤修复中的作用鲜有报道，尤其是对schwann细胞的表型调节。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种新的大鼠源的环状rnacirc-ankib1及其用途，可用于制备促进神经再生和修复神经损伤药物。

本发明具体技术方案如下：

一种环状rnacirc-ankib1，所述circrna的cdna核苷酸序列如seqidno:1所示，首尾连接成环状结构。

本发明另一目的在于提供上述环状rnacirc-ankib1在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用，

所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。

可根据circ-ankib1核苷酸序列设计干预circ-ankib1表达的物质，选自化合物、蛋白、多肽、多糖、糖蛋白、糖肽、核酸中的一种或几种。

优选的，所述干预circrna表达的物质，选自与circ-ankib1环化位点处的序列互补的sirna。

本发明另一目的在于提供一种干预上述circ-ankib1表达的sirna，核苷酸序列如下：

circ-ankib1sirna1

正义链:5’-cacgaaugugaaacauguudtdt-3’(seqidno:7)

反义链:5’-aacauguuucacauucgugdtdt-3’(seqidno:8)

circ-ankib1sirna2

正义链:5’-gcucacgaaugugaaacaudtdt-3’(seqidno:9)

反义链:5’-auguuucacauucgugagcdtdt-3’(seqidno:10)。

本发明研究结果表明，所述sirna能够干扰circ-ankib1的表达，促进schwann细胞增殖。

本发明另一目的在于提供上述干预circ-ankib1表达的sirna在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。

本发明构建大鼠坐骨夹伤模型，取损伤不同时间点的坐骨神经组织，通过rna-seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circrnas。针对筛选到的circrnas设计特异性的背向引物，再通过pcr验证以及测序鉴定，获得一种新的环状rnacirc-ankib1。在原代schwann细胞中，设计sirna干扰circ-ankib1的表达，可以促进schwann细胞增殖。

附图说明

图1为实施例1所述circ-ankib1和circ-setd5在大鼠坐骨神经损伤后坐骨神经组织中不同时间点的表达变化(以gapdh为内参)。

图2为实施例2所述circ-ankib1和circ-setd5的sirna对schwann细胞中circ-ankib1和circ-setd5表达的影响(以gapdh为内参)。

图3为实施例2所述circ-ankib1和circ-setd5的sirna干扰circ-ankib1和circ-setd5对schwann细胞增殖的影响。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1：circ-ankib1的筛选与鉴定

对sd(spraguedawley)大鼠坐骨神经夹伤后不同时间点(0d、1d、4d、7d、14d)的坐骨神经进行rna-seq。根据测序结果挑选全部由外显子组成且环>500nt的表达差异明显的circrnas。测序结果分析筛选出来的circrna，进一步通过pcr验证circrna的存在。根据circrnas引物设计原则对这些circrnas设计背向引物，每个circrna使用ncbi设计引物。根据引物信息选择不同的退火温度进行pcr扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳选出条带大小与预期相符的circrnas，送公司测序，并将测序结果与原始序列比对验证其是否跨越环化位点。最终得到与预期条带大小一致且测序鉴定过环化位点的circrnas，并挑选其中表达量较高的circ-ankib1和circ-setd5进行进一步研究，circ-ankib1的cdna序列如seqidno:1所示，circ-setd5的cdna序列如seqidno:2所示。

一、坐骨神经组织rna提取

取大鼠坐骨神经夹伤后0d、1d、4d、7d、14d近端的组织按reagent(invitrogen)说明书提取组织rna。大鼠坐骨神经夹伤后不同时间点的近端组织放入1.5mlrnase-freeep管，加入1mlreagent(invitrogen)；将ep管置于冰中并使用电动匀浆器将组织匀浆，冰上静置5min-10min裂解。加入三氯甲烷200μl，涡旋剧烈振荡20s，室温静置10min；13000rpm，4℃离心15min。小心仔细吸取上清，加入异丙醇800μl，上下颠倒轻柔混匀，-20℃静置1h，13000rpm，4℃离心15min，弃除上清。加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心13000rpm，5min；去除上清，吹干。加入适量rnase-freeh2o，65℃促溶10min；检测rna的od值及浓度，-80℃保存备用。

二、rna逆转录合成cdna

使用逆转录试剂盒(takararr037a)，将500ng的rna逆转录为cdna。

(1)circrna的逆转

冰上操作，每个反应体系10μl，如下：

(2)mrna的逆转

冰上操作，每个反应体系10μl，如下：

反应程序为：37℃45min，85℃5min，4℃∞。

三、qrt-pcr

根据circrnas引物设计原则设计circrnasqrt-pcr引物序列。

circ-ankib1qrt-pcr引物

circ-ankib1-f5’-agaccgcagacatgctcc-3’(seqidno:3)

circ-ankib1-r5’-agtccctaatatcctattcattcca-3’(seqidno:4)

circ-setd5qrt-pcr引物

circ-setd5-f5’-tactcggcggtcttcc-3’(seqidno:5)

circ-set5-r5’-ctccatctccagctcttt-3’(seqidno:6)

将逆转录反应得到的cdna，按照1∶10稀释，进行如下qrt-pcr反应。

(1)按下列组份配制qrt-pcr反应液：

(2)反应液混匀，real-timepcr仪反应程序如下：

(3)反应设置3个复孔，内参为gapdh，程序结束后，查看溶解曲线与扩增曲线，舍去误差较大的实验数据，根据具体实验要求，对数据进行统计分析。

考察上述circrna在大鼠坐骨神经损伤后坐骨神经组织中不同时间点的表达变化，结果如图1所示。结果表明circ-setd5和circ-ankib1在坐骨神经损伤后表达呈现先下调再上调的状态。

实施例2：circrna的功能验证

一、原代schwann细胞的培养

取出生1d的sd大鼠的坐骨神经，用显微剪剪碎，加入3mg/ml的胶原酶1ml，37℃消化30min，每10min摇晃一次；1200rpm，室温离心5min，弃除胶原酶，加入胰酶1ml，置于37℃培养箱中消化8min左右，加入完全培养基3ml终止消化，过200目筛网，1200rpm，室温离心5min；再加入完全培养基2ml洗1-2遍；将细胞种在用左旋多聚赖氨酸(pll)包被好的培养皿中培养(5％co2，37℃)；第二天，换成含有ara-c(10μm)的完全培养基，抑制成纤维细胞的快速增殖；第四天，换成含有hrg(50ng/ml)和forskolin(2μm)的完全培养基刺激细胞的生长。待细胞长到密度为90％以上后，用补体将细胞纯化。先用胰酶将细胞从培养皿中消化下来并转移到离心管中，室温离心1200rpm，5min；弃上清，用含有1μlanti-thy1.1(1∶1000)的1ml完全培养基将细胞沉淀重悬，置冰上孵育2h；1200rpm，室温离心5min，弃掉管中液体，加入rabbitcomplement(250ulrabbitcomplement+750uldmem)，37℃，孵育1h；dmem洗三遍；将细胞种在用pll包被好的培养皿中培养；第二天换液培养(含有hrg和forskolin)，待细胞长满，纯度达95％以上，用于后续实验。二、schwann细胞转染

转染特异性针对circ-ankib1和circ-setd5的sirna：本实验中，特异性针对circ-ankib1sirna和circ-setd5sirna(由广州市锐博生物科技有限公司制备，终浓度：100nm)及其对照sirnanegativecontrol(nc)，用lipofectamine^tmrnaimax(invitrogen)转入schwann细胞，第二天换成完全培养基，根据需要进行后续实验。

circ-ankib1sirna和circ-setd5sirna如下所示：

circ-ankib1sirna1:

正义链:5’-cacgaaugugaaacauguudtdt-3’(seqidno:7)

反义链:5’-aacauguuucacauucgugdtdt-3’(seqidno:8)

circ-ankib1sirna2:

正义链:5’-gcucacgaaugugaaacaudtdt-3’(seqidno:9)

反义链:5’-auguuucacauucgugagcdtdt-3’(seqidno:10)。

circ-ankib1sirna3:

正义链:5’-ucgagcucacgaaugugaadtdt-3’(seqidno:11)。

反义链:5’-uucacauucgugagcucgadtdt-3’(seqidno:12)。

circ-setd5sirna1:

正义链:5’-cuucccaugcuggguaauudtdt-3’(seqidno:13)。

反义链:5’-aauuacccagcaugggaagdtdt-3’(seqidno:14)。

circ-setd5sirna2:

正义链:5’-caugcuggguaauuacaaadtdt-3’(seqidno:15)

反义链:5’-uuuguaauuacccagcaugdtdt-3’(seqidno:16)

circ-setd5sirna3:

正义链:5’-uggguaauuacaaaguggadtdt-3’(seqidno:17)。

反义链:5’-uccacuuuguaauuacccadtdt-3’(seqidno:18)。

三、schwann细胞rna提取、逆转录及qrt-pcr

原代schwann细胞分别转染特异性针对circ-ankib1sirna及其对照sirnanegativecontrol(nc)，48h后，收细胞，按reagent(invitrogen)说明书提取schwann细胞rna，逆转录，进行qrt-pcr，方法同实施例1中所述。结果如图2所示，结果表明circ-ankib1sirna1和circ-ankib1sirna2可以显著干扰circ-ankib1在schwann细胞中的表达,circ-setd5sirna1-3均可以显著干扰schwann细胞中circ-setd5的表达，且circ-setd5sirna2和circ-setd5sirna3干扰效果显著，***p<0.001。

四、edu细胞增殖实验

原代schwann细胞分别转染特异性针对circ-ankib1和circ-setd5的sirna(circ-ankib1sirna1、circ-ankib1sirna2、circ-setd5sirna2、circ-setd5sirna3)及其对照(nc)，48h后，根据cell-light^tmedu567invitrokit(广州市锐博生物科技有限公司，c10310-1)进行edu细胞增殖实验。按1000：1的比例用完全培养基稀释edua溶液；加入96孔板，37℃孵育24h，弃去培养基；pbs轻柔清洗细胞1-2次。每孔加入4％多聚甲醛约100μl，室温孵育30min，弃去4％多聚甲醛；每孔加入2mg/ml甘氨酸50μl，孵育5min后，弃甘氨酸溶液；每孔加入pbs100μl，5min后弃去pbs；每孔加入100μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)，10min后弃去液体；pbs清洗1次，5min。每孔加入染色反应液约100μl，室温、避光、孵育30min后，弃除反应液；加入渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)100μl清洗2-3次，每次10min，弃除渗透剂；按100：1的比例用ddh2o稀释试剂f，制备1×hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入1×hoechst33342反应液50μl，室温避光孵育30min后，弃反应液；每次每孔加入pbs100μl清洗2-3次；每孔加入pbs100μl荧光显微镜拍照。用circ-ankib1和circ-setd5的sirna(circ-ankib1sirna1、circ-ankib1sirna2、circ-setd5sirna2、circ-setd5sirna3)与sirnanegativecontrol(nc)转染原代培养的schwann细胞，在转染sirna48h后，按上述方法进行edu标记，edu实验结果如图3所示，柱状图为sirna干扰circ-ankib1、circ-setd5后schwann细胞的增殖率，**p<0.01。结果表明：与对照组相比，sirna干扰circ-ankib1，显著促进schwann细胞的增殖，而sirna干扰circ-setd5，对schwann细胞增殖没有影响。

序列表

<110>南通大学

<120>环状rnacirc-ankib1在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>875

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aatgtgaaacatgttgtagaagtactccagaagtggctgaaggaagaaagaaagtgccac60

tgcctatcagaaaataaaacaaaacatgggaaatacaaccaccaaattccgcaaagcact120

catcaatggtgatgaaaacctggcttgccaaatctatgaaaataatcctcagctaaaaga180

atcccttgatccaaatgtatcttatggagagccctatcagcacaacactccattacacta240

tgctgctagacatggaatgaataggatattagggacttttctttttggtagagatggaaa300

cccaaataaacggaatgtgcacaatgaaacatctatgcatttgttgtgtatgggacctca360

aatcatgatatctgaaggaacccttcatcctcgcttagcacggcctgtggaagatgattt420

cagaagggcagattgtctgcagatgatcttacgatggaaaggagcaaaacttgaccaggg480

tgaatatgagagagcggctattgatgcagttgataacaaaaagaacacaccccttcacta540

tgctgcagcctcagggatgaaagcctgtgtggagcttttagtaaaacacggaggagactt600

gtttgctgaaaatgaaaataaagatactccttgtgattgtgcggaaaagcaacaccacaa660

agacctggccctcagtctggagtctcagatggtgttctctcgggacccagaggctgaaga720

aatagaagctgagtatgctgcactggacaagcgagagccatatgaaggactaaggcccca780

ggatcttcgtaggttaaaagatatgcttattgtggagaccgcagacatgctccaggcccc840

tctgtttactgctgaggcactgcttcgagctcacg875

<210>2

<211>589

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

taattacaaagtggactgtgcttgtcacaagggaaaccggaattgccccatacagaaaag60

aaatcccaatgctgcagaattgccactcccacctcctagctttcccaccattggagcaga120

gaccagacgtagaaaagcacggcggaaagagctggagatggagcagcaaaatgaggttcc180

agaagagaatcatgacccacaaccacaagaagttccagaaaaagtaactgtatccagtga240

gcatgaggaagttgacaatccagaagaaaaaccggaagaagaaaaagaagaggccacaga300

cgaccaggagaactcagctcatagcagaaggactcgggaagataggaaggttgaagccat360

catgcatgcttttgaaactttagagaagagaaagaaacggcgggatcagcctgtagagca420

gagcaactcagacgtagagattactactagcagttcagagataggagttggagaagagac480

aaaaactgcagcccccgagtcagaagttaacaaccctgttacaaacattgccatcccaag540

catcccacagagcactggtgtgaatactcggcggtcttcccatgctggg589

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<212>dna

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<400>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cacgaaugugaaacauguutt21

<210>8

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

aacauguuucacauucgugtt21

<210>9

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gcucacgaaugugaaacautt21

<210>10

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

auguuucacauucgugagctt21

<210>11

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ucgagcucacgaaugugaatt21

<210>12

<211>21

<212>dna/rna

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<400>12

uucacauucgugagcucgatt21

<210>13

<211>21

<212>dna/rna

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<400>13

cuucccaugcuggguaauutt21

<210>14

<211>21

<212>dna/rna

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<400>14

aauuacccagcaugggaagtt21

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<211>21

<212>dna/rna

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<400>15

caugcuggguaauuacaaatt21

<210>16

<211>21

<212>dna/rna

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<400>16

uuuguaauuacccagcaugtt21

<210>17

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

uggguaauuacaaaguggatt21

<210>18

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

uccacuuuguaauuacccatt21