使用甲酰-甘氨酸生成酶(FGE)对多种硫酸酯酶缺乏症和其它病症进行诊断和治疗的制作方法

本申请是申请号201210302070.3,申请日2004年02月10日的同名申请的分案申请。发明领域此发明涉及诊断和治疗多种硫酸酯酶缺乏症(msd)以及其它硫酸酯酶缺乏症的方法和组合物。更特异地，本发明涉及被分离的调节硫酸酯酶翻译后修饰的分子。这类修饰为硫酸酯酶的正确功能所必需。发明背景硫酸酯酶是高度保守的基因家族的成员，共享广泛的序列同源性(franco,b.等,cell,1995,81:15-25；parenti,g.等,curr.opin.gen.dev.,1997,7:386-391)，高度的结构类似性(bond,c.s.等,structure,1997,5:277-289；lukatela,g.等,biochemistry,1998,37:3654-64)，和独特的为硫酸酯断裂所必需的翻译后修饰(schmidt,b.等,cell,1995,82:271-278；selmer,t.等,eur.j.biochem.,1996,238:341-345)。翻译后修饰包括对保守的半胱氨酸(在真核细胞中)或丝氨酸(在某些原核细胞中)残基在cβ处的氧化，得到l-cα-甲酰甘氨酸(也叫做fgly；2-氨基-3-氧代丙酸)，其中醛基代替了侧链的硫代甲基基团。醛基是硫酸酯酶催化位点的必需部分，很可能作为醛水合物起作用。成对的羟基之一在硫酸酯断裂时接受硫酸基团，导致共价硫酸化的酶中间物的形成。其它羟基是随后的硫酸基团消去和醛基再生所需要的。此修饰在初生硫酸酯酶多肽输入期间或间隔很短时间之后发生于内质网，并被围绕着将被修饰的半胱氨酸(或丝氨酸)残基的短线性序列所调控。此高度保守序列是六肽l/v-c(s)-x-p-s-r(seqidno:32)，出现在所有真核细胞硫酸酯酶的n末端区域，并最频繁地在残基x上携带羟基或硫羟基(dierks,t.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1997,94:11963-11968)。迄今为止，已在人体中鉴别出13个硫酸酯酶基因。它们编码具有不同底物专一性和亚细胞定位如溶酶体、高尔基体和内质网定位的酶。这些基因中的四种arsc,arsd,arse,和arsf(分别编码芳基硫酸酯酶c,d,e和f)，位于相同的染色体区域(xp22.3)内。它们共享显著的序列类似性和几乎相同的基因组组织方式，说明它们来源于在进化中近来才发生的复制事件(francob等,cell,1995,81:15-25；meronig等,hummolgenet,1996,5:423-31)。由单独硫酸酯酶活性的缺乏所引起的至少八种人单基因疾病的鉴定，强调了硫酸酯酶在人体代谢中的重要性。这些病症中的大部分是溶酶体存贮病，其中，表型结果源于被储存物质的类型和组织分布。在它们中，有五种不同类型的因硫酸酯酶对粘多糖分解代谢作用的缺乏而引起的粘多糖病(mps类型ii,iiia,iiid,iva和vi)(neufeld和muenzer,2001,themucopolysaccharidoses,inthemetabolicandmolecularbasesofinheriteddisease,c.r.scriver,a.l.beaudet,w.s.sly,d.valle,b.childs,k.w.kinzler和b.vogelstein编，newyork:mcgraw-hill,pp.3421-3452)，和以脑硫脂在中枢和外周神经系统中储存并引起严重和渐进性神经退化为特征的异常染性脑白质营养不良(mld)。两种另外的人类疾病由非溶酶体硫酸酯酶缺乏引起。这些包括x-连锁的鱼鳞病，因类固醇硫酸酯酶(sts/arsc)缺乏而引起的皮肤病；和点状软骨发育不全，由芳基硫酸酯酶e(arse)缺乏引起的影响骨和软骨的疾病。硫酸酯酶也牵涉到药物诱导的人畸形综合症，例如warfarin胚胎病，由怀孕期间在宫内暴露于杀鼠灵而抑制arse活性所引起。在引起人兴趣的人类单基因疾病中，多种硫酸酯酶缺乏症(msd)是所有硫酸酯酶活性同时有缺陷。因此，此严重的多系统性疾病的表型结合了在单独硫酸酯酶缺乏中所观察到的特征。来自多种硫酸酯酶缺乏症患者的细胞即使以编码人硫酸酯酶的cdnas转染之后也缺乏硫酸酯酶活性，暗示所有硫酸酯酶活性所需要的普遍机制的存在(rommerskirch和vonfigura,proc.natl.acad.sci.,usa,1992,89:2561-2565)。硫酸酯酶的翻译后修饰被发现在多种硫酸酯酶缺乏症患者中有缺陷，暗示此疾病由基因的突变所引起，该基因牵涉到半胱氨酸至甲酰甘氨酸的转化机制(schmidt,b.等,cell,1995,82:271-278)。尽管存在强烈的生物学和医学兴趣，以鉴别此基因为目标的努力却被多种硫酸酯酶缺乏症患者的稀有性和随之带来的缺乏合适的家族病例而无法完成遗传图谱绘制所妨碍。发明概述本发明提供诊断和治疗多种硫酸酯酶缺乏症(mim272200)及治疗其它硫酸酯酶缺乏症的方法和组合物。更特异地，已鉴别出编码甲酰甘氨酸生成酶(fge)的基因，此酶负责发生于硫酸酯酶的独特的翻译后修饰(形成l-cα-甲酰甘氨酸；也叫做fgly和/或2-氨基-3-氧代丙酸)，该翻译后修饰为硫酸酯酶功能所必需。已发现，出乎意料的是fge基因中的突变导致受试者中的多种硫酸酯酶缺乏症(msd)的发展。也发现，出乎意料的是fge增强了硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6。考虑到这些发现，本发明的分子可用于诊断和治疗多种硫酸酯酶缺乏症以及其它硫酸酯酶缺乏症。在多种硫酸酯酶缺乏症的诊断中应用本发明的分子的方法被提供。另外，为调节硫酸酯酶上fgly形成的目的而在体内或体外应用这些分子的方法，治疗与这种修饰相关的病症的方法，和对制备治疗多种硫酸酯酶缺乏症及其它硫酸酯酶缺乏症的药学制剂有用的组合物，也被提供。本发明因此在几个方面包括调节硫酸酯酶上fgly形成的多肽，分离的编码那些多肽的核酸，它们的功能修饰物和变体，它们的有用的片段，以及与其相关的治疗、诊断和研究的方法、组合物与工具。根据本发明的一个方面，选自下列的分离的核酸分子被提供：(a)与seqidno:1所示的核苷酸序列所组成的分子在严格条件下杂交的核酸分子，该核酸分子编码具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的甲酰甘氨酸生成酶(fge)；(b)与(a)的核酸分子在密码子序列上因遗传密码简并性而有所区别的核酸分子；和(c)(a)或(b)的互补链。在一定的实施方案中，分离的核酸分子包括seqidno:1所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，分离的核酸分子由seqidno:3所示的核苷酸序列或其片段组成。本发明的另一方面提供分离的选自下列的核酸分子：(a)seqidno:1所示的核苷酸序列的独特(unique)片段,和(b)(a)的互补链,条件是(a)中的独特片段包括了不与某些序列相同的连续核苷酸序列，所述某些序列选自(1)与seqidno.4和/或seqidno.4的核苷酸20-1141相同的序列,和(2)(1)中核酸分子的互补链。在任何前述的实施方案中，互补链指全长互补链。在一个实施方案中，连续核苷酸序列选自(1)至少两个不与序列组完全相同的连续核苷酸,(2)至少三个不与序列组完全相同的连续核苷酸,(3)至少四个不与序列组完全相同的连续核苷酸,(4)至少五个不与序列组完全相同的连续核苷酸,(5)至少六个不与序列组完全相同的连续核苷酸,和(6)至少七个不与序列组完全相同的连续核苷酸。在另一实施方案中，片段大小选自至少：8个核苷酸,10个核苷酸,12个核苷酸,14个核苷酸,16个核苷酸,18个核苷酸,20个核苷酸,22个核苷酸,24个核苷酸,26个核苷酸,28个核苷酸,30个核苷酸,40个核苷酸,50个核苷酸,75个核苷酸,100个核苷酸,200个核苷酸,1000个核苷酸和其间的每一整数长度。根据又一方面，本发明提供包含上述核酸分子的表达载体和以该表达载体转化或转染的宿主细胞。根据又一方面，本发明提供表达内源fge基因的活化形式的细胞。在一个实施方案中，内源fge基因的活化通过同源重组发生。根据本发明又一方面，分离的多肽被提供。分离的多肽被前述的本发明核酸分子所编码。在某些实施方案中，分离的多肽被seqidno:1的核酸编码，产生出具有seqidno:2序列和cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。在其它的实施方案中，分离的多肽也许是前述的片段或变体，其长度足以代表人基因组中独特序列并且是具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽，条件是该片段包括不与任何被具有seqidno.4的核酸序列所编码的序列相同的连续氨基酸的序列。在另一实施方案中，上述多肽分子的免疫源性片段被提供。免疫源性片段也许具有也许不具有cα-甲酰甘氨酸生成活性。根据本发明又一方面，分离的结合多肽被提供，其选择性地与前述的本发明核酸分子所编码的多肽结合。优选分离的结合多肽选择性地结合包含seqidno:2序列的多肽、其片段或属于分离的具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽家族而在本文其它部分所述的多肽。在优选的实施方案中，分离的结合多肽包括抗体和抗体片段(如fab,f(ab)2,fd和包括了与fge多肽选择性结合的cdr3区域的抗体片段)。在一定的实施方案中，抗体是人抗体。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在某一实施方案中，抗体是多克隆抗血清。在进一步的实施方案中，抗体是人源化的。在更进一步的实施方案中，抗体是嵌合的。根据本发明又一方面，具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的分离的多肽的家族被提供。每一所述多肽从氨基端到羧基端包含：(a)氨基端亚结构域1；亚结构域2；包含35到45个氨基酸的羧基端亚结构域3，而其中亚结构域3与选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的多肽的亚结构域3具有至少约75％的同源性和大致相同的长度。在重要的实施方案中，亚结构域2含有120到140个氨基酸。在进一步的重要实施方案中，亚结构域2中至少5％的氨基酸是色氨酸。在某些实施方案中，亚结构域2与选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的多肽的结构域2之间具有至少50％的同源性。在一定的实施方案中，每一多肽的亚结构域3与选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的多肽的亚结构域3具有介于约80％和约100％之间的同源性。根据本发明进一步的方面，用于测定某一受试者中的fge表达水平的方法被提供。方法包括测量来自某一受试者的测试样本中的fge表达以确定fge在受试者中的表达水平。在一定的实施方案中，测得的测试样本中的fge表达与对照样本(含有已知fge表达水平)中的fge表达进行比较。表达被定义成fgemrna表达，fge多肽表达，或如本文其它部分所定义的fge的cα-甲酰甘氨酸生成活性。多种方法能用于测量表达。本发明优选的实施方案包括用于测量mrna表达的pcr和rna印迹，作为测量fge多肽表达的试剂的fge单克隆抗体或fge多克隆抗血清，以及测量fgecα-甲酰甘氨酸生成活性的方法。在一定的实施方案中,测试样本例如活检样本和生物液体如血液被用作测试样本。fge在某一受试者的测试样本中的表达与对照样本中的fge表达比较。根据本发明另一方面，用于鉴别在调节分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性中有用的物质的方法被提供。方法包括(a)将具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的分子与候选物质接触,(b)测量该分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性,和(c)将测得的该分子cα-甲酰甘氨酸生成活性与对照进行比较以确定候选物质是否调节分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性，其中该分子是具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的核苷酸序列的核酸分子,或其表达产物(例如，具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽)。在一定的实施方案中,对照是在缺乏候选物质的条件下测得的该分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性。根据本发明又一方面,在受试者中诊断多种硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括将生物样本与试剂接触，所述生物样本来自被怀疑具有多种硫酸酯酶缺乏症的受试者，所述试剂特异结合选自下面的分子:(i)具有seqidno:1,3,或4核苷酸序列的fge核酸分子,(ii)核酸分子(i)的表达产物,或(iii)(ii)的表达产物的片段；以及测量结合的试剂数量并由此确定所述核酸分子或其表达产物的表达是否异常，异常表达表明受试者患有多种硫酸酯酶缺乏症。根据本发明又一方面，用于对特征为核酸分子或其表达产物的异常表达的病症进行诊断的方法被提供。方法包括将来自受试者的生物样本与试剂接触，其中所述试剂特异结合所述核酸分子、其表达产物或其表达产物的片段；并测量结合的试剂数量并由此确定所述核酸分子或其表达产物的表达是否异常，异常表达表明具有所述病症，其中所述核酸分子具有seqidno:1核苷酸序列而所述病症是多种硫酸酯酶缺乏症。根据本发明又一方面，用于在受试者中测量特征为核酸分子或其表达产物的异常表达的多种硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括对来自患者的样本监测选自下面的参数：(i)具有seqidno:1,3,4的核苷酸序列的核酸分子或具有来源于feg基因组位点的序列的核酸分子,(ii)所述核酸分子编码的多肽,(iii)来源于所述多肽的肽,和(iv)选择性结合所述多肽或肽的抗体，将它们作为对受试者中的多种硫酸酯酶缺乏症的测定。在某些实施方案中,样本是如前述实施方案任一项所描述的生物液体或组织。在一定的实施方案中，监测步骤包括将样本与选自下面的可检测的试剂接触：(a)在严格条件下与(i)中的核酸分子选择性杂交的分离的核酸分子,(b)选择性结合(ii)中的多肽或(iii)中的肽的抗体,和(c)与(iv)中的抗体结合的多肽或肽。抗体、多肽、肽或核酸能用放射性标记或酶进行标记。在进一步的实施方案中,方法进一步包含检验样品中的肽。根据本发明又一方面，试剂盒被提供。试剂盒包含包装，包装包含选择性结合前述fge的分离的核酸或其表达产物的任一种的试剂，和用于与测量值比较的对照，此测量值为所述试剂与前述fge的分离的核酸或其表达产物的任一种结合的测量值。在某些实施方案中，对照是用于与测量值比较的预定值。在一定的实施方案中，对照包含前述fge的分离的核酸的任一种的表达产物的表位。在一种实施方案中，试剂盒进一步包含选择性结合选自下面的多肽的第二试剂：艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,硫酸胺酶(sulfamidase),n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6,或其肽段，和用于与所述第二试剂结合到所述多肽或其肽段的测量值进行比较的对照。根据本发明进一步的方面，治疗多种硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括对需要这种治疗的受试者施用调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为治疗受试者的多种硫酸酯酶缺乏症的有效量。在某些实施方案中,方法进一步包含某一试剂的共施用，所述试剂选自编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,或hsulf-6的核酸分子，该核酸分子的表达产物，和该核酸分子的表达产物的片段。在一定的实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的分离的核酸分子(例如如权利要求1-8所要求的核酸分子或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸)。在重要的实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的肽(例如，如权利要求11-15,19,20所要求的肽，或具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽)。调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂可通过表达内源和/或外源fge核酸分子的细胞产生。在重要的实施方案中,内源fge核酸分子可被活化。根据本发明的一个方面，用于在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括施用本发明的分离的fge核酸分子(例如，权利要求1-8的核酸分子，或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸),和/或其表达产物到受试者中，用量为在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。根据本发明的一个方面，用于治疗患多种硫酸酯酶缺乏症的受试者的方法被提供。方法包括对需要这种治疗的受试者施用调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在某些实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的有义核酸(例如，权利要求1-8的核酸分子，或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸)。在一定的实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的分离的多肽(例如，权利要求11-15,19,20的多肽或具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽)。根据本发明又一方面，用于在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括将细胞与本发明的分离的核酸分子接触(例如，权利要求1-8的核酸分子，或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸)，或其表达产物，用量为在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在重要的实施方案中,方法包括活化内源fge基因以在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性。根据本发明进一步的方面，药物组合物被提供。组合物包含治疗多种硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的某种试剂，该试剂含有本发明的分离的核酸分子(例如，权利要求1-8中任一项的分离的核酸分子，具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87序列的fge核酸分子)，或其表达产物，以及药学上可接受的载体。根据本发明的一个方面，用于鉴别在治疗多种硫酸酯酶缺乏症中有用的候选物质的方法被提供。方法包括测定一套核酸分子在细胞或组织中的表达，条件是缺乏候选物质时，允许该套核酸分子的最初量的表达，其中该套核酸分子包含至少一种选自下面的核酸分子:(a)严格条件下与由seqidno:1所示核苷酸序列组成的分子杂交并编码具有cα-甲酰甘氨酸生成活性(fge)的多肽的核酸分子，(b)遗传密码简并性引起的在密码子序列中与(a)或(b)中核酸分子不同的核酸分子，(c)具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸分子，和(d)(a)或(b)或(c)的互补链，将细胞或组织与候选物质接触并探测该套核酸分子表达的测试量，其中在候选物质存在的条件下表达的测试量相对于表达最初量的增加表明候选物质在治疗多种硫酸酯酶缺乏症中有用。根据本发明进一步的方面，制备在治疗多种硫酸酯酶缺乏症和/或其它硫酸酯酶缺乏症中有用的药剂的方法被提供。根据本发明又一方面，固相核酸分子阵列被提供。阵列基本上由固定于固相基质的一套核酸分子、其表达产物或其片段(或是核酸的或是多肽分子的)组成，每一核酸分子编码选自下面的多肽：seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6。在某些实施方案中，固相阵列进一步包含至少一种对照核酸分子。在一定的实施方案中，该套核酸分子包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或甚至至少五种核酸分子，每一种选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6。根据本发明进一步的方面，用于在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括对需要这种治疗的受试者施用已根据本发明生产出的硫酸酯酶，用量为在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的有效量，而此硫酸酯酶缺乏症不是多种硫酸酯酶缺乏症。在重要的实施方案中，通过已与调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂接触的细胞产生硫酸酯酶。在一定的实施方案中,硫酸酯酶缺乏症包括但不限于粘多糖病ii(mpsii；hunter综合症),粘多糖病iiia(mpsiiia；sanfilippo综合症a),粘多糖病viii(mpsviii),粘多糖病iva(mpsiva；morquio综合症a),粘多糖病vi(mpsvi；maroteaux-lamy综合症),异常染性脑白质营养不良(mld),x-连锁的隐性点状软骨发育不全1,或x-连锁的鱼鳞病(类固醇硫酸酯酶缺乏症)。在一定的实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂可以是本发明的核酸分子或肽。在一种实施方案中，硫酸酯酶和调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂在同一细胞中共表达。硫酸酯酶和/或调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂可以是内源性或外源性的来源。如果是内源性来源，它可被活化(例如，通过在本领域中已知的合适的位置插入强启动子和/或其它元件)。如果是外源性的，其表达可被表达载体上的元件所驱动，或它可靶向于细胞基因组中合适的位置以允许其被增强的表达(例如，强启动子下游)。根据本发明又一方面，药物组合物被提供。组合物包含治疗硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的某种试剂，该试剂含有本发明的分离的核酸分子或其表达产物，及药学上可接受的载体。根据本发明更进一步的方面，用于在细胞中增加硫酸酯酶活性的方法被提供。方法包括将表达硫酸酯酶的细胞与本发明的分离的核酸分子(例如，权利要求1-8中任一项的分离的核酸分子，具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的fge核酸分子)或其表达产物(例如，权利要求11-15,19,20的多肽,或具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽)接触，用量为在细胞中增加硫酸酯酶活性的有效量。细胞可表达内源性和/或外源性的硫酸酯酶。在重要的实施方案中，内源性的硫酸酯酶被活化。在一定的实施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和/或hsulf-6。在一定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。根据本发明又一方面，药物组合物被提供。组合物包含治疗硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的被细胞产生的硫酸酯酶，和药学上可接受的载体，其中所述细胞已与包含本发明的分离的核酸分子(例如，权利要求1-8中的,或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸分子),或其表达产物(例如，选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的肽)的试剂接触。根据本发明又一方面，分离的人fge基因的变体等位基因(其编码变体fge多肽)被提供。分离的变体等位基因包含某一氨基酸序列，该氨基酸序列在seqidno:2中至少包含一个变异，其中这至少一个变异包含:met1arg；met1val；leu20phe；ser155pro；ala177pro；cys218tyr；arg224trp；asn259ile；pro266leu；ala279val；arg327stop；cys336arg；arg345cys；ala348pro；arg349gln；arg349trp；arg349trp；ser359stop；或其组合。根据本发明又一方面，分离的人类变体fge多肽被提供。分离的人类变体fge多肽包含某一氨基酸序列，该氨基酸序列在seqidno:2中至少含有一个变异，其中这至少一个变异包含:met1arg；met1val；leu20phe；ser155pro；ala177pro；cys218tyr；arg224trp；asn259ile；pro266leu；ala279val；arg327stop；cys336arg；arg345cys；ala348pro；arg349gln；arg349trp；arg349trp；ser359stop；或其组合。以前述任何人类变体fge多肽为免疫原的抗体也被提供。这类抗体包括多克隆抗体、单克隆、嵌合的抗体，也可被进行可探测性的标记。可探测性的标记也许包含放射性元素，荧光化学物或酶。根据本发明又一方面，产生硫酸酯酶的细胞被提供，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率得到增加。细胞包含：(i)表达增强的硫酸酯酶，和(ii)表达增强的甲酰甘氨酸生成酶，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率(即,硫酸酯酶的比活性)相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率至少增加5％。在一定的实施方案中，被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，增加了至少10％,15％,20％,50％,100％,200％,500％,1000％。根据本发明进一步的方面，在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的改进方法被提供。方法包括以在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的有效量对需要这种治疗的受试者施用硫酸酯酶，其中硫酸酯酶与有效增加硫酸酯酶比活性的量的甲酰甘氨酸生成酶接触。在重要的实施方案中，硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6。在一定的实施方案中，甲酰甘氨酸生成酶被权利要求1-8的核酸分子或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸所编码。在某些实施方案中，甲酰甘氨酸生成酶是权利要求11-15,19,20的肽，或是具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽。本发明的这些和其它目标将被进一步结合本发明详细描述进行详述。序列简述seqidno:1是人fgecdna的核苷酸序列。seqidno:2是人fgecdna(seqidno:1)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:3是编码seqidno:2的多肽的人fgecdna的核苷酸序列(即,seqidno:1的核苷酸20-1141)。seqidno:4是genbankacc.no.ak075459的核苷酸序列。seqidno:5是seqidno:4翻译产物的预期氨基酸序列，一未命名的具有genbankacc.no.bac11634的蛋白产物。seqidno:6是人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶cdna(genbankacc.no.m58342)的核苷酸序列。seqidno:7是人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶cdna(seqidno:6)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:8是人硫酸胺酶cdna(genbankacc.no.u30894)的核苷酸序列。seqidno:9是人硫酸胺酶cdna(seqidno:8)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:10是人n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶cdna(genbankacc.no.u06088)的核苷酸序列。seqidno:11是人n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶cdna(seqidno:10)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:12是人n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶cdna(genbankacc.no.z12173)的核苷酸序列。seqidno:13是人n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶cdna(seqidno:12)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:14是人芳基硫酸酯酶acdna(genbankacc.no.x52151)的核苷酸序列。seqidno:15是人芳基硫酸酯酶acdna(seqidno:14)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:16是人芳基硫酸酯酶bcdna(genbankacc.no.j05225)的核苷酸序列。seqidno:17是人芳基硫酸酯酶bcdna(seqidno:16)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:18是人芳基硫酸酯酶ccdna(genbankacc.no.j04964)的核苷酸序列。seqidno:19是人芳基硫酸酯酶ccdna(seqidno:18)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:20是人芳基硫酸酯酶dcdna(genbankacc.no.x83572)的核苷酸序列。seqidno:21是人芳基硫酸酯酶dcdna(seqidno:20)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:22是人芳基硫酸酯酶ecdna(genbankacc.no.x83573)的核苷酸序列。seqidno:23是人芳基硫酸酯酶ecdna(seqidno:22)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:24是人芳基硫酸酯酶fcdna(genbankacc.no.x97868)的核苷酸序列。seqidno:25是人芳基硫酸酯酶fcdna(seqidno:24)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:26是人芳基硫酸酯酶gcdna(genbankacc.no.bc012375)的核苷酸序列。seqidno:27是人芳基硫酸酯酶g(seqidno:26)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:28是hsulf-1cdna(genbankacc.no.ay101175)的核苷酸序列。seqidno:29是hsulf-1cdna(seqidno:28)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:30是hsulf-2cdna(genbankacc.no.ay101176)的核苷酸序列。seqidno:31是hsulf-2cdna(seqidno:30)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:32是出现于硫酸酯酶的高度保守的六肽l/v-fgly-x-p-s-r。seqidno:33是合成的fgly形成底物；其一级序列是来源于人芳基硫酸酯酶a。seqidno:34是混杂寡肽pvslptrscaalltgr。seqidno:35是ser69寡肽pvslstpsraalltgr。seqidno:36是人fge-特异性引物1199nc。seqidno:37是人fge-特异性正向引物1c。seqidno:38是人fge-特异性反向引物1182c。seqidno:39是包含ecori位点的人5’-fge-特异性引物。seqidno:40是ha-特异性引物。seqidno:41是c-myc-特异性引物。seqidno:42是rgs-his6-特异性引物。seqidno:43是来自人fge制备物的胰蛋白酶解寡肽sqntpdssasnlgfr。seqidno:44是来自人fge制备物的胰蛋白酶解寡肽mvpipagvftmgtddpqik。seqidno:45是人fge2平行进化同源物(paralog)(genbankgi:24308053)的核苷酸序列。seqidno:46是人fge2平行进化同源物(seqidno:45)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:47是小鼠fge平行进化同源物(genbankgi:26344956)的核苷酸序列。seqidno:48是小鼠fge平行进化同源物(seqidno:47)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:49是小鼠fge定向进化同源物(ortholog)(genbankgi:22122361)的核苷酸序列。seqidno:50是小鼠fge定向进化同源物(seqidno:49)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:51是果蝇fge定向进化同源物(genbankgi:20130397)的核苷酸序列。seqidno:52是果蝇fge定向进化同源物(seqidno:51)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:53是蚊子fge定向进化同源物(genbankgi:21289310)的核苷酸序列。seqidno:54是蚊子fge定向进化同源物(seqidno:53)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:55是密切相关的s.coelicolorfge定向进化同源物(genbankgi:21225812)的核苷酸序列。seqidno:56是s.coelicolorfge定向进化同源物(seqidno:55)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:57是密切相关的c.efficiensfge定向进化同源物(genbankgi:25028125)的核苷酸序列。seqidno:58是c.efficiensfge定向进化同源物(seqidno:57)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:59是n.aromaticivoransfge定向进化同源物(genbankgi:23108562)的核苷酸序列。seqidno:60是n.aromaticivoransfge定向进化同源物(seqidno:59)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:61是m.lotifge定向进化同源物(genbankgi:13474559)的核苷酸序列。seqidno:62是m.lotifge定向进化同源物(seqidno:61)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:63是b.fungorumfge定向进化同源物(genbankgi:22988809)的核苷酸序列。seqidno:64是b.fungorumfge定向进化同源物(seqidno:63)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:65是s.melilotifge定向进化同源物(genbankgi:16264068)的核苷酸序列。seqidno:66是s.melilotifge定向进化同源物(seqidno:65)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:67是微颤菌属物种fge定向进化同源物(genbankgi:14518334)的核苷酸序列。seqidno:68是微颤菌属物种fge定向进化同源物(seqidno:67)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:69是p.putidakt2440fge定向进化同源物(genbankgi:26990068)的核苷酸序列。seqidno:70是p.putidakt2440fge定向进化同源物(seqidno:69)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:71是r.metalliduransfge定向进化同源物(genbankgi:22975289)的核苷酸序列。seqidno:72是r.metalliduransfge定向进化同源物(seqidno:71)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:73是p.marinusfge定向进化同源物(genbankgi:23132010)的核苷酸序列。seqidno:74是p.marinusfge定向进化同源物(seqidno:73)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:75是c.crescentuscb15fge定向进化同源物(genbankgi:16125425)的核苷酸序列。seqidno:76是c.crescentuscb15fge定向进化同源物(seqidno:75)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:77是m.tuberculosisht37rvfge定向进化同源物(genbankgi:15607852)的核苷酸序列。seqidno:78是m.tuberculosisht37rvfge定向进化同源物(seqidno:77)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:79是出现在fge定向进化同源物和平行进化同源物的亚结构域3的高度保守六肽。seqidno:80是具有genbankacc.no.:ca379852的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:81是具有genbankacc.no.:ai721440的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:82是具有genbankacc.no.:bj505402的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:83是具有genbankacc.no.:bj054666的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:84是具有genbankacc.no.:al892419的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:85是具有genbankacc.no.:ca064079的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:86是具有genbankacc.no.:bf189614的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:87是具有genbankacc.no.:av609121的fge定向进化同源物est片段的核苷酸序列。seqidno:88是hsulf-3cdna核苷酸序列.seqidno:89是hsulf-3cdna(seqidno:88)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:90是hsulf-4cdna核苷酸序列.seqidno:91是hsulf-4cdna(seqidno:90)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:92是hsulf-5cdna核苷酸序列.seqidno:93是hsulf-5cdna(seqidno:92)的翻译产物的预期氨基酸序列。seqidno:94是hsulf-6cdna核苷酸序列.seqidno:95是hsulf-6cdna(seqidno:94)的翻译产物的预期氨基酸序列。附图简述图1:在缺乏(a)或存在(b)来自牛睾丸微粒体的可溶性抽提物的条件下培育后的p23的maldi-tof质谱图示。图2:来源于人fge和pfam-duf323种子的21种蛋白的排列的系统发生树。图3:人和鼠fge基因位点的组织。外显子显示为以盒子和亮盒子(鼠的位点)表示。内含子线上的数字指出了以kb表示的内含子大小。图4:显示fge表达质粒pxmg.1.3结构图的图表。图5:柱状图描述以fge表达质粒瞬时转染的36f细胞中的n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶活性。图6:柱状图描述以fge表达质粒瞬时转染的36f细胞中的n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶比活性。图7:柱状图描述以fge表达质粒瞬时转染的36f细胞中的n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶生产。图8:描述以fge表达质粒瞬时转染的30c6细胞中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性。图9:描述了囊括本发明的特征的试剂盒。发明详述本发明包括对编码甲酰甘氨酸生成酶(fge)的基因的发现，此酶负责发生在硫酸酯酶上的对硫酸酯酶功能必需的独特翻译后修饰：形成l-cα-甲酰甘氨酸(a.k.a.fgly和/或2-氨基-3-氧代丙酸)。已发现，出人意料地，fge基因中的突变引起受试者中的多种硫酸酯酶缺乏症(msd)的发展。也已发现，出人意料地，fge增强硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6,及在申请号为20030073118,20030147875,20030148920,20030162279和20030166283的u.s.临时申请中所述的硫酸酯酶(其内容被清楚地整合在本文中)。考虑到这些发现，本发明的分子可用于诊断和/或治疗多种硫酸酯酶缺乏症，以及其它硫酸酯酶缺乏症的治疗。在诊断多种硫酸酯酶缺乏症中应用本发明的分子的方法被提供。此外，为了对硫酸酯酶上fgly的形成进行调节的目的而在体内或体外应用这些分子的方法，治疗与这种修饰相关的病症的方法，及在制备用于治疗多种硫酸酯酶缺乏症及其它硫酸酯酶缺乏症的治疗性制剂中有用的组合物也被提供。本发明因此在几个方面中包括调节硫酸酯酶上的fgly的形成的多肽，编码这些多肽的分离的核酸，前述的功能性修饰物和变体，前述的有用片段，以及治疗、诊断和研究的方法、组合物和与其相关的工具。“cα-甲酰甘氨酸生成活性”指分子在底物上形成fgly或增强fgly形成的能力。底物也许是如本文其它部分所述的硫酸酯酶，或合成的寡肽(参见，例如seqidno:33，和实施例)。底物优选包含seqidno:32的保守六肽[l/v-c(s)-x-p-s-r]。分析fgly形成的方法如本领域中(参见，例如dierks,t.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1997,94:11963-11968),和本文其它部分(参见，例如实施例)所描述。在本文中所用的“分子”包含“核酸”和“多肽”。fge分子能在体内和体外形成fgly，或增强/增加fgly的形成。在本文中所用的“增强(或“增加”)”cα-甲酰甘氨酸生成活性，典型地指增加fge和/或它编码的多肽表达。增加的表达指增加(即,到可探测的程度)本发明任意核酸(如本文其它部分所描述的fge核酸)的复制、转录和/或翻译，既然上调任何这些过程将导致基因(核酸)所编码多肽的浓度/数量的增加。增强(或增加)cα-甲酰甘氨酸生成活性也指防止或抑制fge的降解(例如通过增加的泛素化作用)、下调等，所述降解和下调导致例如相对于对照被增加的或稳定的fge分子t1/2(半衰期)。下调或减少的表达指基因和/或它编码的多肽减少的表达。通过使用本领域已知的任何适合的方法例如核酸杂交或抗体探测方法，分别探测基因(例如fge)mrna水平或基因所编码的多肽的蛋白表达水平相对于对照的增加或是减少，可直接测定基因表达的上调或下调。fge基因表达的上调或下调也能通过探测cα-甲酰甘氨酸生成活性的变化而间接测定。在本文中所用的“表达”指核酸和/或多肽表达，以及多肽分子的活性(例如分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性)。本发明的一个方面包括对编码fge的cdna的克隆。根据本发明的fge是包含seqidno:1的核酸分子的分离的核酸分子，并编码具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。人fgecdna的序列以seqidno:1而出现，此cdna编码的蛋白产物的预期氨基酸序列以seqidno:2出现。在本文中所用的受试者是哺乳动物或非人类的哺乳动物。在所有实施方案中，人fge和人受试者都是优选。本发明因此在一个方面包括分离的fge多肽，编码此多肽的cdna，前述的功能性修饰物和变体，前述的有用片段，以及与其相关的诊断和治疗。在本文中所用的关于核酸的术语“分离的”表示：(i)在体外通过例如聚合酶链式反应(pcr)所扩增的；(ii)通过克隆所重组性地产生的；(iii)如通过切断和凝胶分离所纯化的；或(iv)通过例如化学合成所合成。分离的核酸是容易通过本领域众所周知的重组dna技术操作的类型。因此，包含在一定载体中的核苷酸序列被认为是分离的，其中所述载体的5’和3’限制性位点已知或者其聚合酶链式反应(pcr)引物序列已被公开，但在其天然宿主中以其天然状态存在的核酸不是分离的。分离的核酸可被充分纯化，但不必这样。例如，在克隆或表达载体内的分离的核酸不纯，这在于它在其寄生的细胞中也许只包含很少百分比的物质。然而，这种核酸是分离的，如本文中所用的术语一样，因为它容易通过本领域中一般技术人员所知道的标准技术被操作。在本文中所用的关于多肽的术语“分离的”表示从其天然环境中被以充分纯的形式分开以至于它可被操作于或用于本发明的任一目的。因此，“分离的”表示纯度足以(i)用于生产和/或分离抗体，(ii)用作分析中的试剂，(iii)用于测序，(iv)用作治疗等。根据本发明,编码具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的fge多肽的分离的核酸分子包括：(a)核酸分子，其在严格条件下与seqidno:1的核酸所组成的分子杂交并编码具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的fge多肽，(b)(a)的删除、添加和置换物，其编码各自的具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的fge多肽，(c)因为遗传密码简并性而与(a)或(b)的核酸分子在密码子序列中不同的核酸分子，和(d)(a),(b)或(c)的互补链。在本文中所用的“互补链”包括“(a),(b)或(c)的全长互补链或100％的互补链”。也具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的本发明的fge核酸的同源物和等位基因也被本发明所包含。本文所述的同源物，包括本文其它部分所鉴别的分子(参见例如seqidnos:4,5,45-78,和80-87)即定向进化同源物和平行进化同源物。进一步的，同源物能依照本发明的指导以及传统技术所鉴别。既然本文所述的fge同源物全都具有cα-甲酰甘氨酸生成活性，它们能与人fge分子在本发明的所有方面中互换性使用。因此，本发明的一个方面是那些编码fge多肽并在严格条件下与seqidno:1的编码区所组成的核酸分子杂交的核酸序列。在重要的实施方案中，如在此所用的术语“严格条件”指本领域所熟悉的参数。对核酸，被称为严格的杂交条件典型的是在低离子强度和恰好低于dna杂交复合物熔点(tm)(典型地，低于杂交物tm约3℃)的温度下。更高的严格性限定了探针序列和靶之间更专一的相关性。核酸杂交中所用的严格条件在本领域中众所周知，可在汇编这类方法的参考文献中找到，例如molecularcloning:alaboratorymanual,j.sambrook等编,secondedition,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989,或currentprotocolsinmolecularbiology,f.m.ausubel等编,johnwiley&sons,inc.,newyork.“严格条件”的实例是在6xssc中于65℃下杂交。另一严格条件的实例是在杂交缓冲液中于65℃下杂交，杂交缓冲液由3.5xssc,0.02％ficoll,0.02％聚乙烯吡咯烷酮,0.02％牛血清白蛋白,2.5mmnah2po4[ph7],0.5％sds,2mmedta组成(ssc是0.15m氯化钠/0.15m柠檬酸钠,ph7；sds是十二烷基硫酸钠；而edta是乙二胺四乙酸)。杂交之后，转上dna的膜在2xssc中于室温下清洗，然后在最高68℃的温度下于0.1xssc/0.1xsds中清洗。在进一步的实施例中，杂交水溶液的使用的替代是杂交甲酰胺溶液的使用。应用例如50％甲酰胺溶液和42℃，严格的杂交条件能因此被实现。有其它能被应用的条件、试剂等，并将导致类似的严格程度。技术人员将熟悉这类条件，因此它们不在这里给出。然而，需要被理解的是，技术人员将能以允许清晰鉴别本发明fge核酸的同源物和等位基因的方式操控条件。技术人员也将熟悉对于细胞和之后将被常规分离的这类分子的表达库进行筛选，然后再分离相关的核酸分子和序列的方法。一般地，同源物和等位基因典型地将分别与seqidno:1和seqidno:2具有至少40％核苷酸同一性和/或至少50％氨基酸同一性，在某些情况下将具有至少50％核苷酸同一性和/或至少65％氨基酸同一性，而在其它情况下将具有至少60％核苷酸同一性和/或至少75％氨基酸同一性。在进一步的情形中，同源物和等位基因典型地将分别与seqidno:1和seqidno:2具有至少90％,95％或甚至99％的核苷酸同一性和/或至少95％,98％或甚至99％的氨基酸同一性。同一性可应用多种由ncbi(bethesda,maryland)开发的公开可得的软件工具计算得到。示例的工具包括altschulsf等的启发式算法(jmolbiol,1990,215:403-410),也称为blast。pairwise和clustalw比对(blosum30矩阵设置)以及kyte-doolittle水疗分析可应用公开(embl,heidelberg,germany)和商业(例如来自oxfordmoleculargroup/geneticscomputergroup,madison,wi的macvector序列分析软件)的类型而获得。前述核酸的watson-crick互补链也被本发明所包括。在对fge相关基因如fge的同源物和等位基因的筛选中，southern印迹可应用前述条件以放射性探针来完成。对dna最终转移上去的膜进行清洗之后，此膜可放置到x-射线胶片或磷成像平板(phosphoimagerplate)以探测放射性信号。在此给定关于全长人fgecdna克隆的指导，则对应于人fge基因的其它哺乳动物序列如小鼠cdna克隆可应用标准菌落杂交技术从cdna库中分离。本发明也包括含有天然物质中出现的那些密码子的替代物的简并核酸。例如，丝氨酸残基被密码子tca,agt,tcc,tcg,tct和agc编码。因此，本领域一般技术人员将很明白，任何丝氨酸编码核苷酸三联体可被用于在体内或体外指导蛋白质合成装置，以将丝氨酸残基整合进入正在延伸的fge多肽。类似地，编码其它氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括但不限于：cca,ccc,ccg和cct(脯氨酸密码子)；cga,cgc,cgg,cgt,aga和agg(精氨酸密码子)；aca,acc,acg和act(苏氨酸密码子)；aac和aat(天冬酰胺密码子)；及ata,atc和att(异亮氨酸密码子)。其它氨基酸残基可类似地被若干核苷酸序列编码。因此，本发明包括与生物学上分离的核酸在密码子序列中因遗传密码简并性而有所不同的简并核酸。本发明也提供分离的seqidno:1或seqidno:3或其互补链的独特片段。独特片段是这样的类型，它是更大的核酸的“标志”。例如，独特片段长度足以确保其精确序列无法在人基因组中位于上述fge核酸(及人的等位基因)之外的分子中找到。那些本领域中的一般技术人员可不必应用常规之外的程序来测定片段是否在人基因组中是独特的。然而，独特片段排除完全由选自seqidno:4和/或其它如本申请的申请日以前发表过的序列的核苷酸序列所组成的片段。完全由前述genbank保藏库描述的序列所组成的片段不包括任何对于本发明序列而言独特的核苷酸。因此，根据本发明的独特片段必须包含除那些genbank保藏库中的确切序列或其片段之外的核苷酸序列。区别可以是相对于genbank序列的添加、删除或置换，或可以是完全不同于genbank序列的序列。独特片段能在southern和northern印迹分析中用作探针以鉴别这类核酸，或能用于如那些采用pcr的扩增分析。如本领域技术人员已知的，大探针如200,250,300或更多的核苷酸优选用于一定的应用如southern和northern印迹，而更小的片段将优选用于例如pcr。独特片段也能被用于产生融合蛋白，以产生抗体或测定如实施例中证明的多肽片段的结合或产生免疫分析组分。同样地，独特片段可被用于产生例如在抗体制备、免疫分析或治疗应用中有用的fge多肽非融合片段。独特片段进一步地可被用作反义分子以抑制fge核酸和多肽各自的表达。如将被本领域技术人员所认识到的一样，独特片段的大小将依赖于其遗传密码中的保守性。因此，seqidno:1或seqidno:3的部分区域和互补链将需要更长的节段来实现独特，而其它的只需要短节段，典型的是长12和32个核苷酸之间(例如12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31和32碱基)或更长，长到公开序列的全长。如上述所提及的，此公开内容倾向于包含每一序列的每一片段，起点在第一核苷酸、第二核苷酸等等，直到离末端剩下8个核苷酸，而终点在从第8、9、10核苷酸等等开始直到恰好最后一个核苷酸的任何位置(前提为序列是如上述的独特片段)。事实上seqidno:1区域的以核苷酸1开始而在核苷酸1180终止或seqidno：3区域的以核苷酸1开始而在核苷酸1122终止的任何节段或其互补链，长度为20或更多核苷酸都将是独特的。本领域技术人员对选择这类序列的方法(一般是基于独特片段选择性区分目的序列与人类基因组中其它序列的能力)很精通，虽然可以进行体外的证实性的杂交和序列分析。如上述所提及的,本发明包含选择性结合编码fge多肽的核酸分子以减少fge活性的反义寡核苷酸。在本文中所用的术语“反义寡核苷酸”或“反义”描述一定的寡核苷酸，该寡核苷酸是在生理条件下与包含特定基因的dna或该基因的mrna转录产物杂交，而因此抑制该基因的转录和/或该mrna的翻译的寡核糖核苷酸,寡脱氧核糖核苷酸,修饰后的寡核糖核苷酸,或修饰后的寡脱氧核糖核苷酸。反义分子被设计成与靶基因或转录物杂交以干扰靶基因的转录或翻译。本领域技术人员将认识到反义寡核苷酸的确切长度和它与其目标互补的程度将依赖于所选的特异靶，包括靶的序列和构成那一序列的特定碱基。优选反义寡核苷酸被构建和安排成在生理条件下选择性地与靶结合，即相对于靶细胞中的任何其它序列在生理条件下更充分地与靶序列杂交。基于seqidno:1或基于等位基因或同源基因组和/或cdna序列，本领域中的技术人员能容易地挑选和合成出大量合适的反义分子中的任何类型以根据本发明而应用。为了具有充分的选择性和充分有能力进行抑制，这类反义寡核苷酸应包含与靶互补的至少10个和更多连续碱基，优选至少15个，虽然在某些情形中长度短至7个碱基的修饰后的寡核苷酸被成功用作反义寡核苷酸(wagner等,nat.med,1995,1(11):1116-1118；nat.biotech.,1996,14:840-844)。最优选的是，反义寡核苷酸包含20－30个碱基的互补序列。虽然对基因或mrna转录物任何区段反义的寡核苷酸可被选出，在优选实施方案中，反义寡核苷酸对应于n端或5’上游位点例如翻译起点、转录起点或启动子位点。此外，3’-非翻译区可被反义寡核苷酸所靶向。对mrna拼接位点的靶向也在本领域中应用，但如果替代性的mrna拼接发生，则可能不是那么被优选。此外，反义物优选靶向于不希望出现mrna二级结构(参见，例如sainio等,cellmol.neurobiol.14(5):439-457,1994)和不希望出现蛋白结合的位点。最后，虽然seqidno:1公开了cdna序列，本领域中的一般技术人员可容易地得到对应于此序列的基因组dna。因此,本发明也提供与对应于seqidno:1的基因组dna互补的反义寡核苷酸。类似地，等位基因或同源fgecdnas和基因组dnas的反义物也能应用，而不需要过度的实验。在一组实施方案中，本发明的反义寡核苷酸可由“天然”脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,或它们的任意组合所组成。也就是，一种天然核苷酸的5’末端和另一天然核苷酸的3’末端可通过核苷间的磷酸二酯键共价连接，如在天然系统中的一样。这些寡核苷酸可通过领域内认可的方法制备，所述方法可人工或通过自动合成仪而实施。它们也可通过载体被重组性地产生。然而，在优选的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸也可包括“修饰后的”寡核苷酸。也就是，寡核苷酸可通过许多不会阻止它们杂交至其目标但增强它们的稳定性或靶向性或者增强它们的治疗效力的方式被修饰。在本文中所用的术语“修饰后的寡核苷酸”描述这样的寡核苷酸，其中(1)其核苷酸中的至少两个通过合成性的核苷间连接而共价连接(即,一个核苷酸5’末端和另一核苷酸3’末端之间除磷酸二酯键之外的连接)和/或(2)通常不与核酸连接的化学基团已被共价附着到寡核苷酸。优选的合成性核苷间连接是硫代磷酸酯,烷基膦酸酯,二硫代磷酸酯,磷酸酯,烷基硫代硫酸酯(alkylphosphonothioates),氨基磷酸酯,氨基甲酸酯,碳酸酯,磷酸三酯,acetamidates,羧甲基酯和肽。术语“修饰后的寡核苷酸”也包括具有被共价修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸。例如，修饰后的寡核苷酸包括具有已在除3’位置羟基和5’位置磷酸基之外的位置共价附着到低分子量有机基团的糖骨架的寡核苷酸。因此修饰后的寡核苷酸可包括2’-o-烷基化核糖基团。此外，修饰后的寡核苷酸可包括糖，例如代替核糖的阿拉伯糖。本发明因此涉及含有修饰后的反义分子与药学上可接受的载体的药物制剂，所述反义分子与编码fge多肽的核酸互补并在生理条件下杂交。反义寡核苷酸可作为药物组合物的一部分被施用。这类药物组合物可包括与任何本领域中已知的生理性和/或药学上可接受的标准载体组合的反义寡核苷酸。组合物应是消毒过的，并以适合对患者施用的单位重量或体积而含有药学有效量的反义寡核苷酸。术语“药学上可接受的”表示不干扰活性成分的生物活性的效力的非毒性物质。术语“生理上可接受的”指与生物系统如细胞、细胞培养物、组织或器官相容的非毒性物质。载体的特征将依赖于施用途经。生理上和药学上可接受的载体包括本领域众所周知的稀释剂、填充物、盐、缓冲剂、稳定物、增溶剂和其它物质。本发明也包括在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法。在重要的实施方案中，这通过应用载体(“表达载体”和/或“靶向载体”)而完成。在本文中所用的“载体”可以是多种某类核酸中的任何类型，所需序列可通过限制和连接而插入所述核酸以在不同遗传环境间运输或在宿主细胞中表达。载体典型地由dna组成，虽然rna载体也可用。载体包括但不限于质粒、噬菌粒和病毒基因组。克隆载体是能在宿主细胞中复制，并进一步以一个或更多核酸内切酶限制性位点为特征的类型，载体能以可测方式在所述核酸内切酶限制性位点处被切断，所需dna序列可连接进入所述位点处而使得新重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情形中，所需序列的复制可因为质粒在宿主菌内增加拷贝数目而发生很多次，或在宿主通过有丝分裂而复制之前在每一宿主中恰好单独一次。在噬菌体的情形中，复制可在裂解期期间主动发生或在溶原期被动发生。“表达载体”是这样的类型，所需dna序列(例如seqidno:3的fgecdna)通过限制和连接插入其中而使得所需dna序列被可操作性地连接于调节序列并可表达为rna转录物。载体可进一步包含一个或更多适合用于鉴别细胞已被或未被载体转化或转染的标记序列。标记包括，例如增加或减少对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的编码基因,其活性通过本领域中已知的标准分析可测的酶(例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的编码基因，及可视性地影响转化或转染细胞、宿主、菌落或菌斑的表型(如绿色荧光蛋白)的基因。“靶向载体”是典型地含有一定靶向性结构/序列的类型，所述靶向性结构/序列用于例如在内源性基因中(例如，在外显子和/或内含子序列内)，内源性基因启动子序列中，或内源性基因启动子序列上游插入调节序列。在另一实施例中，靶向载体可包含目的基因(例如seqidno:1的cdna所编码的)和对基因靶向于基因组中优选位置所需的其它序列(例如，转录活跃位置如无关基因的内源启动子下游)。靶向性构建体和载体的构建在u.s.patents5,641,670和6,270,989中详细描述，其被清楚地整合在本文中作为参考。事实上，任何能被异源性dna或rna转化并能在培养基中生长或保存的细胞(原核或真核),可被用在本发明的实践中。实施例包括细菌细胞如大肠杆菌,昆虫细胞,和哺乳动物如人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类等的细胞。它们可以是原代或次级细胞株(其在培养中显示有限数目的平均群体倍增而不是永久的)和永久的细胞系(其在培养中显示明显的无限寿命)。原代和次级细胞包括，例如，成纤维细胞,角质化细胞,上皮细胞(例如乳腺上皮细胞,肠上皮细胞),内皮细胞,神经胶质细胞,神经细胞,血液的组成成分(例如淋巴细胞,骨髓细胞),肌肉细胞和这些体细胞类型的前体包括胚胎干细胞。在细胞将被在基因治疗中应用时，原代细胞优选从施予操作后的细胞的个体中获得。然而，原代细胞能从相同物种的供体(而不是受体)获得。可与本发明的dna构建物和方法一起应用的永久的人细胞系实例包括但不限于ht-1080细胞(atccccl121),hela细胞和hela细胞衍生物(atccccl2,2.1和2.2),mcf-7乳腺癌细胞(atccbth22),k-562白血病细胞(atccccl243),kb癌细胞(atccccl17),2780ad卵巢癌细胞(vanderblick,a.m.等,cancerres,48:5927-5932(1988),raji细胞(atccccl86),widr结肠腺癌细胞(atccccl218),sw620结肠腺癌细胞(atccccl227),jurkat细胞(atcctib152),namalwa细胞(atcccrl1432),hl-60细胞(atccccl240),daudi细胞(atccccl213),rpmi8226细胞(atccccl155),u-937细胞(atcccrl1593),bowes黑色素瘤细胞(atcccrl9607),wi-38va13亚系2r4细胞(atcccll75.1),和molt-4细胞(atcccrl1582),cho细胞,和cos细胞,以及通过人细胞和另一物种细胞融合而产生的异杂交瘤细胞。次级人成纤维细胞株,如wi-38(atccccl75)和mrc-5(atccccl171)也可被应用。对可在实践本发明的方法中应用的细胞类型的进一步讨论，在u.s.patents5,641,670和6,270,989中被描述。无细胞的转录系统也可代替细胞。本发明的细胞被保存在本领域已知的条件下，这将引起fge蛋白或其功能性片段的表达。应用所述方法，表达的蛋白可从细胞裂解物或细胞上清中纯化。根据此方法制得的蛋白质能被制成药学上有用的配剂，并通过本领域中已知的传统药学途径而递送至人或非人的动物(例如口服,静脉内,肌肉内,鼻内,气管内或皮下)。如本文其它部分所描述的，重组细胞可以是永生化的、原代的或次级的细胞，优选人的细胞。来自其它物种的细胞的应用可在一定的情形中是合意的，所述情形为非人细胞有利于在所产生的非人fge在药学上有用的情况下的蛋白产生的目的。在本文中所用的编码序列和调控序列，当它们以将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制之下的方式而共价连接时，被表述成“可操作性地”连接。如果期望编码序列被翻译成功能性蛋白质，而假如5’调控序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录，并且两个dna序列间的连接(1)不会导致移码突变的引入，(2)不会干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)不会干扰相应的rna转录物被翻译成为蛋白的能力，则两个dna序列被表述成“可操作性地”连接。因此，如果启动子区域能影响那一dna序列的转录从而所得的转录物可被翻译成所期望的蛋白或多肽，则启动子区域将可操作性地连接编码序列。基因表达所需的调控序列的精确本质可在物种或细胞类型间变动，但将一般性地包括，如所必需的，于转录和翻译各自启动有关的5’非转录和5’非翻译序列，如tata盒，加帽序列，caat序列和类似物。尤其是，这类5’非转录调控序列将包括包含对可操控性连接的基因进行转录控制的启动子序列的启动子区域。调控序列也可包括所期望的增强子序列或上游激动子序列。本发明的载体可随意包括5’前导或信号序列。对合适载体的选择和设计是在本领域一般技术人员的能力和指导之内。包含所有表达必需的元件的表达载体可商业性地获得，并为本领域技术人员所知。参见，例如sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition,coldspringharborlaboratorypress,1989。细胞通过编码fge多肽或其片段或变体的异源性dna(rna)被引入而基因工程化。那一dna(rna)被置于转录元件的可操作性控制之下，以允许异源dna在宿主细胞中的表达。用于在哺乳动物细胞中表达mrna的优选系统例如包含选择标记如给予g418抗性的基因(其促进对稳定性转染的细胞系的选择)和人细胞巨化病毒(cmv)增强子-启动子序列的prc/cmv(可从invitrogen,carlsbad,ca得到)。此外，适合在灵长类和犬类细胞系中进行表达的类型有pcep4载体(invitrogen,carlsbad,ca)，其包含促进质粒作为多拷贝的染色体外元件而保存的eb病毒(ebv)复制起点。另一表达载体是包含多肽延伸因子1α的启动子的pef-bos质粒，其有效刺激了体外的转录。质粒被mishizuma和nagata(nuc.acidsres.18:5322,1990)描述，而其在转染实验中的应用已得到公开，例如，demoulin(mol.cell.biol.16:4710-4716,1996)。又一优选的表达载体是stratford-perricaudet所述的腺病毒，其e1和e3蛋白有缺陷(j.clin.invest.90:626-630,1992)。腺病毒作为adeno.p1a重组体的应用被warnier等所公开，用于在小鼠皮内注射以得到抗p1a的免疫化(int.j.cancer,67:303-310,1996)。本发明也包括所谓的表达试剂盒，其允许技术人员制备所期望的表达载体或载体。这类表达试剂盒至少包括每一前面讨论的编码序列的单独部分。其它成分可按需要添加，只要前面提到的所需的序列被包括在内。也应认识到，本发明包含上述的包含表达fgecdna序列的载体转染宿主细胞和细胞系的应用，这些细胞是原核(例如大肠杆菌)或真核性(例如cho细胞,cos细胞,酵母表达系统和在昆虫细胞中表达的杆状病毒)的。尤其有用的是哺乳动物细胞如人,小鼠,仓鼠,猪,山羊,灵长动物等的细胞。它们可以是多种组织类型，包括如本文其它部分所描述的原代细胞和永生化的细胞系。具体实例包括ht-1080细胞,cho细胞,树状细胞,u293细胞,外周血白细胞,骨髓干细胞,胚胎干细胞,和昆虫细胞。本发明也允许细胞和动物中的fge基因“敲除”的构建，为研究fge活性的某些方面提供材料。本发明也提供被前述fge核酸编码的分离的多肽(包括完整蛋白和部分蛋白)，也包括seqidno:2的多肽和其独特片段。这类多肽可用于，例如，单独或作为融合蛋白的部分去产生作为免疫分析成分的抗体。多肽可以是从生物样本包括组织或细胞匀浆中分离的，也可是在多种原核或真核表达系统中重组性表达的，所述重组性表达通过构建适合于表达系统的表达载体，将表达载体引入表达系统，及分离重组性表达的蛋白而完成。短多肽，包括抗原性肽(如被mhc分子呈递在细胞表面以进行免疫识别的)也能应用已良好建立的肽合成方法化学合成。一般而言，fge多肽的独特片段具有如上述讨论的与核酸相关的独特片段的特征和特性。如本领域技术人员将认识到的，独特片段的大小将依赖于一定的因素，例如片段是否组成了保守蛋白结构域的一部分。因此，seqidno:2的部分区域将需要更长的片段以保证独特，而其它的只需要短片段，典型的是在5和12个氨基酸之间(例如5,6,7,8,9,10,11和12氨基酸长或者更多，包括每一整数直到全长，287个氨基酸长)。多肽的独特片段优选保持明显的多肽功能能力的那些片段。可被保持在多肽的独特片段中的功能能力包括与抗体的相互作用、与其它多肽或其片段的相互作用，与其它分子的相互作用等。一种重要的活性是作为鉴别多肽的标签而起作用的能力。本领域技术人员很精通于选择独特氨基酸序列的方法，典型的是基于独特片段从非家族成员中选择性识别出目的序列的能力。片段的序列与那些数据库中已知序列进行比较即是所需的。本发明包括上述fge多肽的变体。在本文中所用的fge多肽的“变体”是包含一种或更多对fge多肽一级氨基酸序列的修饰的多肽。创造fge多肽变体的修饰，典型的是被施加给编码fge多肽的核酸，可包括删除、点突变、截断、氨基酸置换和氨基酸或非氨基酸部分的添加，以：1)减少或消除fge多肽的活性；2)增强fge多肽的性质，如表达系统中的蛋白稳定性或蛋白-配体结合的稳定性；3)对fge多肽提供新活性或性质，如抗原性表位的添加或可探测部分的添加；或4)提供与fge多肽受体或其它分子的相等或更好的结合。替代性地，修饰可直接施加给多肽，如通过切断，连接分子的添加，可探测部分如生物素的添加，脂肪酸的添加和类似的方式。修饰也包括包含全部或部分fge氨基酸序列的融合蛋白。本领域技术人员将会熟悉预测蛋白序列变化对蛋白构象的影响的方法，并能因此根据已知方法而“设计”fge多肽的变体。这种方法的一个实例被dahiyat和mayo在science278:82-87,1997中描述,其中蛋白质可被重新设计。此方法能被应用于已知的蛋白，以仅改变多肽序列的一部分。通过应用dahiyat和mayo的计算方法，具体的fge多肽的变体可得到提议和被测试以测定变体是否保持了所期望的构象。变体可包括被专一修饰的fge多肽，所述修饰是为了改变多肽的与其生理活性无关的特征。例如，半胱氨酸残基能被置换或删除以防止不必要的二硫键连接。类似地，一定的氨基酸可被改变以通过消除表达系统中由蛋白酶作用的蛋白水解而增强fge多肽的表达(例如存在kex2蛋白酶活性的酵母表达系统中的双碱性氨基酸残基)。编码fge多肽的核酸的突变优选保存编码序列的氨基酸阅读框，并优选不在核酸中创造出很可能杂交以形成二级结构的区域，二级结构例如发卡或环结构能对变体多肽的表达有害。突变可通过选择氨基酸置换或多肽编码核酸中选定位置的随机突变而发生。变体多肽随后得到表达，并进行对一种或更多活性的检测，以测定哪个突变为变体多肽提供了期望的性质。进一步的对多肽的氨基酸序列而言沉默的突变可提供给变体(或非变体的fge多肽)，但其提供在特定宿主中优选的翻译密码子，或改变mrna的结构以，例如，增强稳定性和/或表达。优选的在例如大肠杆菌、哺乳动物细胞等中的核酸翻译密码子，对本领域中的一般技术人员而言众所周知。其它突变也可提供给fge基因或cdna克隆的非编码序列以增强多肽的表达。技术人员将意识到保守氨基酸置换可发生在fge多肽中以提供功能等同的前述多肽的变体，即，变体保持fge多肽的功能能力。在本文中所用的“保守氨基酸置换”指不显著改变三级结构和/或多肽活性的氨基酸置换。变体可根据本领域一般技术人员已知的改变多肽序列的方法而制备，并包括那些在汇编这类方法的参考文献中找到的类型，例如molecularcloning:alaboratorymanual,j.sambrook等编,secondedition,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989，或currentprotocolsinmolecularbiology,f.m.ausubel等编,johnwiley&sons,inc.,newyork。示例性的fge多肽的功能等同性变体包括对seqidno:2的保守氨基酸置换。保守氨基酸置换包括发生在下列组群内部氨基酸中间的置换：(a)m,i,l,v；(b)f,y,w；(c)k,r,h；(d)a,g；(e)s,t；(f)q,n；和(g)e,d.因此fge多肽的功能等同的变体，即，保持天然fge多肽功能的fge多肽的变体被本发明所涉及。fge多肽氨基酸序列中产生功能等同性变体的保守氨基酸置换，典型地是通过编码fge多肽的核酸(seqidnos:1,3)的改变所提供。这类置换可通过多种本领域一般技术人员已知的方法而得到。例如，氨基酸置换可通过pcr导向突变，根据kunkel的方法(kunkel,proc.nat.acad.sci.u.s.a.82:488-492,1985)的定点突变，或编码fge多肽的基因的化学合成而得到。fge多肽的功能等同片段的活性能通过：将编码改变后的fge多肽的基因克隆进细菌或哺乳动物表达载体，将载体引入合适的宿主细胞，表达改变后的fge多肽，和测试在本文中公开的fge多肽的功能能力(例如cα-甲酰甘氨酸生成活性等)，而得到测试。在本文中所述的发明具有许多应用，其中的一部分在本文其它部分被描述。首先，本发明允许对fge多肽的分离。技术从业人员众所周知的多种方法能被用于得到分离的fge分子。多肽可从天然产生多肽的细胞中通过层析方式或免疫识别而纯化。替代性地，表达载体可被引入细胞以引起多肽的产生。在另一方法中，mrna转录物可被微注射或另外地被引入细胞以引起被编码的多肽的产生。fgemrna在无细胞抽提物如网织红细胞降解系统中的翻译也可被用于产生fge多肽。本领域技术人员也可容易地遵循已知的分离fge多肽的方法。这些包括但不限于免疫层析,hplc,大小排阻层析,离子交换层析和免疫亲和层析。在一定的实施方案中，本发明也提供来源于fge多肽的“显性失活”多肽。显性失活多肽是蛋白质的失活变体，其通过与细胞机制相互作用而从活性蛋白与细胞机制的相互作用中取代了活性蛋白，或与活性蛋白竞争，而减小了活性蛋白的效应。例如，与配体结合但不会转导响应于配体结合的信号的显性失活受体能减小配体表达的生物学效应。同样地，与靶蛋白正常相互作用但不磷酸化靶蛋白的显性失活催化惰性激酶，能减少靶蛋白响应于细胞信号的磷酸化。类似地，结合到基因调控区域的启动子位置但不增加基因转录的显性失活转录因子能通过占据启动子结合位置而不增加转录来减小正常转录因子的效应。显性失活多肽在细胞中表达的最终结果是活性蛋白质的功能的减少。本领域一般技术人员能评估显性失活蛋白变体的潜力，并用标准突变技术创造一种或更多显性失活变体蛋白。参见，例如u.s.patentno.5,580,723和sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition,coldspringharborlaboratorypress,1989。技术人员随后能测试经诱变的蛋白群体的选定活性的减少和/或对这种活性的保持力。其它类似的用于创造和测试蛋白的显性失活变体的方法对本领域一般技术人员将是很显然的。fgecdna的分离也使技术人员可能诊断以fge异常表达为特征的疾病。这些方法包括测定fge基因和/或源于其的fge多肽的表达。在前者的情形下，这类测定能通过任何标准的核酸测定分析而进行，包括聚合酶链式反应，或如下面作为例子的采用标记性杂交探针的分析。在后者的情形下，这类测定能通过任何标准的(应用例如结合到分泌出的fge蛋白的抗体的)免疫分析而进行。优选的可根据本发明诊断的疾病是多种硫酸酯酶缺乏症。本发明也包括分离的肽结合试剂，所述试剂，例如，可以是具有选择性结合到fge多肽的能力的抗体或抗体片段(“结合性多肽”)。抗体包括根据传统方法制备的多克隆和单克隆抗体。在一定的实施方案中，本发明排除了与seqidno:4的核酸所编码的多肽结合的结合性试剂(例如抗体)。值得注意的是，如本领域中众所周知的，只有抗体分子的一小部分，即抗原互补位，涉及抗体与其表位的结合(参见，一般地，clark,w.r.(1986)theexperimentalfoundationsofmodernimmunologywiley&sons,inc.,newyork；roitt,i.(1991)essentialimmunology,7thed.,blackwellscientificpublications,oxford)。例如，pfc’和fc区域是补体级联的效应子但不涉及抗原结合。pfc’区域已被酶切掉的抗体或产生时不含pfc’区域的抗体，它们被称为f(ab’)2片段，保持了完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，fc区域已被酶切掉的抗体或产生时不含fc区域的抗体，它们被称为fab片段，保持了完整抗体分子的一个抗原结合位点。进一步地，fab片段由共价结合的抗体轻链和被表示为fd的抗体重链的一部分所组成。fd片段是抗体专一性的主要决定因素(单一fd片段可与多达10条的不同轻链相连而不改变抗体专一性)，并且fd片段在分离后保持表位－结合能力。如本领域中众所周知的,在抗体的抗原结合部分内部有直接与抗原表位相互作用的互补性决定区域(cdrs)，也有保持抗体结合部位三级结构的构架区域(frs)(参见，一般地，clark,1986；roitt,1991)。在igg免疫球蛋白重链fd片段和轻链中，有通过三个互补决定区域(cdr1到cdr3)分别分开的四个构架区域(fr1到fr4)。cdrs尤其是cdr3区域，更尤其是重链cdr3，很大程度上对抗体专一性负责。现在在本领域中已很好地认识到，哺乳动物抗体的非cdr区域可被同种或异种特异性抗体的类似区域所替代，而保持原始抗体的表位专一性。这在制备和应用“人源化”抗体中表现得最清晰，其中非-人cdrs共价连接到人fr和/或fc/pfc’区域以产生功能抗体。参见，例如u.s.patents4,816,567,5,225,539,5,585,089,5,693,762和5,859,205。因此,例如，pct国际公开号wo92/04381教授了人源化的鼠类rsv抗体的生产和应用，其中至少鼠fr区域的一部分被人源性的fr区域所取代。这类抗体，包括具有抗原结合能力的完整抗体的片段，经常被表示成“嵌合的”抗体。因此,正如对本领域一般技术人员而言是很明白的,本发明也提供f(ab’)2,fab,fv和fd片段；其中fc和/或fr和/或cdr1和/或cdr2和/或轻链cdr3区域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的抗体；其中fr和/或cdr1和/或cdr2和/或轻链cdr3区域已经被同源的人或非序列所取代的嵌合f(ab’)2片段抗体；其中fr和/或cdr1和/或cdr2和/或轻链cdr3区域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的fab片段抗体；以及其中fr和/或cdr1和/或cdr2区域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的fd片段抗体。本发明也包括所谓的单链抗体。因此,本发明包括与fge多肽专一结合的多种大小和类型的多肽，及fge多肽与其结合伴侣的复合物。这些多肽也可由抗体技术之外的其它来源得来。例如，这类多肽结合试剂能由简并肽库而提供，所述简并肽库可很容易以溶液、以固定的形式作为细菌鞭毛肽展示库或噬菌体展示库而制备。也可制备含有一个或更多氨基酸的肽组合文库。文库能进一步由肽和非肽的合成部分合成。噬菌体展示能在鉴别根据本发明而有用的结合肽中特别有效。简而言之，可应用传统程序制备显示4到约80个氨基酸残基插入物的噬菌体库(应用例如m13,fd,或λ噬菌体)。插入物可代表，例如，完全的降解物或有偏差的阵列。然后可挑选噬菌体承载性插入物，其结合到fge多肽或fge和结合伴侣的复合物。此过程可通过复选结合到fge多肽或复合物的噬菌体的几个循环而重复。重复的循环导致承载特定序列的噬菌体的富集。dna序列分析可以进行，以鉴别所表达多肽的序列。结合fge多肽或复合物的序列的最小线性部分可被测定。应用含有插入物的偏差性的库，可重复这些程序，所述插入物包含最小线性部分的一部分或全部外加一个或更多附加的其上游或下游的简并残基。酵母双杂交筛选方法也可用于鉴别结合到fge多肽的多肽。因此，本发明的fge多肽或其片段或fge与结合伴侣的复合物能被用于筛选肽库，包括噬菌体展示库，以鉴别和选择本发明fge多肽的肽结合伴侣。这类分子能用于，如所述的，筛选分析，纯化方案，对fge功能的直接干扰，及其它对本领域一般技术人员而言很显然的目的。fge多肽或其片段也能用于分离它们的天然结合伴侣。对结合伴侣的分离可根据众所周知的方法完成。例如，分离的fge多肽能被附着于某一基质，然后被怀疑含有fge结合伴侣的溶液可应用到基质上。如果fge多肽的结合伴侣在溶液中存在，那么它将结合到基质固着的fge多肽。之后结合伴侣可被分离出。充当fge结合伴侣的其它蛋白质可通过类似方法分离出，而不需要过度的实验。优选的结合伴侣是硫酸酯酶。本发明也提供测量fge在受试者中表达水平的方法。这可通过首先得到来自受试者的测试样本而完成。测试样本可以是组织或生物液体。组织包括脑,心脏,血清,乳房,结肠,膀胱,子宫,前列腺,胃,睾丸,卵巢,胰,垂体腺,肾上腺,甲状腺,唾液腺,乳腺,肾,肝,肠,脾,胸腺,血管,骨髓,气管,和肺。在一定的实施方案中，测试样本源自心脏和血管组织，生物液体包括血液,唾液和尿。创伤性和非创伤性技术都能用于获得这类样本，并在本领域中被很好地记载。在分子水平上，应用本发明在此所述的产物和可在汇编这类方法的参考文献中找到的本领域众所周知的方案，pcr和northern印迹都能用于测定fgemrna的水平。在蛋白质水平上，应用多克隆或单克隆抗fge血清结合标准免疫分析，fge表达可被测定。优选的方法将会把测得的测试样本的fge表达水平与对照进行比较。对照可包括已知量的核酸探针、fge表位(如fge表达产物)，或来自具有对照或“正常”水平fge表达的受试者的类似测试样本。fge多肽优选重组性产生，虽然这类蛋白可从生物抽提物中分离出。重组性产生的fge多肽包括含有fge蛋白与另一多肽的融合物的嵌合的蛋白质，所述多肽例如能提供或增强蛋白－蛋白结合、序列专一性核酸结合(如gal4)，增强fge多肽在分析条件下的稳定性，或提供可探测性的部分例如绿色荧光蛋白。融合到fge多肽或片段的多肽也可提供易于探测融合蛋白的手段，例如通过免疫识别或通过荧光标记。本发明也在产生非人的转基因动物中有用。在本文中所用的“非人的转基因动物”包括具有整合在生殖系细胞和/或体细胞中的一种或更多的外生性核酸分子的非人的动物。因此转基因动物包括通过同源重组而具有纯合或杂合基因断裂的“敲除的”动物，具有游离或染色体整合的表达载体的动物等。敲除动物能通过应用本领域众所周知的胚胎干细胞的同源重组而制得。重组可应用例如本领域一般技术人员已知的cre/lox系统或其它重组酶系统而促进。在一定的实施方案中，重组酶系统本身是条件性地表达，例如在一定组织或细胞类型中，在一定胚胎或胚胎后发育阶段，因增加或减弱表达的化合物或类似物质的加入而被诱导。一般地，在这类系统中应用的条件表达载体应用多种可赋予所期望的基因表达模式(例如时间或空间性的)的启动子。条件启动子也能可操纵性地连接到fge核酸分子以受调节或条件性的方式增加fge的表达。fge活性或表达的反式-作用负调节子也能可操纵性地连接到上述的条件启动子。这类反式-作用调节子包括反义fge核酸分子，编码显性失活fge分子的核酸分子，对fge核酸专一的核酶分子，和类似物。非人的转基因动物在用于对诊断或治疗方法的生化或生理效应进行测试的实验中有用，所述诊断或治疗方法针对以增加或减少fge表达为特征的病症。其它应用对本领域一般技术人员而言是很显然的。本发明也涉及基因治疗。完成离体基因治疗的程序在u.s.patent5,399,346中概述，也显示于该专利审查中所提交的文件,其所有内容都是公开可得的文件。一般地，它包括在体外将基因的功能拷贝引入到包含基因缺陷性拷贝的受试者的细胞中，将基因工程化的细胞回置到受试者中。基因的功能拷贝是处于允许基因在基因工程化细胞中表达的调控元件的可操作性控制下。许多转染和转导技术以及适当的表达载体为本领域一般技术人员所熟知，其中的一部分在pct申请wo95/00654中被描述。应用例如腺病毒,逆转录病毒,疱疹病毒,和靶向的脂质体之类载体的体内基因治疗也根据本发明而涉及。本发明进一步提供鉴别试剂或引导化合物以得到在fge或fge片段依赖性细胞功能的水平上有活性的试剂的有效方法。这类功能尤其包括与其它多肽或片段的相互作用。一般地，筛选方法包括对干扰fge活性(如cα-甲酰甘氨酸生成活性)的化合物的分析，虽然增强fgecα-甲酰甘氨酸生成活性的化合物也能应用该筛选方法而被分析。这类方法能被适应于自动化的高产出的化合物筛选。靶指标包括被fge调节的细胞过程如cα-甲酰甘氨酸生成活性。多种对备选(药理上的)试剂的分析被提供，包括标记的体外蛋白质－配体结合分析，电泳迁移改变分析，免疫分析，基于细胞的分析例如双杂交或三杂交筛选，表达分析等。转染的核酸能编码例如，组合肽库或cdna库。便于这类分析的试剂例如gal4融合蛋白在本领域中众所周知。可作为范例的基于细胞的分析包括，以编码融合到gal4dna结合结构域的fge多肽的核酸和编码可操作性地连接到基因表达调节区(如一个或更多gal4结合位点)的报告基因的核酸而转染细胞。报告基因转录的活化发生在fge和报告融合多肽结合以例如激活报告基因的转录时。之后，调节fge多肽介导的细胞功能的试剂通过报告基因表达的变化而被探测。测定报告基因表达变化的方法在本领域中众所周知。方法中所用的fge片段当不是由转染的核酸所产生时，作为分离的多肽加入到分析混合物中。fge多肽优选重组产生，虽然此多肽可从生物抽提物中分离。重组产生的fge多肽包括包含fge蛋白与另一多肽的融合体的嵌合蛋白质，另一多肽例如能提供或增强蛋白质－蛋白质结合、序列专一性核酸结合(如gal4)、增强fge多肽在分析条件下的稳定性或提供可探测部分例如绿色荧光蛋白或flag表位。分析混合物包含能与fge相互作用的天然的细胞内fge结合靶。当天然fge结合靶可用时，常常优选应用fge结合靶的局部(例如肽-参见例如seqidno:33的肽-或核酸片段)或类似物(即,为分析目的而模拟天然结合靶的fge结合性质的试剂)，只要局部或类似物提供分析中可测量的对fge片段的结合亲合性和强烈结合倾向。分析混合物也包含候选物质。典型地，多个分析混合物以不同试剂浓度平行进行，以得到对多种浓度的不同反应。典型地，这些浓度中的某一个用作负对照，即，试剂的零浓度或在分析的探测极限之下的试剂浓度。候选物质包括许多化学种类，虽然它们典型的是有机化合物。优选地，候选物质是小分子有机化合物，即那些具有大于50然而小于约2500的分子量的类型，优选小于约1000，而更优选小于约500。候选物质包含与多肽和/或核酸的结构性相互作用所必需的功能化学基团，并典型地包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基基团，优选至少两个功能化学基团，而更优选至少三个功能化学基团。候选物质可包含被一种或更多上述确定的功能基团所取代的环碳或杂环结构和/或芳香或聚芳香结构。候选物质也可是生物分子例如肽,糖,脂肪酸,固醇,类异戊二烯,嘌呤,嘧啶,上述物质的衍生物或结构类似物，或者其组合，以及类似物质。试剂是核酸的情形中，试剂典型地是dna或rna分子，虽然在此所定义的修饰后的核酸也被涉及。候选物质从多种来源包括合成或天然化合物的库得到。例如，对于多种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，有许多方式可用，包括随机寡核苷酸的表达、合成性的有机组合库、随机肽段的噬菌体展示库和类似方式。替代性地，细菌、真菌、植物和动物抽提物形式的天然化合物的库唾手可得或易于产生。此外，天然和合成性产生的库和化合物能通过传统化学、物理和生化方式被修饰。进一步地，已知的(药理学上)试剂可进行定向或随机化学修饰例如酰化,烷基化,酯化,amidification,等，以产生试剂的结构类似物。多种其它试剂也能被包括在混合物中。这些包括试剂例如盐,缓冲剂,中性蛋白质(例如白蛋白),去污剂,等，其可被用于促进最佳的蛋白质－蛋白质和/或蛋白质－核酸结合。这样的试剂也可减少反应成分的非专一性的或背景性的相互作用。其它改善分析效率的试剂如蛋白酶，抑制剂,核酸酶抑制剂,抗微生物剂和类似物也可被应用。前述分析材料的混合物在由此确定的条件下培育，但对于候选物质存在的情形中，fge多肽特异性地与细胞结合靶、其部分或其类似物结合。组分加入的顺序，培育温度，培育时间和分析的其它参数可容易地确定。这类实验只包括分析参数的最优化，而不涉及分析的基本组成。培育温度典型地是在4℃和40℃之间。培育时间优选最小化以促进快速、高产出的筛选，而典型的是在0.1和10小时之间。培育之后，fge多肽与一种或更多结合靶的专一性结合的存在与否通过使用者可用的任何方便的方法而探测。对于非细胞结合类型分析，分离步骤常被用于从未结合的组分中分离结合的组分。分离步骤可以多种方式完成。方便的是，组分中的至少一种在固相基质上被固定，未结合组分可容易地从其中分离。固相基质可由多种材料制成多种形式，例如微量滴定平板,微珠,计量棒(dipstick),树脂颗粒,等。优选基质被选择成最大的信噪比，主要是最小化背景结合，以及使分离程序和成本简化。分离可被多种因素影响，例如从库中除去珠子或计量棒,清空或稀释库如微量滴定平板孔,以清洗溶液或溶剂清洗珠子,颗粒,层析柱或过滤器。分离步骤优选包括多次漂洗或清洗。例如，当固相基质是微量滴定平板时，孔可典型地被包括培育混合物的那些不参与特异性结合的组分的清洗溶液清洗数次，所述组分如盐,缓冲剂,去污剂,非专一性蛋白质等。在固相基质是磁珠的情形中，珠子可用清洗溶液清洗一次或更多，并用磁体而分离出。探测可以任何方便的方式被影响，以进行基于细胞的分析例如双杂交或三杂交筛选。与靶分子相互作用的fge多肽的报告基因转录分析所得到的转录物典型地编码直接或间接可测的产物，例如β-半乳糖苷酶活性,荧光素酶活性,和类似物。对于非细胞结合分析，组分的一种通常包含或被偶连到可探测的标记。多种标记都能用，例如那些提供直接探测的类型(例如放射性,发光,视觉或电子密度等),或提供间接探测的类型(例如，表位标签如flag表位、酶标签如辣根过氧化物酶等)。标记可被固着于fge结合伴侣，或整合进结合伴侣的结构中。多种方法可被用于探测标记，这取决于标记的天性和其它的分析组分。例如，当固着到固相基质时或从固相基质分离之后，标记可被探测。标记可通过视觉或电子密度,放射性辐射,非放射性能量转移等直接探测，或以抗体缀合物、链霉抗生物素-生物素缀合物等间接探测。探测标记的方法在本领域中众所周知。本发明提供fge专一结合试剂，鉴别和生产这类试剂的方法，及它们在诊断、治疗和药物开发中的应用。例如，fge专一性药理试剂在多种诊断和治疗性应用中有用，尤其是在疾病或疾病预后与改变的fge结合特征相关的情形例如多种硫酸酯酶缺乏症中。新的fge专一结合试剂包括fge专一抗体，细胞表面受体，被例如双杂交筛选的分析法所鉴别的其它天然细胞内和细胞外结合试剂，及被对化学库的筛选所鉴别的非天然细胞内和细胞外结合试剂，和类似物。一般而言，fge结合到特异分子的专一性通过结合平衡常数被测定。能选择性结合fge多肽的靶优选具有至少约107m-1的结合常数，更优选至少约108m-1，而最优选至少约109m-1。多种基于细胞的和非细胞的分析可被用于证明fge专一结合。基于细胞的分析包括单、双和三杂交筛选，其中fge介导的转录得到抑制或增加等的分析。非细胞分析包括fge蛋白结合分析、免疫分析等。其它对筛选结合fge多肽的试剂有用的分析包括荧光共振能量转移(fret)和电泳迁移改变分析(emsa)。根据本方面的另一方面，鉴别在调节本发明的分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性中有用的试剂的方法被提供。方法包括(a)将具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的分子与候选物质相接触，(b)测量该分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性，和(c)将测得的分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性与对照比较以确定是否候选物质调节分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性，其中分子是本发明的fge核酸分子或其表达产物。“接触”指具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的分子与候选物质的直接和间接的接触。“间接”接触表示候选物质通过第三者试剂(例如信使分子，受体等)对分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性施加了其影响。在一定实施方案中，对照是在缺乏候选物质时测得的分子cα-甲酰甘氨酸生成活性。分析方法和候选物质如前述有关fge的实施方案中所述。根据本发明的另一方面，诊断以核酸分子、其表达产物或其表达产物片段的异常表达为特征的疾病的方法被提供。方法包括将从受试者中分离的生物样本与专一结合到核酸分子、其表达产物或其表达产物片段的试剂接触，并测定作为疾病判定依据的试剂和核酸分子或表达产物之间的相互作用，其中核酸分子是根据本发明的fge分子。疾病是多种硫酸酯酶缺乏症。导致fge分子异常表达的fge基因中的突变引起下面的seqidno:2上的氨基酸改变：met1arg；met1val；leu20phe；ser155pro；ala177pro；cys218tyr；arg224trp；asn259ile；pro266leu；ala279val；arg327stop；cys336arg；arg345cys；ala348pro；arg349gln；arg349trp；arg349trp；ser359stop；或其组合。在分子是核酸分子的情形中，这类测定能通过任何标准的核酸测定分析进行，包括聚合酶链式反应或在本文中作为例子的以标记性杂交探针进行的分析。在分子是核酸分子表达产物或核酸分子表达产物片段的情形中，这类测定能通过应用例如结合到任何多肽表达产物的抗体的任何标准的免疫分析而进行。“异常表达”指fge分子(核酸和/或多肽)相对于对照(即,相同分子在健康或“正常”受试者中的表达)的减少的表达(表达不足)或增加的表达(过表达)。在本文中所用的“健康受试者”，指根据标准的医学标准没有出现多种硫酸酯酶缺乏症或具有发展多种硫酸酯酶缺乏症的风险的受试者。健康受试者也没有另外显现出病症。换句话说，如果被医学专业人员检查，这类受试者将被表征为健康和不带多种硫酸酯酶缺乏症的症状。这些包括异常染性脑白质营养不良和粘多糖病的特征，例如在几种组织中的酸性粘多糖的量增加，轻微‘脂肪软骨营养不良’，快速神经性衰退，尿中的脑硫脂和粘多糖的过量存在，增加的脑脊液蛋白和外周神经中的髓磷脂的异染性退化。本发明也提供新的试剂盒，其将被用于测量本发明的核酸和本发明的表达产物的水平。在某一实施方案中，试剂盒包含包装，该包装包含下列物质：选择性结合任何前述fge的分离的核酸或其表达产物的试剂，及用于与所述试剂和任何前述fge的分离的核酸或其表达产物结合的测得值进行比较的对照。在某些实施方案中，对照是用于与测得值比较的预先测定值。在一定实施方案中，对照包含任何前述fge的分离的核酸的表达产物的表位。在某一实施方案中，试剂盒进一步包含选择性结合选自下列的多肽的第二试剂：艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6,或其肽段，和用于与所述第二试剂和所述多肽或其肽段的结合的测得值进行比较的对照。在核酸探测的情形中，用于扩增本发明的核酸分子的引物对可被包括进去。优选的试剂盒将包括对照，例如已知量的核酸探针、表位(例如艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6，表达产物)或抗表位的抗体，以及指南或其它复印材料。在一定的实施方案中，复印材料能基于分析结果而表征发展硫酸酯酶缺乏状态的风险。试剂可按预先测定的量被包在容器中和/或被涂在小孔上，而试剂盒可包括标准物质，例如标记好的免疫试剂(如标记好的抗-igg抗体)和类似物。一种试剂盒是包好的用fge蛋白涂层的聚苯乙烯微量滴定平板和含有标记好的抗人igg抗体的容器。平板的小孔与例如生物液体接触，清洗，然后与抗-igg抗体接触。之后探测标记。体现本发明特征的试剂盒，通常以数字11指定，在图9中显示。试剂盒11包含下列主要元件：包装15，本发明的试剂17，对照试剂19和指南21。包装15是用于盛含有本发明的试剂17的一个小瓶(或多个小瓶)，含有对照试剂19的一个小瓶(或多个小瓶)和指南21的类似盒子的结构。本领域技术人员可易于修饰包装15以适合个体的需要。本发明也包含在受试者中治疗多种硫酸酯酶缺乏症的方法。方法包括对有这类治疗需要的受试者施用调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为在受试者中有效增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的量。在某些实施方案中，方法进一步包含一定试剂的共施用，所述试剂选自编码下列蛋白的核酸分子：艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6；核酸分子的表达产物,和/或核酸分子的表达产物的片段。在本文中所用的“调节核酸或多肽的表达的试剂”在本领域中已知，指有义和反义核酸，显性失活核酸，多肽的抗体和类似物。调节分子表达(和如本文中所述的，调节其活性)的任何试剂根据本发明有用。在一定实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的分离的核酸分子(例如seqidno.3的核酸)。在重要的实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的肽(例如seqidno.2的肽)。在某些实施方案中，调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的有义核酸。根据本发明的一个方面，在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括对受试者施用本发明的分离的核酸分子和/或其表达产物，用量为在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。根据本发明的另一方面，增加细胞中的cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括将细胞与本发明的分离的核酸分子(例如seqidno.1的核酸),或其表达产物(例如seqidno.2的肽)接触，用量为在细胞中有效增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的量。在重要的实施方案中，方法包括激活内源性的fge基因以增加细胞中的cα-甲酰甘氨酸生成活性。在任何的前述实施方案中，核酸可被操作性地偶联到指导真核细胞例如ht-1080细胞内的核酸分子表达的基因表达序列。“基因表达序列”是任何调节性的核苷酸序列，例如启动子序列或启动子－增强子组合，其促进它所可操作性地连接的核酸的有效转录和翻译。基因表达序列可以是，例如，哺乳动物或病毒的启动子如组成型或可诱导型的启动子。组成型的哺乳动物启动子包括但不限于下列基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hptr),腺苷脱氨酶,丙酮酸激酶,α-肌动蛋白启动子和其它组成型启动子。可作为范例的在真核细胞中组成性地发挥功能的病毒启动子包括，例如，来自猿猴病毒,乳头状瘤病毒,腺病毒,人免疫缺陷病毒(hiv),劳斯肉瘤病毒,细胞巨化病毒,莫洛尼氏白血病毒的长末端重复序列(ltr)和其它逆转录病毒的启动子，和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它组成型启动子为本领域一般技术人员所知。作为本发明的基因表达序列而有用的启动子也包括可诱导的启动子。可诱导的启动子在诱导剂存在时被活化。例如，金属硫蛋白启动子在一定的金属离子存在时被激活而增加转录和翻译。其它可诱导的启动子为本领域一般技术人员所知。一般而言，基因表达序列将包括(如果必要)分别涉及转录和翻译起始的5’非转录和5’非翻译序列，例如tata盒,加帽序列,caat序列和类似物。尤其是，这类5’非转录序列将包括启动子区域，所述启动子区域包括用于对可操作性连接的核酸进行转录控制的启动子序列。基因表达序列可选性地包括所期望的增强子序列或上游激活子序列。优选任何本发明的fge核酸分子连接到允许核酸分子在特定细胞系的细胞如神经细胞中表达的基因表达序列。允许核酸分子在细胞如神经细胞中表达的序列，是在这类细胞类型中选择性地有活性从而引起核酸分子在这些细胞中表达的类型。例如，突触蛋白-1启动子能被用于在神经细胞中表达任何前述的本发明的核酸分子；而例如vonwillebrand因子基因启动子能被用于在血管内皮细胞中表达核酸分子。本领域中一般技术人员将能易于鉴别能在本发明的任何优选细胞中表达核酸分子的替代性的启动子。当它们以将核酸编码序列(例如,在fge的情形中,seqidno.3)的转录和/或翻译置于基因表达序列的影响或控制下这样的方式而被共价连接时，核酸序列和基因表达序列被表述为“可操作性地连接”。如果期望核酸序列被翻译成为功能性蛋白，并且如果在5’基因表达序列中的启动子的诱导导致核酸序列的转录，且如果在两个dna序列之间的连接的本性不会(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区域指导核酸序列转录的能力，和/或(3)干扰对应的rna转录产物翻译成为蛋白质的能力时，两个dna序列被表述成可操作性地连接。因此，如果基因表达序列能影响核酸序列的转录以至于得到的转录产物可被翻译成为所期望的蛋白质或多肽，则基因表达序列将被认为可操作性地连接到核酸序列。本发明的分子能单独的或与载体(也见对于载体的更早的讨论)一起被运送到本发明优选细胞类型。按其最广泛的含义(且与本文中其它部分对表达和靶向载体的描述一致)，“载体”是能促进：(1)分子到靶细胞的运送，和/或(2)分子被靶细胞的吸取，的任何载体。优选运送载体以有所减少的降解运输分子到靶细胞中，所述有所减少的降解相对于载体缺乏时所产生的降解的程度而言。可选地，“靶向配体”能被附着于载体以选择性地将载体运送到其表面表达靶向配体的相关受体的细胞。以这种方式，载体(含有核酸或蛋白质)能被选择性地运送到神经细胞。靶向的方法包括缀合，例如那些在priest的u.s.patent5,391,723中所述的。另一众所周知的靶向载体的实例是脂质体。脂质体从gibcobrl可商业性地获得。生产靶向脂质体的多种方法被发表。一般而言，在本发明中有用的载体包括但不限于质粒,噬菌粒,病毒,源于病毒或细菌来源的其它载体，所述其它载体已通过本发明核酸序列和能被附着到本发明的核酸序列的另外的核酸片段(例如增强子、启动子)的插入或整合而被操作。病毒载体是载体的优选类型，包括但不限于来自下列病毒的核酸序列：腺病毒；腺伴随病毒；逆转录病毒,例如鼠莫洛尼白血病毒；鼠哈维肉瘤病毒；鼠乳腺肿瘤病毒；劳斯肉瘤病毒；sv40-型病毒；多瘤病毒；eb病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和rna病毒例如逆转录病毒。也能容易地采用没有指出但在本领域中已知的其它载体。对某些应用特别优选的病毒是腺伴随病毒,一种双链dna病毒。腺伴随病毒能感染广泛的细胞类型和物种，且能被工程化为复制缺陷型。它进一步地具有优点例如热和脂溶剂稳定性、在多种株系细胞包括造血细胞中的高转导频率，和缺乏超感染抑制因此而允许多重系列的转导。经报道，腺伴随病毒能以位点特异的方式整合进人细胞dna，从而将插入性基因突变的可能性和插入基因的表达的可变性最小化。此外，野生型腺伴随病毒感染已在组织培养物中于缺乏选择压力的条件下存在超过100代，意味着腺伴随病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺伴随病毒也能以染色体外方式发挥功能。一般而言，其它优选的病毒载体基于非细胞病变性真核病毒，在这些病毒中非必需基因已被目的基因所替代。非细胞病变性病毒包括逆转录病毒，其生命周期包括基因组病毒rna到dna的逆转录及随后的前病毒整合到宿主细胞dna中。腺病毒和逆转录病毒已被许可用于人基因治疗的试验。一般而言，逆转录病毒是复制缺陷型(即,能指导所需蛋白的合成，但不能制造出感染性的颗粒)。这类基因改变的逆转录病毒表达载体具有对基因在体内的高效转导的一般性用途。产生复制缺陷型逆转录病毒的标准流程(包括步骤：外源性遗传物质整合进质粒，质粒对包装细胞系的转染，重组性逆转录病毒通过包装细胞系的产生，从组织培养基中收集病毒颗粒和病毒颗粒对靶细胞的感染)在kriegler,m.,“genetransferandexpression,alaboratorymanual,”w.h.freemanc.o.,newyork(1990)和murry,e.j.ed.“methodsinmolecularbiology,”卷7,humanapressinc.,cliffton,newjersey(1991)中被提供。另一优选的逆转录病毒载体是源自鼠莫洛尼白血病毒的载体，如在nabel,e.g.等,science,1990,249:1285-1288中所述的。这些载体据报道对基因运送到动脉壁的所有三层(包括中间层)都有效。其它优选载体在flugelman等,circulation,1992,85:1110-1117中公开。另外的对运送本发明的分子有用的载体在u.s.patentno.5,674,722中被mulligan等描述。除前述载体外，其它传送方法可被用于传送本发明的分子到细胞例如神经细胞,肝,成纤维细胞,和/或血管内皮细胞,并促进在那里的吸收。本发明的优选的这类运送方法是胶态分散体系统。胶态分散体系统包括基于脂质的系统，包括水包油乳液,微囊,混合微囊,和脂质体。本发明优选的胶态系统是脂质体。脂质体是人造膜容器，其作为体内或体外的运送载体而有用。已有显示，大小范围在0.2-4.0μm的单层容器(luv)能包裹进大的大分子。rna,dna和完整病毒粒子能被封装在含水内部，并以生物活性形式运送到细胞中(fraley等,trendsbiochem.sci.,1981,6:77)。为了脂质体是有效的基因转运载体，一种或更多的下列特征应具备：(1)目的基因高效被封装，而保持生活活性；(2)相对于非靶细胞的与靶细胞的优选和牢固的结合；(3)囊泡的水内容物到靶细胞细胞质的高效运送；和(4)遗传信息的准确和有效表达。脂质体可通过脂质体到特异配体例如单克隆抗体,糖,糖脂,或蛋白质的偶联，而靶向于特定组织，例如心肌或血管细胞壁。可对靶向脂质体于血管壁有用的配体包括但不限于，仙台病毒的病毒衣壳蛋白。此外，载体可偶联到核靶向性肽上，其将定向核酸到宿主细胞核。脂质体可从gibcobrl商业性地获得，例如由阳离子脂质如n-[1-(2,3双油氧基)-丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)和二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)形成的lipofectintm和lipofectacetm。生产脂质体的方法在本领域中众所周知，也在许多出版物中被描述。脂质体也已被gregoriadis,g.在trendsinbiotechnology,卷3,235-241页(1985)中所回顾。用于大分子包括核酸的细胞内运送的新的脂质体也在pct国际申请pct/us96/07572(公开号wo96/40060,名称为“intracellulardeliveryofmacromolecules”)中被描述。在一个特定的实施方案中，优选的载体是适合植入哺乳动物受体的生物相容性的微颗粒或植入物。作为范例的根据此方法而有用的生物侵蚀性植入物在pct国际申请pct/us/03307(公开号wo95/24929,名称为“polymericgenedeliverysystem”,其要求1994年3月15日提交的美国专利申请系列号213,668的优先权)中被描述。pct/us/0307描述了用于包含(受适当的启动子调控的)外源性基因的生物相容性的聚合性基质，优选生物降解性的聚合性基质。聚合性基质被用于实现外源性基因在患者中的持续性释放。根据本发明，在此所述的核酸在pct/us/03307中所公开的生物相容性优选生物降解性的聚合性基质中被封装或分散。聚合性基质优选微颗粒形式例如微球体(其中核酸被分散到整个固体聚合性基质中)或微囊(其中核酸被储存在聚合性壳的核心中)。包含本发明的核酸的聚合性基质的其它形式包括膜,涂层,胶,植入物和支架。聚合性基质装置的大小和组成被选作引起基质装置被植入的组织中的良好的释放动力学。进一步设计的聚合性基质的大小根据将被应用的运送方法而选择，所述运送方法典型地是组织注射或悬浮液通过雾化施用到鼻部和/或肺部区域。聚合性基质组合物能被选成同时具有良好的降解速率，及由生物粘附性物质形成，以在设计物被施用到血管表面时进一步增加转运的有效性。基质组合物也能被选成不降解，但更适合通过持续相当一段时间的扩散而释放。非生物降解性和生物降解性的聚合性基质都能被用作将本发明的核酸运送到受试者。优选生物降解性基质。这类聚合物可以是自然或合成性的聚合物。优选合成性聚合物。根据释放所需要的时间长度而选择聚合物，一般是几个小时到一年或更长时间的级别。典型地，范围从几个小时到三至十二个月的时间长度的释放最合意。聚合物可选性地是能吸收高到其重量的约90％的水的水凝胶的形式，而进一步地，可选性地与多价离子或其它聚合物交联。一般而言，本发明的核酸应用生物侵蚀性植入物以扩散方式而被运送，或更优选地，通过聚合性基质的降解。作为范例的能被用于形成生物降解性运送系统的合成性聚合物包括:聚酰胺,聚碳酸酯,聚亚烷基,聚亚烷基二醇,聚环氧烷,聚亚烷基对苯二酸酯,聚乙烯醇,聚乙烯醚,聚乙烯酯,聚-乙烯卤化物,聚乙烯吡咯烷酮,聚乙交酯,聚硅氧烷,聚氨基甲酸乙酯和其共聚物,烷基纤维素,羟基烷基纤维素,纤维素醚,纤维素酯,硝基纤维素,丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物,甲基纤维素,乙基纤维素,羟丙基纤维素,羟丙基甲基纤维素,羟丁基甲基纤维素,醋酸纤维素,丙酸纤维素,纤维素醋酸丁酸酯,纤维素醋酸邻苯二甲酸酯,羧乙基纤维素,三醋酸纤维素,纤维素硫酸钠盐，聚(甲基异丁烯酸酯)，聚(乙基异丁烯酸酯)，聚(丁基异丁烯酸酯)，聚(异丁基异丁烯酸酯)，聚(己基异丁烯酸酯)，聚(异癸基异丁烯酸酯)，聚(十二烷基异丁烯酸酯)，聚(苯基异丁烯酸酯)，聚(甲基丙烯酸酯)，聚(异丙基丙烯酸酯)，聚(异丁基丙烯酸酯)，聚(十八烷基丙烯酸酯),聚乙烯,聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚(乙烯醇),聚乙烯醋酸,聚氯乙烯,聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮.非生物降解性聚合物的实例包括亚乙基乙烯醋酸，聚(甲)丙烯酸,聚酰胺,其共聚物和混合物。生物降解性聚合物的实例包括合成性聚合物例如乳酸和乙二酸的聚合物，聚酸酐，聚(原)酸酯,聚氨基甲酸乙酯，聚(丁酸)，聚(戊酸),聚(丙交酯-共己内酯)，天然聚合物例如藻酸和其它多糖包括葡聚糖和纤维素,胶原,其化学衍生物(化学基团例如，烷基,亚烷基,羟化,氧化的取代和增加，和其它由本领域技术人员常规进行的修饰),白蛋白和其它亲水蛋白质,玉米醇溶蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水蛋白质,其共聚物和混合物。一般而言，这些物质或者通过酶水解或者在体内暴露于水时通过表面或整体侵蚀而降解。特别受关注的生物粘附性聚合物包括h.s.sawhney,c.p.pathak和j.a.hubell在macromolecules,1993,26,581-587中所述的生物侵蚀性水凝胶，其教导在此被整合，聚透明质酸,酪蛋白,明胶,谷胶酪蛋白,聚酸酐,聚丙烯酸,藻酸,脱乙酰壳多糖，聚(甲基异丁烯酸酯)，聚(乙基异丁烯酸酯)，聚(丁基异丁烯酸酯)，聚(异丁基异丁烯酸酯)，聚(己基异丁烯酸酯)，聚(异癸基异丁烯酸酯)，聚(十二烷基异丁烯酸酯)，聚(苯基异丁烯酸酯)，聚(甲基丙烯酸酯)，聚(异丙基丙烯酸酯)，聚(异丁基丙烯酸酯),和聚(十八烷基丙烯酸酯)。因此，本发明提供用作药物的本发明的上述分子的组合物，制备此药物的方法和在体内用于持续释放药物的方法。压缩试剂也能与本发明的载体结合应用。在本文中所用的“压缩试剂”指试剂例如组蛋白，它中和核酸上的负电荷从而允许核酸压缩成细颗粒。核酸的压缩促进了核酸被靶细胞的吸收。压缩试剂能单独使用，即以被细胞更有效地吸收的形式运送分离的本发明的核酸或，更优选地，与一种或更多上述载体组合。其它作为范例的能被用于促进靶细胞对本发明的核酸的吸收的组合物包括磷酸钙及细胞内运输、微注射组合物和电穿孔的其它化学调节物。本发明包含在细胞中增加硫酸酯酶活性的方法。这类方法包括以有效地在细胞中增加硫酸酯酶活性的量将分离的本发明的核酸分子(例如如权利要求1-8中任一项所要求的分离的核酸分子，具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的fge核酸分子)或其表达产物(例如如权利要求11-15,19,20中所要求的多肽或具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽)与表达硫酸酯酶的细胞接触。在本文中所用的“增加”硫酸酯酶活性,指增加的对硫酸酯酶的特异性底物的亲合性和/或对其的转化，典型地导致硫酸酯酶分子上的fgly的形成的增加。在某一实施方案中，细胞以比野生型细胞更高的水平表达硫酸酯酶。“在细胞中增加硫酸酯酶活性”也指增加细胞所分泌的硫酸酯酶的活性。细胞可表达内源性和/或外源性的硫酸酯酶。与fge分子的所述接触也指激活细胞的内源性fge基因。在重要的实施方案中，内源性硫酸酯酶被活化。在一定实施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和/或hsulf-6。在一定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。根据本方面的另一方面，药物组合物被提供。组合物以药学上有效治疗硫酸酯酶缺乏症的量包含细胞产生的硫酸酯酶，也包含药学上可接受的载体，其中所述细胞已与包含分离的本发明的核酸分子(例如如权利要求1-8所要求的分离的核酸分子或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸分子)或其表达产物(例如选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的肽)的试剂接触。在重要的实施方案中，硫酸酯酶以高于正常/对照细胞的水平表达。本发明也包含产生硫酸酯酶的细胞，其中细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加。细胞包含：(i)相对于对照具有增加的活性的硫酸酯酶,和(ii)相对于对照具有增加的活性的甲酰甘氨酸生成酶,其中相对于甲酰甘氨酸生成酶缺乏的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少5％。在本领域中已知，硫酸酯酶的过表达能减少内源性硫酸酯酶的活性(anson等,biochem.j.,1993,294:657-662)。此外，仅有重组硫酸酯酶的一部分有活性。出乎意料地，我们发现在具有硫酸酯酶的增加的表达/活性的细胞中，fge增加的表达/活性导致更有活性的硫酸酯酶的产生。既然fgly在硫酸酯酶分子上的存在与硫酸酯酶活性相关，则“有活性的硫酸酯酶”就能通过应用maldi-tof质谱(如本文中其它部分所描述的)对fgly在硫酸酯酶细胞产物上的存在的测定而定量。然后对总硫酸酯酶的比率能很容易测定。本发明也提供用于硫酸酯酶缺乏症的诊断和治疗的方法。这类疾病包括但不限于，多种硫酸酯酶缺乏症,粘多糖病ii(mpsii；hunter综合症),粘多糖病iiia(mpsiiia；sanfilippo综合症a),粘多糖病viii(mpsviii),粘多糖病iva(mpsiva；morquio综合症a),粘多糖病vi(mpsvi；maroteaux-lamy综合症),异常染性脑白质营养不良(mld),x-连锁的隐性点状软骨发育不全1,和x-连锁的鱼鳞病(类固醇硫酸酯酶缺乏症)。本发明的方法在对任何前述病症的急性或预防性治疗中都有用。在此所用的急性治疗指对具有特定病症的受试者的治疗。预防性治疗指对可能具有此病症但现在并没有或并未经历此病症的症状的受试者的治疗。就其最广泛的意义而言，术语“治疗”表示急性和预防性治疗两者。如果需要治疗的受试者正经历病症(或具有或正具有特定病症)，那么治疗病症指改善、减弱或消除病症或来自病症的一种或更多的症状。在某些优选的实施方案中，治疗此病症指改善、减弱或消除与病症相关的特异的症状或特异亚型的症状。如果需要治疗的受试者是可能具有此病症的受试者，那么对受试者治疗指减小受试者产生此病症的风险。本发明的治疗剂的施用模式和剂量将随着被治疗的病症的特定阶段、被治疗的受试者的年龄和生理状态、同时进行的治疗(如果有)的本性、施用的特定途径和在医学实践者的知识和专业技术范围内的类似因素而变化。如本文中所述的，本发明的试剂以治疗任何前述硫酸酯酶缺乏症的有效量而被施用。一般而言，有效量是能引起受试者的所期望的组织中的有益变化的任何量。有效量优选在特定病症中足以引起良好表型变化例如症状或病症的整体性减轻、缓和或消除的量。一般而言，有效量是药学制剂单独或与进一步的药剂一起产生出所期望的反应那样的量。这可包括只短暂减慢病症的进程，虽然更优选它包括长期性地阻止病症进程，或延缓病症的发作，或防止病症发生。这可通过常规方法监测。一般地，活性化合物的剂量将从约0.01mg/kg每天到1000mg/kg每天。期望范围在50μg-500mg/kg的剂量将是适合，优选口服和每天施用一次或几次。当然，这类量将取决于被治疗的特定病症，病症的严重程度，患者个体的参数包括年龄、生理状况、身材尺寸和体重，治疗的持续时间，同时进行的治疗(如果有)的本性，施用的特异途径和在医学实践者的知识和专业技术范围内的类似因素。低剂量将源自施用的一定形式，例如静脉内施用。在应用初始剂量时受试者中的反应不充分的情形中，更高的剂量(或通过不同的更局部化的运送途径的有效更高剂量)可应用到患者耐受力所允许的程度。每天多重剂量被预期能实现化合物的合适的系统水平。一般地，优选应用最大剂量，也就是，根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而将被本领域中一般技术人员所理解的是，患者可出于医学原因、心理原因或事实上的其它任何原因而坚持较低剂量或可耐受性剂量。本发明的试剂可选性地与药学上可接受的载体组合以形成药学制剂。在本文中所用的术语“药学上可接受的载体”表示适合对人施用的一种或更多相容性的固体或液体填充物、稀释剂或封装物质。术语“载体”表示天然或合成性的有机或无机成分，活性成分与其组合以促进应用。药学组合物的成分也能被与本发明的分子共混合，及彼此混合，其方式是确保没有实质性破坏所期望的药学效力的相互作用存在。在某些方面，药学制剂以有效治疗疾病的量包含本发明的试剂。药学制剂可包含合适的缓冲剂,包括：盐形式的醋酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸或盐形式的磷酸。药学组合物可选性地，也可包含合适的防腐剂例如苯扎氯；氯代丁醇；对羟基苯甲酸酯或乙基汞硫代水杨酸钠(thimerosal)。多种施药途径可用。当然，选出的特定模式将取决于选定的特定药物，被治疗的病症的严重程度和治疗效力所需的剂量。本发明的方法，一般而言，可应用医学上可接受的任何施用模式，即产生活性化合物的有效水平而不引起临床上无法接受的不利效应的有意义的任何模式而实行。施用的这类模式包括口服,直肠,局部,鼻,皮内,经皮,或非肠道途径。术语“非肠道的”包括皮下,静脉内,intraomental,肌肉内,或输注。静脉内或肌肉内途径不是特别适合长期性治疗和预防。作为实例，用于对具有偏头痛的受试者的急性治疗的药学组合物可配制成多种不同的方式和多种施用模式，包括片剂,胶囊,粉末,栓剂,注射液和鼻喷雾剂。药学制剂可方便地以单位剂型存在，也可通过任何制药领域中众所周知的方法制备。所有方法包括将活性试剂与载体相连的步骤，所述载体组成了一种或更多附属成分。一般而言，组合物通过统一地和密切地将活性化合物与液体载体、很好地分隔的固体载体或同时二者相连而制备，然后如果需要，将产物定形。适合口服施用的组合物可作为离散性单位存在，例如胶囊,片剂,锭剂，每一个都包含预定量的活性化合物。其它组合物包括水性或非水性的悬浮液例如糖浆,酏剂或乳剂。适合非肠道施用的组合物方便地包含消毒过的本发明试剂的水制剂，其优选与接受者的血液等渗。此水制剂可根据已知方法应用合适的分散或润湿剂和悬浮试剂进行配制。无菌的可注射性制剂也可是非毒性的注射用可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可接受的可用载体和溶剂有水、ringer’s溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油传统上被用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，任何温和的固定油可被应用，包括合成性的甘油单酯或双酯。此外，脂肪酸例如油酸可在可注射的制剂中应用。适合口服,皮下,静脉内,肌肉内等施用的配方能在remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pa中找到。根据本发明的一个发明，用于在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括将分离的本发明的核酸分子(例如seqidno.1的核酸)或其表达产物(例如seqidno.2的肽)以在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量与细胞接触。在重要的实施方案中，方法包括激活内源性fge基因以在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性。在某些实施方案中，接触在允许本发明的分子进入细胞的条件下进行。根据本发明的术语“允许分子进入”细胞具有下面基于分子本性的含义。对分离的核酸，它用于描述核酸通过细胞膜而进入细胞核，在其基础上“核酸转基因”能利用细胞机制产生核酸所编码的功能多肽。“核酸转基因”用于描述所有的有或没有相连载体的本发明的核酸。对于多肽，它用于描述多肽通过细胞膜进入细胞质，及如果需要，对细胞的细胞质机制的利用以功能性地修饰多肽(例如修饰成活性形式)。多种技术可被用于将本发明的核酸引入细胞，其依赖于核酸是在体外还是体内而被引入宿主。这类技术包括核酸-capo4沉淀的转染,与deae相连的核酸的转染,包括目的核酸的逆转录病毒的转染,脂质体介导的转染和类似方法。对于一定的应用，优选将核酸靶向于特定细胞。在这类例子中，用于将本发明的核酸运送进细胞的载体(例如逆转录病毒或其它病毒；脂质体)可以具有附着于其上的靶向分子。例如，分子例如对靶细胞上的表面膜蛋白专一的抗体或靶细胞上的受体的配体能被固定到核酸运送载体上或整合在其中。例如，脂质体被用于运送本发明的核酸的情形中，结合到与内吞作用相关的表面膜蛋白的蛋白质可被整合进用于靶向和/或促进吸收的脂质体的配剂。这类蛋白质包括对特定细胞类型有亲和力的衣壳蛋白或其片段,针对循环中经历内化的蛋白质的抗体，靶向细胞内定位和增强细胞内半衰期的蛋白质，和类似物。聚合性运送系统也已被成功用于运送核酸进入细胞，如本领域技术人员所已知的。这类系统甚至允许核酸的口服运送。其它运送系统能包括定时释放性、延迟释放性或持续释放性运送系统。这类系统能避免本发明的试剂的重复施用，增加对受试者和医生的方便性。多种类型的释放运送系统可用，且为本领域一般技术人员所已知。它们包括以聚合物为基础的系统例如聚(丙交酯-乙交酯),共聚草酸,聚己内酯,聚酯酰胺,聚原酸酯,聚羟基丁酸和聚酸酐。包含药物的前述聚合物的微囊在例如u.s.patent5,075,109中被描述。运送系统也包括非聚合物系统：脂类，包括固醇例如胆固醇,胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如单-二-和三-甘油酯；水凝胶释放系统；sylastic系统；以肽为基础的系统；蜡涂层；应用传统粘合剂和赋形剂的压制成的药片；部分融合的植入物；和类似物。具体的实例包括但不限于：(a)本发明的试剂以某一形式被包含在基质内的侵蚀性系统例如u.s.patentnos.4,452,775,4,675,189和5,736,152中所描述的那些类型,和(b)活性成分以受控的速率从聚合物中渗出的扩散系统例如u.s.patentnos.3,854,480,5,133,974和5,407,686中所述的。此外，以泵为基础的硬件运送系统能被应用，其中部分适于植入。长期持续释放性植入物的应用可以是合乎期望。在本文中所用的长期释放，表示植入物被构建和计划成至少30天运送治疗水平的活性成分，优选60天。长期持续释放性植入物是本领域中一般技术人员众所周知的，包括部分上述的释放系统。具体的实例包括但不限于，在u.s.patentno.4,748,024和加拿大no.1330939中所述的长期持续释放性植入物。本发明也包括本发明的fge分子之外的试剂的施用，和在某些实施方案中的共施用，所述试剂当以有效剂量施用时可与本发明的分子合作性地、加成性地或协同性地起作用，以：(i)调节cα-甲酰甘氨酸生成活性,和(ii)治疗涉及本发明分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性的任何病症(例如硫酸酯酶缺乏症包括多种硫酸酯酶缺乏症)。本发明的分子之外的试剂包括艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,或hsulf-6,(核酸和多肽,和/或其片段),和/或其组合。在本文中所用的“共施用”指同时施用两种或更多的本发明的化合物(例如已知在对例如硫酸酯酶缺乏症的治疗中有益的fge核酸和/或多肽和试剂，——例如治疗mpsii中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，其作为单一组合物中的混合物，或以足够的时间间隔顺序施用以至于化合物可发挥出相加性或甚至协同性的效力。本发明也包含固相核酸分子阵列。阵列基本上由固定于固体基质的一套核酸分子、其表达产物或其(或者核酸或者多肽分子的)片段组成，每一核酸分子选自fge,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6。在某些实施方案中，固相阵列进一步包含至少一种对照核酸分子。在一定实施方案中，这套核酸分子包含至少一种，至少两种，至少三种，至少四种或甚至至少五种核酸分子，每一种选自fge,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6。在优选的实施方案中，这套核酸分子包含最多100种不同核酸分子。在重要的实施方案中，这套核酸分子包含最多10种不同核酸分子。根据此发明，标准的微阵列技术的杂交技术被用于评估核酸表达的模式和鉴别核酸表达。微阵列技术，其也称为其它名字，包括:dna芯片技术,基因芯片技术和固相核酸阵列技术，为本领域一般技术人员已知，并基于但不限于，获得在固定的基质上的已鉴别出的核酸探针的阵列(例如在本文中其它部分所述如fge,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和/或hsulf-6的分子)，以报告分子(例如放射性的,化学发光的,或荧光性的标记例如荧光素,cye3-dutp或cye5-dutp)标记靶分子，将靶核酸与探针杂交，和评估靶－探针的杂交。一般而言，具有与靶序列完全匹配的核酸序列的探针，将比不完全匹配的探针检测到更强的报告分子信号。在核酸微阵列技术中应用的多种成分和技术在thechippingforecast,naturegenetics,卷21,jan1999中呈现，其全部内容在本文中被整合作为参考。根据本发明，微阵列基质可包括但不限于玻璃,硅土,铝硅酸盐,硼硅酸盐,金属氧化物例如氧化铝和氧化镍,多种粘土,硝基纤维素或尼龙。在所有实施方案中，优选玻璃基质。根据本发明，探针选自核酸，其包括但不限于：dna,基因组dna,cdna和寡核苷酸；且可以是天然的或合成的。寡核苷酸探针优选20到25聚体寡核苷酸，而dna/cdna探针优选长度为500到5000个碱基，虽然其它长度也可被应用。合适的探针长度可被本领域一般技术人员通过本领域内已知的程序而测定。在某一实施方案中，优选的探针是以seqidnos:1,3,4,6,8,10,和/或12给出的核酸分子中的两种或更多的组合。探针可应用本领域一般技术人员已知的标准方法例如凝胶过滤或沉淀纯化，以除去污染物。在某一实施方案中，微阵列基质可用化合物涂层以增强探针在基质上的合成。这类化合物包括但不限于，寡聚乙二醇。在另一实施方案中，基质上的偶联试剂或基团能被用于共价连接第一核苷酸或寡核苷酸到基质。这些试剂或基团可包括但不限于：氨基,羟基,溴基和羧基。这些活性基团优选通过烃基例如亚烷基或亚苯基二价基团附着于基质，一个化合价位置被链连接占据而余下的一个附着到活性基团。这些烃基基团可包含多至约10个碳原子，优选多至约6个碳原子。亚烷基通常优选在主链中包含2到4个碳原子。本方法的这些和另外的细节在例如u.s.patent4,458,066中被公开，其全部内容被整合作为参考。在某一实施方案中，应用方法例如光导向的化学合成、光化学去保护或核苷酸前体到基质的运送及随后的探针产生，探针以预先确定的栅格模式直接在基质上被合成。在另一实施方案中，基质可用化合物涂层以增强探针与基质的结合。这类化合物包括但不限于：聚赖氨酸,氨基硅烷,氨基-反应性硅烷(chippingforecast,1999)或铬(gwynne和page,2000)。在此实施方案中，预合成的探针以精确的、预先确定体积的和栅格的模式被应用于基质，利用了计算机控制的机器人将探针以接触打印方式或非接触方式例如喷墨或压电运送而应用于基质。以包括但不限于uv照射的方法，探针可共价连接到基质。在另一实施方案中，探针热连接到基质。靶标是选自包括但不限于下列的核酸：dna,基因组dna,cdna,rna,mrna，且可以是天然的或合成性的。在所有实施方案中，优选来自被怀疑为发展或具有硫酸酯酶缺乏症的受试者的核酸分子。在本发明的一定的实施方案中，一种或更多对照核酸分子被附着于基质。优选地，对照核酸分子允许了对包括但不限于下列的因素的测定：核酸质量和结合特征；试剂质量和有效性；杂交成功性；和分析阈值和成功性。对照核酸可包括但不限于，基因如管家基因的表达产物或其片段。为选择一套硫酸酯酶缺乏疾病的标记物，优选分析由例如基因表达的微阵列分析产生的表达数据，以确定在不同患者类别(每一患者类别是一种不同的硫酸酯酶缺乏疾病)中的哪个基因是显著差异性地表达。基因表达的显著性可应用permax计算机软件被测定，虽然任何能区分表达的显著差异的标准统计包也可被使用。permax实现了对数据的大规模阵列的排列双样本t-检验。对于观察中的高维度载体，permax软件计算了对每一属性的t-统计，并应用全部属性的最大值与最小值的排列分布评估了显著性。主要应用是确定两组之间差异最大的属性(基因)(例如对照的健康受试者和具有特定硫酸酯酶缺乏症的受试者)，应用t-统计的值测量“最大差异”和它们的显著性水平。硫酸酯酶缺乏疾病相关性核酸分子的表达也能应用蛋白测量方法测定，以测定seqidnos:2的表达，例如通过测定seqidnos:1和/或3编码的多肽的表达。特异和定量测量蛋白质的优选方法包括但不限于：基于质谱的方法例如表面增强的激光解吸电离(seldi；例如ciphergen蛋白质芯片系统)，非基于质谱的方法，和基于免疫组织化学的方法例如二维凝胶电泳。通过本领域一般技术人员已知的程序，seldi方法可被用于蒸发显微量的蛋白，和创造个体蛋白质的“指纹”，从而允许对在单一样本中的多种蛋白质的含量的同时测量。优选地，基于seldi的分析可被用于鉴别多种硫酸酯酶缺乏症的特征，以及这类病症的阶段。这类分析优选包括,但不限于下列实例。rna微阵列所发现的基因产物可通过被专一(抗体介导的)捕获到seldi蛋白质盘(例如选择性seldi)而被选择性地测量。蛋白筛选(例如以2维凝胶)所发现的基因产物可通过最优化的“总蛋白seldi”解析以可视化那些来自seqidnos:1,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,和/或28中的特定的目的标记。来自seqidnos:1,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,和/或28中的多种标记物的seldi测量的特定硫酸酯酶缺乏症的预测模型可被用于seldi策略。任何前述微阵列方法在测定硫酸酯酶缺乏疾病相关核酸的蛋白中的应用，能以本领域一般技术人员已知的常规方法完成，而通过蛋白质测量方法测定的表达可与标记物的预测定水平相关，用作对硫酸酯酶缺乏疾病患者治疗策略进行选择的预测性方法。本发明也包含硫酸酯酶产生性细胞，其中细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率(即比活性)被增加。细胞包含：(i)具有增强的表达的硫酸酯酶，和(ii)具有增强的表达的甲酰甘氨酸生成酶，其中细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，相对于甲酰甘氨酸生成酶缺乏时细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，增加至少5％。在本文中所用的“具有增强的表达的硫酸酯酶”典型地指硫酸酯酶和/或其编码的多肽相对于对照的增加的表达。增加的表达指增加(即到可探测的程度)任何硫酸酯酶核酸(如本文中其它部分所描述的本发明的硫酸酯酶核酸)的复制、转录和/或翻译，因为任何这些过程的上调会导致基因(核酸)所编码的多肽的浓度/数量的增加。这能应用大量本领域中已知也在本文中其它部分描述的方法而完成，例如以硫酸酯酶cdna和/或包含硫酸酯酶位点的基因组dna对细胞的转染,通过应用同源重组将例如强启动子元件置于内源性硫酸酯酶基因的基因组位点上游而激活内源性硫酸酯酶基因(参见，例如u.s.patentsnos.5,733,761、6,270,989和6,565,844中详细描述的基因激活技术，所有这些被整合在本文中作为参考)等。典型的对照将是载体质粒所转染的同样的细胞。增强(或增加)硫酸酯酶活性也指防止或抑制硫酸酯酶的降解(例如通过增强的泛素化),下调等,其导致例如相对于对照的增加的或稳定的硫酸酯酶分子t1/2(半衰期)。下调或降低的表达指基因和/或其编码的多肽的降低的表达。基因表达的上调或下调能通过一定方式直接测定，所述方式为应用任何本领域已知的适合的方式例如核酸杂交或抗体探测方法分别探测基因(例如,硫酸酯酶)的mrna水平或基因所编码多肽的蛋白质表达水平的增加或降低，并与对照比较。硫酸酯酶基因表达的上调或下调也能通过探测硫酸酯酶活性的变化而间接测定。类似地，在本文中所用的“具有增强的表达的甲酰甘氨酸生成酶”，典型地指本发明的fge核酸和/或其编码的多肽相对于对照的增加的表达。增加的表达指增加(即到可探测的程度)任何本发明的fge核酸(如本文中其它部分所描述的)的复制、转录和/或翻译，因为任何这些过程的上调会导致基因(核酸)所编码的多肽的浓度/数量的增加。这能应用上述的(对硫酸酯酶)和在本文中其它部分描述的方法而完成，在一定实施方案中，相对于甲酰甘氨酸生成酶缺乏的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少10％,15％,20％,50％,100％,200％,500％,1000％。本发明进一步包含在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的改进的方法。方法包括对需要这类治疗的受试者以有效剂量施用硫酸酯酶以治疗受试者中的硫酸酯酶缺乏症，其中硫酸酯酶与一定量的甲酰甘氨酸生成酶接触，所述量是增加硫酸酯酶比活性的有效量。如本文中其它部分所描述的，“比活性”指所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率。在此所用的“接触”指如本文中其它部分所描述的fge翻译后修饰硫酸酯酶。将对一般技术人员显然的是，如果编码fge和硫酸酯酶的核酸在细胞中共表达，或甚至如果分离的fge多肽与分离的硫酸酯酶多肽在体内或体外接触，则fge能接触硫酸酯酶并对它进行修饰。即使分离的fge多肽能与分离的硫酸酯酶多肽共施用于受试者，以治疗受试者中的硫酸酯酶缺乏症，在fge和硫酸酯酶之间的接触也优选在硫酸酯酶施用于受试者之前在体外发生。既然更低量的硫酸酯酶需要被施用，和/或以更低频率施用(因为硫酸酯酶具有更高的比活性)，此改进的治疗方法对受试者有益。参考下面的实施例，本发明将被更充分地理解。然而，这些实施例只倾向于举例说明本发明的实施方案，而不应被解释为限制本发明的范围。实施例实施例1:多种硫酸酯酶缺乏症由编码人cα-甲酰甘氨酸生成酶(fge)的基因中的突变所引起。实验程序材料和方法fge的体外分析为监测fge的活性，n-乙酰化和c-酰胺化的23聚肽p23(mtdfyvpvslctpsraalltgrs)(seqidno:33)被用作底物。位点11的半胱氨酸残基向fgly的转化通过maldi-tof质谱监测。30％乙氰和0.1％三氯乙酸(tfa)中的6μm的p23原液被制备。在标准条件下，6pmol的p23与高至10μl的酶一起在最终体积为30μl的50mmtris/hcl(ph9.0,含有67mmnacl,15μmcacl2,2mmdtt,和0.33mg/ml牛血清白蛋白)中于37℃培育。为停止酶反应，加入1.5μl10％tfa。然后p23被固着于ziptipc18(millipore)，以0.1％tfa清洗，并在3μl的50％乙氰和0.1％tfa中洗脱。0.5μl的洗脱液与0.5μl的基质溶液(50％乙氰和0.1％tfa中的5mg/mla-氰基-4-羟基-肉桂酸(brukerdaltonics,billerica,ma))在不锈钢的靶上混合。maldi-tof质谱应用反射模式和刚好高于解吸/电离阈值的激光能量以reflexiii(brukerdaltonics)完成。所有谱线是来自靶标上几个点的200-300次射击(shot)的平均值。质量轴应用分子质量范围在1000到3000da的肽作为外部标准而校准。p23的单同位素mh+是2526.28，而包含fgly产物的是2508.29。活性(pmol产物/小时)根据产物的峰值高度除以p23和产物的峰值高度总和而计算。来自牛睾丸的fge的纯化牛睾丸得自当地屠宰场，冰上保存最多20小时。实质(parenchyme)从结缔组织中释放，并在韦林氏搅切器中和通过三轮次的马达陶制(motorpottering)而匀浆。通过所得到的匀浆的细胞分级分离，粗微粒体(rm)的制备按(meyer等,j.biol.chem.,2000,275:14550-14557)所述并进行下面的修正而完成。三次差异离心步骤，每次4℃下20分钟，在500g(ja10转子),3000g(ja10)和10000g(ja20)下完成。rm膜从最后一次的上清液中沉淀(125000g,ti45转子,45分钟,4℃)，通过马达陶制匀浆并在蔗糖垫层上分层(50mmhepes,ph7.6,50mmkac,6mmmgac2,1mmedta,1.3m蔗糖,5mmβ-巯基乙醇)。在ti45转子中以45000rpm4℃下离心210分钟后，rm从沉淀中回收。通常100000-150000等价的rm，如walter和blobel(methodsenzymol.,1983,96:84-93)所定义，从1kg睾丸组织中得到。reticuloplasm，即rm的腔内容物通过低浓度脱氧bigchap下的分级抽提而得到，如fey等,j.biol.chem.,2001,276:47021-47028所述。对fge的纯化，95ml的reticuloplasm4℃下对20mmtris/hcl,ph8.0,2.5mmdtt透析20小时，而通过125000g下离心1小时澄清。32ml澄清reticuloplasm等份物室温下被装在monoqhr10/10柱(amershambiosciences,piscataway,nj)上，清洗和用线性梯度的80mltris缓冲液中的0到0.75mnacl以2ml/min洗脱。三轮洗脱的包含fge活性的级分(50-165mmnacl洗脱)被收集(42ml)，与2ml的伴刀豆球蛋白a-sepharose(amershambiosciences，已用含有0.5mkcl,1mmmgcl2,1mmmncl2,1mmcacl2,和2.5mmdtt的50mmhepes缓冲液,ph7.4清洗过)混合。4℃下培育16小时后，伴刀豆球蛋白a-sepharose在柱中被收集，并用6ml相同的hepes缓冲液清洗。固着的物质通过柱在室温下与6ml0.5ma-甲基甘露糖苷在50mmhepes,ph7.4，2.5mm中培育1小时而洗脱。洗脱用4ml的相同洗脱剂重复。来自伴刀豆球蛋白a-sepharose的合并的洗脱液(10ml)以0.5mtris/hcl(ph9.0)调至ph8.0，并与用10mg混杂肽(pvslptrscaalltgr)(seqidno:34)衍生化的2ml的affigel10(bio-radlaboratories,hercules,ca)混合，以缓冲液a(50mmhepes,ph8.0,含有0.15m乙酸钾,0.125m蔗糖,1mmmgcl2,和2.5mmdtt)清洗。4℃下培育3小时后，亲和基质在柱中被收集。收集经过的液体(flowthrough)和用4ml缓冲液a清洗的组分，合并，并与已用10mg的ser69肽(pvslstpsraalltgr)(seqidno:35)取代的2mlaffigel10混合，用缓冲液a清洗。4℃下培育过夜，亲和基质在柱中被收集，用6ml的缓冲液b(含有2mnacl和20种组成蛋白质的氨基酸(每一浓度为50mg/ml)的混合物的缓冲液a)清洗3次。通过将affigel与含有25mmser69肽的6ml缓冲液b培育两次，每次90min，而将固着的物质从亲和基质洗脱。洗脱液的等分组分以1mg/ml牛血清白蛋白取代，对缓冲液a透析，并分析活性。活性的保留部分(11.8ml)在vivaspin500浓缩器(vivascienceag,hannover,germany)中浓缩，并在95℃下溶于laemmlisds样品缓冲液。起始物质和层析步骤后得到的制剂的多肽组成以sds－page(15％丙烯酰胺,0.16％双丙烯酰胺)监测，和以syproruby(bio-radlaboratories)染色。通过质谱对fge的鉴定对于肽质量指纹分析，纯化的多肽用胰蛋白酶在凝胶内被消化(shevchenko等,anal.chem.,1996,68:850-855)，在c18ziptip上脱盐，并应用二氢苯甲酸作为基质和两种来自胰蛋白酶的自降解肽(m/z842.51和2211.10)作为内标准而以maldi-tof质谱进行分析。对串联质谱分析，选出的肽通过maldi-tofpost-sourcedecay质谱而被分析。它们对应的带双电荷的离子被分离出，并被offlinenano-esi离子阱质谱(esquirelc,brukerdaltonics)所片段化。质谱数据通过mascot检索算法用于ncbinr蛋白质数据库中和ncbiest核苷酸数据库中的蛋白质鉴定。生物信息学信号肽和切断的位置根据在emboss(rice等,trendsingenetics,2000,16:276-277)中实行的vonheijne(vonheijne,nucleicacidsres.,1986,14:4683-90)的方法被描述。n-糖基化位点应用brunak的算法(gupta和brunak,pac.symp.biocomput.,2002,310-22)被预测。功能结构域通过搜索pfam-hidden-markov-models(version7.8)(sonnhammer等,nucleicacidsres.,1998,26:320-322)而被探测到。为搜索fge同源物，nationalcenterforbiotechnologyinformation的数据库(wheeler等,nucleicacidsres.,2002,20:13-16)用blast(altschul等,nucleicacidsres.,1997,25:3389-3402)查询。序列类似度应用来自emboss的标准工具而计算。基因组位点组织和同线性应用ncbi的人和小鼠基因组资源及也来自ncbi,bethesda,md的人类-小鼠同源性图谱而确定。人fgecdna的克隆从人成纤维细胞应用rneasytmmini试剂盒(qiagen,inc.,valencia,ca)制备的总rna，应用omniscriptrttm试剂盒(qiagen,inc.,valencia,ca)以及寡(dt)引物或者fge专一的引物1199nc(ccaatgtaggtcagacacg)(seqidno:36)而被反转录。cdna的第一链通过应用正向引物1c(acatggcccgcgggac)(seqidno:37)和作为反向引物的1199nc或1182nc(cgactgctccttggactgg)(seqidno:38)的pcr而扩增。pcr产物被直接克隆进pcr4-topotm载体(invitrogencorporation,carlsbad,ca)。通过对克隆pcr产物(其从不同的个体和独立的rt－pcr反应得到)的多种测序，fgecdna的编码序列被确定(seqidnos:1和3)。突变探测，基因组测序，定点诱变和rna印迹分析此研究中采用的标准流程本质上如lübke等(nat.gen.,2001,28:73-76)和hansske等(j.clin.invest.,2002,109:725-733)所述。northern点与覆盖整个编码区cdna探针杂交，并与β-肌动蛋白cdna探针杂交而作为rna负载的对照。细胞系和细胞培养来自多种硫酸酯酶缺乏症患者1-6的成纤维细胞分别从e.christenson(rigshospitaletcopenhagen),m.beck(mainz),a.kohlschütter(eppendorf,hamburg),e.zammarchi(meyerhospital,universityofflorence),k.harzer(institutfürhirnforschung,tübingen),和a.fensom(guy’shospital,london)得到。人皮肤成纤维细胞,ht-1080,bhk21和cho细胞被以37℃和5％co2下保存在含有10％胎牛血清的dulbecco的修饰后的eagle培养基中。转染，间接免疫荧光，western印迹分析和fge活性的探测通过add-onpcr(其应用了pfu聚合酶(stratagene,lajolla,ca)和下列引物：ggaattcgggacaacatggctgcg(ecori)(seqidno:39),cccaagcttatgcgtagtcaggcacatcatacggatagtccatggtgggcaggc(ha)(seqidno:40),cccaagcttacaggtcttcttcagaaatcagcttttgttcgtccatggtgggcaggc(c-myc)(seqidno:41),cccaagcttagtgatggtgatggtgatgcgatcctctgtccatggtgggcaggc(rgs-his6)(seqidno:42))，fgecdna被装上5'ecori-位点以及3'ha-,c-myc或者rgs-his6-标记序列，及其后的终止密码子和hindiii位点。得到的pcr产物作为ecori/hindiii片段被克隆进pmpsveh(artelt等,gene,1988,68:213-219)。应用effectenetm(qiagen)作为转染试剂，得到的质粒被瞬时转染进生长在盖玻片上的ht-1080,bhk21和cho细胞。转染48小时后，细胞通过如前面所述的间接免疫荧光(lübke等,nat.gen.,2001,28:73-76；hansske等,j.clin.invest.,2002,109:725-733)，应用抗ha的单克隆igg1抗体(berkeley抗体company,richmond,ca),抗c-myc的单克隆igg1抗体(santacruzbiotechnology,inc.,santacruz,ca)或抗rgs-his的单克隆igg1抗体(qiagen)作为第一抗体而被分析。内质网标记蛋白即蛋白二硫键异构酶(pdi)被用不同亚型的单克隆抗体(igg2a,stressgenbiotech.,victoriabc,canada)所探测。第一抗体被用分别偶联到cy2或cy3的同型-专一性的山羊第二抗体(molecularprobes,inc.,eugene,or)所探测。免疫荧光图像在leicatcssp2aobs激光扫描显微镜上得到。对western印迹分析，应用相同的单克隆抗体，hrp-缀合的抗-小鼠igg被用作第二抗体。对fge活性的测定，胰蛋白酶化的细胞用含有2.5mmdtt、蛋白酶抑制剂和1％tritonx-100的10mmtris(ph8.0)所溶解的磷酸缓冲盐溶液清洗，其含有蛋白酶抑制剂的混合物(208μm4-(2-氨基乙基)盐酸苯磺酰基氟,0.16μm抑酶肽,4.2μm亮抑酶肽,7.2μm苯丁抑制素,3μm抑胃酶肽a,2.8μme-64)，并通过在125,000g离心1小时而澄清。上清液在monoqpc1.6/5柱上应用上述条件进行层析。在50-200mmnacl中洗脱的组分被收集，冷冻干燥，并重构成原始体积的十分之一，随后用肽p23测定fge活性。逆转录病毒转导目的cdnas被克隆进基于莫洛尼鼠白血病病毒的载体plpcx和plncx2(bdbiosciencesclontech,paloalto,ca)。嗜亲性的fnx-eco细胞(atcc,manassas,va)的转染，及兼嗜性retropacktmpt67细胞(bdbiosciencesclontech)和人成纤维细胞的转导按lübke等,nat.gen.,2001,28:73-76；thiel等,biochem.j.,2002,376,195-201所述完成。对部分实验，在测定硫酸酯酶活性前，用嘌呤霉素选择plpcx转导的pt67细胞硫酸酯酶分析asa,sts和galnac6s的活性按rommerskirch和vonfigura,proc.natl.acad.sci.,usa,1992,89:2561-2565；和kresse,clin.chim.acta,1978,88:111-119中所述被测定。结果对fge活性的基于肽的快速分析我们已发展出应用体外合成的[35s]asa片段作为底物而用于在微粒体抽提物中测定fge活性的分析法。片段被加入分析混合物而作为核糖体相连的初生链复合物。对产物的定量包括胰蛋白酶消化、肽通过rp-hplc的分离，及通过化学衍生为腙、rp-hplc分离和液闪计数的组合而对含有[35s]-标记的fgly的胰蛋白酶降解肽的鉴别和定量(fey等,j.biol.chem.,2001,276:47021-47028)。为监测纯化过程中的酶活性，此麻烦的程序需要被修正。对应于asa残基65-80和含有fgly形成所需的序列基序的合成性的16聚肽在体外分析中抑制了fge活性。这暗示了肽例如asa65-80可作为fge的底物而起作用。我们合成了23聚肽p23(seqidno:33)，其对应于asa残基60-80并附加了n-乙酰化的甲硫氨酸和c-酰胺化的丝氨酸残基以分别保护n-和c-末端。含有半胱氨酸和fgly的p23形式能通过基质辅助的激光解析/电离飞行时间(maldi-tof)质谱鉴别和定量。fgly残基在p23位点11的存在通过maldi-tofpostsourcedecay质谱证实(参见peng等,j.massspec.,2003,38:80-86)。p23和来自牛胰或牛睾丸微粒体的抽提物的培育将高至95％的肽转化成为含有fgly的衍生物(图1)。在标准条件下，反应与酶的数量和培育的时间成正比例，只要少于50％的底物被消耗和培育时间不超过24小时。p23的km是13nm。减少的和氧化的谷胱甘肽、ca2+和ph的效应与在应用核糖体相连初生链复合物作为底物的分析中所见到的那些相当(fey等,j.biol.chem.,2001,276:47021-47028)。fge的纯化对fge的纯化，牛睾丸微粒体的可溶性的级分(reticuloplasm)作为起始物质。fge的比活性比那些来自牛胰微粒体的reticuloplasm中的类型高10-20倍(fey等,j.biol.chem.,2001,276:47021-47028)。fge的纯化通过四个层析步骤的组合而完成。前两个步骤是在monoq阴离子交换柱和伴刀豆球蛋白a-sepharose柱上的层析。在ph8，fge活性物被固着到monoq，并在50-165mmnacl被洗脱，而具有60-90％的回收率。当此级分与伴刀豆球蛋白a-sepharose混合时，fge被固着。起始活性的30-40％能用0.5ma-甲基甘露糖苷洗脱。后面两个纯化步骤是以16聚肽衍生的亲和基质上的层析。第一亲和基质是asa65-80肽的变体所取代的affigel10，其中对fgly形成很关键的残基cys69,pro71和arg73被搅乱(混杂肽pvslptrscaalltgr-seqidno:34)。当以10mm浓度加入体外的分析中时，此肽不会抑制fge活性，且当固定到affigel10时不会保持fge活性。在混杂肽亲和基质上的层析除去了肽结合性蛋白，包括内质网的伴侣。第二亲和基质是asa65-80肽的变体所取代的affigel10，其中cys69被丝氨酸取代(ser69肽pvslstpsraalltgr-seqidno:35)。ser69肽亲和基质有效结合fge。fge活性物能用2mkscn或者25mmser69肽洗脱，而具有20-40％的回收率。在活性测定之前，kscn或ser69肽必须通过透析除去。cys69被丝氨酸的取代对活性fge的洗脱至关重要。被野生型asa65-80肽所取代的affigel10有效结合fge。然而，几乎没有活性能在用离液盐(kscn,mgcl2),肽(asa65-80或ser69肽)，或者低或高ph值缓冲液洗脱的洗脱液中回收。在图2中显示了起始物质和在经历了典型纯化过程的四个层析步骤之后得到的活性组分的多肽模式。在最终级分中，5％的起始fge活性和0.0006％的起始蛋白被回收(8333-倍纯化)。纯化的39.5和41.5kda多肽被单个基因编码在纯化的fge制剂中的39.5和41.5kda多肽被进行肽质量指纹分析。通过maldi-tof质谱得到的两个多肽的胰蛋白酶肽的质谱很大程度地重叠，暗示着两个蛋白质源自相同基因。在两个多肽的胰蛋白酶肽中，两个富含肽(mh+1580.73,sqntpdssasnlgfr(seqidno:43)和mh+2049.91,mvpipagvftmgtddpqik-seqidno:44外加两处甲硫氨酸氧化)被发现，其与具有genbankacc.no.ak075459(seqidno:4)的cdna所编码的蛋白质吻合。这两个肽的氨基酸序列被maldi-tofpostsourcedecay谱和应用offlinenano-electrosprayionisation(esi)离子阱质谱的ms/ms分析所确认。人cdna的牛定向进化同源物的est序列，其覆盖fge的c端部分并与两个肽的序列都吻合，提供了牛fge的另外的序列信息。fge的进化保守和结构域结构人fge基因被seqidnos:1和/或3的cdna编码，并位于染色体3p26。它跨度约为105kb，而编码序列分散在9个外显子中。人fge基因的三个定向进化同源物在小鼠中(87％一致),黄果蝇(48％一致),和疟蚊(47％一致)被发现。定向进化同源物的est序列在更多的8个物种中被发现，包括奶牛,猪,非洲爪蟾,siluranatropicalis,斑马鱼,鲑鱼和其它鱼物种(对于细节，参见实施例2)。外显子-内含子结构在人与小鼠基因间保守，而在染色体6e2上的小鼠基因位于与人染色体3p26同线的区域内。s.cerevisiae和c.elegans的基因组缺乏fge同源物。在原核生物中，12种人fge的同源物被发现。人fge的cdna被预测编码一个374残基的蛋白(图3和seqidno:2)。此蛋白包含一个33残基的可切断的信号序列，其表明fge到内质网中的迁移，此蛋白也包含了在asn141处的单一n-糖基化位点。fge与伴刀豆球蛋白a的结合暗示着此n-糖基化位点被应用。fge的残基87-367被列在pfam蛋白质基序数据库中，作为未知功能的结构域(pfam:duf323)。人fge和其在数据库中已鉴定出的真核生物的定向进化同源物的序列比较分析说明此结构域由三个不同的亚结构域组成。在四种已知的真核生物fge定向进化同源物中，n端亚结构域(人fge中的残基91-154)具有46％的序列一致性和79％的相似性。在人fge中，此结构域在asn141携带n-糖基化位点，这在其它定向进化同源物中保守。fge的中间部分(人fge中的残基179-308)为富含色氨酸的亚结构域(每129残基中12个色氨酸)。真核生物定向进化同源物在此亚结构域内的一致性是57％，相似性是82％。c端亚结构域(人fge中的残基327-366)是fge家族内最高度保守的序列。人c端亚结构域与真核生物定向进化同源物(3个全长序列和8个est)的序列一致性是85％，相似性是97％。在亚结构域3的40个残基内，四个半胱氨酸残基完全保守。三个半胱氨酸也在原核生物fge定向进化同源物中保守。fge家族的12个原核生物成员(细节参见实施例2)与真核生物fge共享亚结构域结构。三个亚结构域之间的边界在原核生物fge家族中更加明显，因为可变长度的非保守序列将亚结构域彼此分开。人和小鼠基因组编码两个密切相关的fge同源物(seqidnos:43和44,genbankacc.no.nm_015411，在人中；和seqidnos:45和46,genbankacc.no.ak076022，在小鼠中)。两个平行进化同源物为86％一致。它们的基因位于同线染色体区域(在人中7q11，在小鼠中5g1)。两个平行进化同源物都与fge定向进化同源物分享亚结构域结构，与人fge有35％一致性和47％的相似性。在两个同源物中都100％一致的第三亚结构域中，含有半胱氨酸的亚结构域3的十一体序列缺失。表达，亚细胞定位和分子形式2.1kb的单一转录子通过来自成纤维细胞的总rna和来自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾和胰的聚a+rna的rna印迹分析可被探测。相对于β-肌动蛋白rna，含量有一个数量级的变化，而在胰和肾中最高，脑中最低。多种真核生物细胞系，其稳定地或瞬时表达人fge的cdna或c端被ha-,myc-或his6-tag所延长的fge衍生物的cdna，被用于对fge活性和fge亚细胞定位进行分析。标记或非标记的fge的瞬时表达增加了1.6-3.9倍的fge活性。fge在pt67细胞中的稳定表达增加了约100倍的fge活性。在bhk21,cho和ht1080细胞中通过间接免疫荧光对带标记的fge形式的探测显示多种带标记的fge形式与蛋白质二硫键异构酶(一种内质网的腔蛋白)共定位。来自bhk21细胞(被编码带标记的fge形式的cdna所瞬时转染)的抽提物的western印迹分析显示单一的免疫活性条带，其表观大小在42到44kda之间。fge基因携带多种硫酸酯酶缺乏症中的突变多种硫酸酯酶缺乏症由硫酸酯酶中无法产生fgly残基的缺陷所引起(schmidt,b.等,cell,1995,82:271-278)。fge基因因此是多种硫酸酯酶缺乏症的候选基因。我们对7位多种硫酸酯酶缺乏症患者的fge编码性cdna进行了扩增和测序，发现十个不同的突变，其被基因组dna测序所确证(表1)。表1:msd患者中的突变*患者1是在schmidt,b.等,cell,1995,82:271-278和rommerskirch和vonfigura,proc.natl.acad.sci.,usa,1992,89:2561-2565中的多种硫酸酯酶缺乏症患者mo.。**患者6是被burk等,j.pediatr.,1984,104:574-578报道的多种硫酸酯酶缺乏症患者。其它患者代表未发表的病例。第一位患者是1076c>a置换(将丝氨酸359的密码子转换成了终止密码子)(s359x)和导致149-173的25个残基(被外显子3所编码和将蛋白质的第一与第二结构域分开)的删除的突变的杂合子。基因组测序显示第三个内含子的+5-8核苷酸的删除(ivs3+5-8del)，其从而破坏了内含子3的剪切供体位点。第二位患者是引起外显子3丢失(ivs3+5-8del)的突变和979c>t置换(将精氨酸327的密码子转换成了终止密码子)(r327x)的杂合子。由979c>t等位基因编码的截短的fge缺乏了亚结构域3的绝大部分。第三位患者是1045c>t置换(亚结构域3中的保守精氨酸349被色氨酸取代)(r349w)的纯合子。第四位患者是fge结构域中取代保守残基的两个错义突变的杂合子：1046>t置换(精氨酸349被谷氨酰胺取代)(r349q)和1006t>c置换(半胱氨酸336被精氨酸取代)(c336r)。第五位患者是836c>t置换(保守丙氨酸279被缬氨酸取代)(a279v)的杂合子。第二突变是一种单一核苷酸删除(243delc)，其在脯氨酸81之后改变序列并导致残基139之后的翻译停止。第六位患者是单一核苷酸删除(661delg)(其在残基220之后改变氨基酸序列并在残基266之后引入终止密码子)的杂合子。第二突变是内含子6的剪切受体位点突变(ivs6-1g>a)，其导致编码残基281-318的外显子7的按读码框删除。在第七位患者中，与在第三位患者中相同的1045c>t置换被发现。此外，我们探测到来自对照和多种硫酸酯酶缺乏症患者的18fge等位基因的编码区中的两种多态性。22％携带188g>a置换(丝氨酸63被天冬酰胺取代)(s63n)，而28％有沉默的1116c>t置换。多种硫酸酯酶缺乏症成纤维细胞以野生型和突变体fgecdna的转导为了确认fge缺陷是多种硫酸酯酶缺乏症中合成的硫酸酯酶无活性的原因，我们在多种硫酸酯酶缺乏症成纤维细胞中应用逆转录病毒基因转移来表达fgecdna。作为对照，我们转导了没有cdna插入物的逆转录病毒载体。为监测代谢缺陷的补偿(complementation)，asa、类固醇硫酸酯酶(sts)和n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶(galnac6s)的活性在选择之前或之后在被转导的成纤维细胞中测量。野生型fge的转导部分恢复了两种多种硫酸酯酶缺乏症-细胞系中的三种硫酸酯酶的催化活性(表2)，而在第三种多种硫酸酯酶缺乏症细胞系中部分恢复了sts的活性。应当指出的是，对于asa和galnac6s，恢复只是在对成纤维细胞选择之后的部分恢复，达到正常活性的20到50％。对于sts，活性被发现在选择后恢复到对照成纤维细胞的水平。选择增加了asa和sts的活性50到80％，其与早些时候的观察即15到50％的成纤维细胞被转导(lübke等,nat.gen.,2001,28:73-76)相一致。仅以逆转录病毒载体转导的多种硫酸酯酶缺乏症成纤维细胞中的硫酸酯酶活性(表2)与非转导性多种硫酸酯酶缺乏症成纤维细胞(未显示)中的那些结果相当。携带ivs3+5-8del突变的fgecdna的转导无法恢复硫酸酯酶活性(表2).表2:多种硫酸酯酶缺乏症成纤维细胞通过野生型或突变体fgecdna转导的补偿1数值给出了asa(mu/mg细胞蛋白质),sts(μu/mg细胞蛋白质),galnac6s(μu/mg细胞蛋白质)和β-己糖胺酶(u/mg细胞蛋白质)之间的比率。对于对照成纤维细胞，6-11个细胞系的均值和方差被给出。指明了平行转导的两种培养物的范围的情形针对多种硫酸酯酶缺乏症成纤维细胞给出。°多种硫酸酯酶缺乏症成纤维细胞的数目指表1中的患者的数目+选择前活性测定++选择后活性测定n.d.没有测定讨论fge是内质网的高度保守的糖蛋白来自牛睾丸的fge的纯化得到了源自相同基因的39.5和41.5kda的两种多肽。三种fge不同标记形式在三种不同真核生物细胞系中作为单一形式的表达暗示，在从牛睾丸纯化的fge制剂中观察到的两种形式中的一种可能由纯化过程中的有限蛋白水解所产生。asa65-80肽中cys69被丝氨酸的置换，对于fge通过亲和层析的纯化至关重要。fge具有可切断的信号序列，其介导穿过内质网膜的移位。成熟蛋白的更多部分(340个残基中的275个)定义了独有的结构域，其很可能由三个亚结构域组成(参见实施例2)，对于这三个亚结构域，都没有在具有已知功能的蛋白质中找到同源物。对线性fgly修饰基元在新合成的硫酸酯酶多肽中的识别(dierks等,emboj.,1999,18:2084-2091)可能是fge亚结构域的功能。催化结构域能以数种方式催化fgly形成。已有建议提出，fge从半胱氨酸的巯基吸取电子，并将它们转移到受体。得到的硫醛将自发地水解成fgly和h2s(schmidt,b.等,cell,1995,82:271-278)。替代性地，fge能扮演混合功能的加氧酶(单加氧酶)，在电子供体如fadh2的协助下将o2的一个原子引入到半胱氨酸，而另一个引入h2o。得到的半胱氨酸硫醛水合衍生物将自发地反应成fgly和h2s。部分纯化的fge制剂的初步实验显示fgly形成对分子氧的重要依赖性。这将暗示fge扮演混合功能的加氧酶。亚结构域3特别高的保守性和三个完全保守的半胱氨酸残基在其中的存在使得此亚结构域成为催化位点很可能的候选者。将会有趣的是研究，介导fgly基元的识别和电子受体或电子供体的结合的结构元件是否与fge的结构域结构相关。重组fge定位于内质网，这与所建议的其行为位置一致。fgly残基在新合成的硫酸酯酶中产生，这发生在它们移位到内质网的过程中或短时间之后(dierks等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1997,94:11963-11968；dierks等,febslett.,1998,423:61-65)。fge本身不含有kdel类型的er-保留信号。因此它在内质网中的保留可被与其它er蛋白的相互作用所介导。移位/n-糖基化机制的成分是这类相互作用的伴侣的有吸引力的候选者。导致多种硫酸酯酶缺乏症的fge中的突变我们已显示，编码fge的基因中的突变导致多种硫酸酯酶缺乏症。fge也可与其它成分相互作用，而编码后者的基因中的缺陷能同等有效地导致多种硫酸酯酶缺乏症。在七位多种硫酸酯酶缺乏症患者中，我们确实发现了fge基因中的十种不同突变。通过在亚结构域3(三个突变)或亚结构域2(一个突变)中取代高度保守的残基或c端不同长度的截短(四个突变)或大的按读码框删除(两个突变)，所有突变对fge蛋白有严重的影响。对于两种多种硫酸酯酶缺乏症-细胞系和一种多种硫酸酯酶缺乏症的突变，已有显示，野生型而不是突变体的fgecdna的转导部分恢复硫酸酯酶的活性。这清晰地鉴定出fge基因作为突变位点以及突变的致病本质。多种硫酸酯酶缺乏症是临床和生化方面都异型。在出生时期存在而发展出脑积水的罕见的新生形式，起初象幼儿异染性脑白质营养不良而后来发展出鱼鳞癣和粘多糖症类似特征的普遍形式，以及较少发生的温和形式(在此形式中，粘多糖症临床特征流行)，已被区分开。生化上其特征是硫酸酯酶的残余活性能被测到，对于大多数病例而言，其在培养的皮肤成纤维细胞中低于对照的10％(burch等,clin.genet.,1986,30:409-15；basner等,pediatr.res.,1979,13:1316-1318)。然而，在某些多种硫酸酯酶缺乏症细胞系中，选出的硫酸酯酶的活性能达到正常范围(yutaka等,clin.genet.,1981,20:296-303)。此外，残余活性已被报道经历了基于细胞培养条件和未知因素的变化。生化上，多种硫酸酯酶缺乏症被分类为两组。在组i中，硫酸酯酶的残余活性低于15％，包括asb的那些部分。在组ii中，硫酸酯酶的残余活性更高一些，特别是asb的那些部分可达到高至对照的50-100％的值。所有在此报道的患者除了患者5都属于组i，患者5属于生化表型的组ii(asb活性在对照的范围内)。基于临床标准，患者1和6是新生型病例，而患者2-4和7是普遍型，患者5是多种硫酸酯酶缺乏症的类粘多糖症形式。表型异质性暗示多种硫酸酯酶缺乏症患者中的不同突变与不同的fge残余活性相关。稳定表达fgeivs3+5-8del的pt67细胞上的初步数据表明外显子3的按读码框删除完全终止了fge活性。应用最近发展出的高敏感性质谱方法对多种硫酸酯酶缺乏症中的突变、变体fge的生化性质的特征鉴定，及对硫酸酯酶中的fgly的残余含量的特征鉴定(peng等,j.massspec.,2003,38:80-86)将为多种硫酸酯酶缺乏症中基因型－表型相关性提供更好的理解。实施例2:人fge基因定义了修饰硫酸酯酶的从原核生物到真核生物都保守的新基因家族生物信息学信号肽和切断位点以vonheijne所述的方法(nucleicacidsres.,1986,14:4683)，该方法在emboss中的实行(rice等,trendsingenetics,2000,16:276-277),和nielsen等的方法(蛋白质engineering,1997,10:1-6)来描述。n-糖基化位点应用brunak的算法(gupta和brunak,pac.symp.biocomput.,2002,310-22)预测。功能结构域通过搜索pfam-hidden-markov-models(version7.8)而被探测(sonnhammer等,nucleicacidsres.,1998,26:320-322)。来自pfamduf323种子的序列从trembl(bairoch,a.和apweiler,r.,nucleicacidsres.,2000,28:45-48)得到。多重排列和系统发生树的构建用clustalw(thompson,j.等,nucleicacidsres.,1994,22:4673-4680)完成。对于系统发生树的估计，缺口位置被排斥，而多重置换被修正。完成树引导程序(treebootstraping)以得到显著的结果。树应用njplot(perriere,g.和gouy,m.,biochimie,1996,78:364-369)而可见。比对应用来自emboss的pret-typlot命令而作出曲线。为搜索fge同源物，nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)的数据库nr,nt和est(wheeler等,nucleicacidsres.,2002,20:13-16)被用blast(altschul等,nucleicacidsres.,1997,25:3389-3402)查询。对于蛋白质序列，对当前版本nr数据库应用迭代收敛性psi-blast完成搜索，使用期望截止值10-40和默认参数。收敛在5次迭代后实现。对于核苷酸序列，搜索以psi-tblastn完成：应用nr和人fge的蛋白质序列作为输入值，用迭代收敛性psi-blast建立针对hfge的分值矩阵。此矩阵被用作对blastall的输入值，以查询核苷酸数据库nt和est。对于这两个步骤，都用期望截止值10-20。蛋白质二级结构预测应用psipred(jones,d.,jmolbiol.,1999,292:1950-202；mcguffin,l.等,bioinformatics,2000,16:404-405)完成。亚结构域的相似性分数应用emboss的cons算法以默认参数从比对中计算。次比对(metaalignments)通过比对fge家族亚类的共有序列而产生。基因组位点组织和同线性应用在ncbi(bethesda,md)的ncbi人和小鼠基因组资源和softberry’s(mountkisco,ny)human-mouse-ratsynteny而测定。细菌基因组序列从ncbi-ftp-服务器下载。ncbi微生物基因组注解被用于获得对细菌fge基因的基因组位点的总览。结果和讨论人fge与相关蛋白的基本特征和基元人fge基因(seqidnos:1,3)编码预测具有374个残基的fge蛋白(seqidno:2)。在残基22-33之间的切断信号(15.29的heijne值)和在1.7和3.3之间的残基17-29的亲水值(kyte,j.和doolittle,r.,jmolbiol.,1982,157:105-132)表明，33个n端残基在er移位后被切下来。然而应用nielsen等人的算法(proteinengineering,1997,10:1-6)，预测信号序列的切断发生在残基34之后。蛋白质在asn141处具有单一的潜在n-糖基化位点。以fge蛋白序列对蛋白质基元数据库pfam(sonnhammer等人,nucleicacidsres.,1998,26:320-322)的搜索显示人fge的残基87-367能被分类成具有7:9*10-114的高显著期望值的蛋白结构域duf323(“未知功能的结构域”,pf03781)。确定duf323的pfam一种子由25个蛋白质序列组成，其受试者是源自测序数据的假设性蛋白质。为分析人fge和duf323间的关系，进行具有duf323种子序列的fge的多重比对。基于此，构建系统发生树并进行自展分析。假设性序列中的四个(trembl-idsq9ck12,q9i761,o94632和q9y405)与种子的其它成员有如此强的差异以至于它们阻止成功的自展分析而不得不被从这套序列中除去。图2显示经自展的树，其显示人fge和余下的21种duf323种子蛋白质之间的关系。此树可用于将这些种子成员亚分成两个类别：与人fge密切相关的同源物，和余下的相关性较小的基因。最顶上的7个蛋白质具有在0.41和0.73之间的对人fge的系统发生距离。它们只含有单一结构域,duf323。在本组内的同源性延伸到整个氨基酸序列，其较大部分由duf323结构域组成。duf323结构域在此组同源物内非常保守，而种子的其它15个蛋白与人fge的相关性较小(系统发生距离在1.14和1.93之间)。它们的duf323结构域与高度保守的第一组的duf323-结构域(参见“fge亚结构域和fge基因中的突变”这一节)有明显的差异。这15个蛋白质中的大多数是假设的，它们中的6个已被进一步研究。它们中的一个，来自c.trachomatis的丝氨酸/苏氨酸激酶(trembl:o84147)包含除duf323之外的其它结构域：atp-结合结构域和激酶结构域。来自r.sphaeroides(trembl:q9alv8)和假单孢菌属物种(trembl:o52577)的序列编码蛋白质nirv，它是与含铜的亚硝酸盐还原酶nirk共转录的基因(jain,r.和shapleigh,j.,microbiology,2001,147:2505-2515)。carc(trembl:q9xb56)是涉及来自e.carotovora的β-内酰胺抗生素的合成的加氧酶(mcgowan,s.等人,molmicrobiol.,1996,22:415-426；khaleelin,t.c.,和busbyrw,biochemistry,2000,39:8666-8673)。xylr(trembl:o31397)和bh0900(trembl:q9kef2)是在芽孢杆菌科(bacillaceae)和梭菌科(clostridiaceae)中涉及戊糖利用的调节的增强子结合蛋白质(rodionov,d.等人,femsmicrobiollett.,2001,205:305-314)。fge和duf323的比较导致建立区分fge家族与具有不同功能的、疏远的、含有duf323的同源物的同源性阈值。后者包括丝氨酸/苏氨酸激酶和xylr(转录增强子)以及fge(产生fgly的酶)和carc(加氧酶)。如本文中其它部分所讨论的，fge也可作为加氧酶而发挥其半胱氨酸修饰功能，这暗示duf323种子的fge和非fge成员可共享加氧酶功能。fge的同源物人fge的密切相关的同源物在duf323种子中的存在引导我们在ncbi的nr数据库中搜索人fge的同源物(wheeler等人,nucleicacidsres.,2002,20:13-16)。搜索的阈值以这样的方式选择，即获得在duf323种子中存在的全部6个同源物和其它密切相关的同源物而没有发现其它的种子成员。此搜索导致鉴定出真核生物中的3种fge定向进化同源物、原核生物中的12种定向进化同源物和人与小鼠中的2种平行进化同源物(表3)。表3:真核生物和原核生物中的fge基因家族gi-genbank蛋白质标识符na-核酸–aa-氨基酸e1–真核生物定向进化同源物e2-真核生物平行进化同源物p1–密切相关的原核生物定向进化同源物p2–其它原核生物定向进化同源物f-genbank中误预测的蛋白质序列注意小鼠序列gi22122361在genbank中是被预测成编码一种284个氨基酸的蛋白质，虽然cdna序列nm145937编码一种372个残基的蛋白质。此误预测是由于忽略了鼠fge基因第一外显子。所有在nr数据库中发现的序列都来自更高等的真核生物或原核生物。fge-同源物没有在古细菌或植物中被探测到。以甚至更低的阈值在被完全测序的秀丽线虫(c.elegans)和啤酒糖酵母(s.cerevisiae)基因组及相关的orf数据库中所进行的搜索没有显示出任何同源物。在nt和est核苷酸数据库的真核生物序列中的搜索导致鉴定出8种另外的fge定向进化同源的est，它们具有在蛋白质水平上显示高度保守性的3’-端cdna序列片段，并且没有在nr数据库中列出。这些序列不包含mrna的全部编码部分，且全都来自更高等的真核生物(表4)。表4:真核生物中的fge定向进化同源物est片段gb-genbank登录号；na-核酸来自nr数据库的编码序列的多重比对和系统发生树的构建(应用clustalw)允许了对同源物四个亚组的定义：真核生物定向进化同源物(人、小鼠、蚊子和果蝇fge)，真核生物平行进化同源物(人和小鼠fge平行进化同源物)，与fge密切相关的原核生物定向进化同源物(链霉菌(streptomyces)和棒状菌(corynebacterium))，和其它原核生物定向进化同源物(柄细菌(caulobacter),假单胞菌(pseudomonas),分支杆菌(mycobacterium),prochlorococcus,mesorhizobium,根瘤菌(sinorhizobium),novosphingobium,ralstonia,伯克霍尔德氏菌(burkholderia),和微颤菌(microscilla))。真核生物定向进化同源物显示对人fge的87％(小鼠),48％(果蝇)和47％(疟蚊)的总体一致性。虽然fge定向进化同源物在原核生物和更高等的真核生物中被发现，但是它们在系统发生上位于啤酒糖酵母和黄果蝇之间的更低等真核生物的全测序基因组中不存在。此外，fge同源物在大肠杆菌和thepufferfish的全测序基因组中也不存在。如本文其它部分所讨论的，在人和小鼠中发现的fge平行进化同源物可具有较小的产生fgly的活性，并对在多种硫酸酯酶缺乏症患者中发现的残余硫酸酯酶活性作出贡献。fge的亚结构域fge基因家族的成员具有三个高度保守的部分/结构域(如本文其它部分所述)。除了分开前者的两个非保守序列外，它们在n-和c-端还具有非保守的延伸。三个保守部分被认为代表了duf323结构域的亚结构域，因为它们被不同长度的非保守部分所间隔开。间隔开亚结构域1和2的部分的长度在22和29个残基之间变化，而间隔开亚结构域2和3的部分的长度在7到38个氨基酸之间变化。n-和c-端非保守部分显示甚至更强的长度变化(n-端:0-90个氨基酸,c-端:0-28个氨基酸)。来自ralstoniametallidurans的fge基因的序列很有可能不完整，因为它缺乏第一亚结构域。为验证对duf323的亚结构域的定义有道理，我们应用psipred完成了对人fge蛋白的二级结构预测。疏水性的er-信号(残基1-33)被预测为含有螺旋结构，确认了von-heijne算法的信号预测。n-端非保守区(氨基酸34-89)和亚结构域2和3之间的分隔区(氨基酸308-327)包含卷绕部分。分隔亚结构域1和2的区域包含卷绕。氨基酸65/66处的α-螺旋具有低的预测置信度，并且很可能是预测假象。亚结构域边界位于卷绕内，而不打断α-螺旋或β-链。第一亚结构域由几个β-链和一个α-螺旋组成，第二亚结构域包含两个β-链和四个α-螺旋。第三亚结构域在亚结构域的起点和终点具有侧面与折叠片相接的α-螺旋。简而言之，二级结构与所提出的亚结构域结构一致，因为亚结构域边界位于卷绕内且亚结构域包含结构性的元件α-螺旋和β-链。应当指出的是，没有亚结构域以数据库所列出的序列中的单独的模块存在。在fge家族的四个亚组的每一种内，亚结构域高度保守，而第三亚结构域显示最高的同源性(表5)。此亚结构域在亚组之间也显示最强的同源性。表5:fge家族亚结构域的同源性(％相似性)e1-真核生物定向进化同源物；e2-真核生物平行进化同源物p1–密切相关的原核生物定向进化同源物；p2–其它原核生物定向进化同源物fge家族的第一亚结构域在亚组间显示出最弱的同源性。在真核生物定向进化同源物中，它携带n-糖基化位点：人中的残基asn141，小鼠中的asn139和果蝇中的asn120。在疟蚊中，在与黄果蝇asn120同源的残基130处没有发现天冬酰胺。然而，两个核苷酸的改变将在疟蚊中创造出一个n-糖基化位点asn130。因此，包含残基130的序列需要再次测序。第二亚结构域富含色氨酸，人fge的129个残基中有12个trp。这些色氨酸中的十个在fge家族中保守。亚结构域3的高保守性：真核生物定向进化同源物之间的亚结构域3是100％类似和90％一致。第三亚结构域对蛋白质功能的重要性被这样的观察结果所强调，即此亚结构域是多种硫酸酯酶缺乏症患者中的致病性突变的热点。实施例1中所述的在6位多种硫酸酯酶缺乏症患者中鉴别的9个突变中的7个是位于编码亚结构域3的40个残基的序列中。残基包含4个半胱氨酸，其中3个在原核生物和真核生物定向进化同源物中保守。两种真核生物平行进化同源物显示出与fge家族其它成员的最小同源性，例如它们缺乏亚结构域3的3个保守半胱氨酸中的2个。在定向进化同源物和平行进化同源物的亚结构域3序列之间保守的特征是起始的rvxxgg(a)s基元(seqidno:79)，一种含有3个精氨酸的七肽(亚结构域共有序列的残基19-25)，和末端的gfr基元。对15个不是fge密切同源物的种子序列的duf323结构域进行比较，显示出显著的序列差异：15个种子序列具有相对不保守的第一和第二亚结构域，虽然整个亚结构域结构也可见到。当与原核生物fge家族成员(约60％的相似性)比较时，在fge家族中非常保守的亚结构域3更短，并具有对真核生物亚结构域3的显著更弱的同源性(约20％的相似性)。因此它们缺乏所有的亚结构域3的保守半胱氨酸残基。仅有的保守特征是起始的rvxxgg(a)s基元(seqidno:79)和末端的gfr基元。人和鼠fge基因的基因组组织人fge基因位于染色体3p26。它含有105kb和9个用于翻译序列的外显子。鼠fge基因长度为80kb，位于染色体6e2。鼠fge基因的9个外显子具有几乎与人外显子同样的大小(图3)。人和小鼠基因之间的主要差异是外显子9中的3'-utr的更低的保守性和外显子9的长度，在鼠基因中外显子9的长度多了461bp。小鼠染色体6的区段6e2与人染色体区段3p26是高度同线性的。在朝着端粒的方向上，人和鼠fge座位的侧面都与编码lmcd1、kiaa0212、itpr1、axcam和il5ra的基因相接。在着丝粒方向上，两个fge座位在侧面都与cav3和oxtr的座位相接。原核生物fge基因的基因组组织在原核生物中，硫酸酯酶根据在它们的活性中心中转换成fgly的残基而被分类为或者半胱氨酸型或者丝氨酸型的硫酸酯酶(miech,c.等人,jbiolchem.,1998,273:4835-4837；dierks,t.等人,jbiolchem.,1998,273:25560-25564)。在肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(e.coli)和鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)中，丝氨酸型硫酸酯酶是具有atsb的操纵子的一部分，其编码含有铁－硫族的基元的胞质蛋白质，并对从丝氨酸残基产生fgly是至关重要的(marquordt,c.等人,jbiolchem.,2003,278:2212-2218；szameit,c.等人,jbiolchem.,1999,274:15375-15381)。因此有意思的是，检测原核生物fge基因是否位于作为fge底物的半胱氨酸型硫酸酯酶的邻近位置。在表3中所示的原核生物fge基因中，7种具有已被完全测序的基因组，从而允许了对fge座位的相邻相关效应的分析。实际上，在7个基因组的4个(c.efficiens:pid25028125,恶臭假单孢菌:pid26990068,新月柄杆菌:pid16125425和结核分枝杆菌:pid15607852)中，发现半胱氨酸型硫酸酯酶直接与fge相邻，这与fge和硫酸酯酶的共转录相一致。在它们中的两种(c.efficiens和恶臭假单孢菌)中，fge和硫酸酯酶甚至具有重叠的orf，这强烈地指明了它们的共表达。此外，fge和硫酸酯酶基因在四种原核生物中的基因组相邻相关效应为细菌fge是功能性的定向进化同源物的假设提供了另外的证据。余下的三种生物含有半胱氨酸型硫酸酯酶(天蓝色链霉菌:pid24413927,根瘤菌:pid13476324,苜蓿中华根瘤菌:pids16262963,16263377,15964702)，然而，在这些生物中邻近fge的基因既不含有规范的硫酸酯酶特征(dierks,t.等人,jbiolchem.,1998,273:25560-25564)也不含有将会指明它们功能的结构域。因此在这些生物中，fge和半胱氨酸型硫酸酯酶的表达很可能被反式调节。结论对其缺乏可引起常染色体隐性传递的溶酶体储存性疾病(多种硫酸酯酶缺乏症)的人fge进行鉴定使得能够定义一个新的基因家族，所述基因家族包含来自原核生物和真核生物的fge定向进化同源物以及小鼠和人中的fge平行进化同源物。在全测序的大肠杆菌,啤酒糖酵母,秀丽线虫和fugurubripes的基因组中没有发现fge。此外，在原核生物和更高等的真核生物之间存在系统发生上的间隔，在系统发生上位于原核生物和黄果蝇之间的任何物种中没有fge。然而，这些更低等真核生物中的一部分，例如秀丽线虫，具有半胱氨酸型硫酸酯酶基因。这指明了作用于半胱氨酸型硫酸酯酶的第二产生fgly的系统的存在。此假设被这样的观察结果支持，即没有fge的大肠杆菌能在半胱氨酸型硫酸酯酶中产生fgly(dierks,t.等人,jbiolchem.,1998,273:25560-25564)。实施例3:fge表达引起硫酸酯酶过表达的细胞系中的硫酸酯酶活性的显著增加我们想检测fge对表达/过表达硫酸酯酶的细胞的影响。为此目标，表达艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(i2s)或n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶(galns)这些人硫酸酯酶的ht-1080细胞用fge表达构建体pxmg.1.3(表7和图4)或用对照质粒pxmg.1.2(反义方向的fge，不能产生功能性fge,表7)进行两次重复的转染。在进行一次24小时电穿孔后的培养基改变之后24、48和72小时采集培养基样本。培养基样本通过活性分析来测试各自的硫酸酯酶活性，并通过对艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶或n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶专一的elisa来评估总硫酸酯酶蛋白水平。表6.表达硫酸酯酶的转染的细胞系，该硫酸酯酶用作转染的底物细胞株质粒表达的硫酸酯酶36fpxfm4a.1n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶30c6pxi2s6艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶表7.用于转染表达艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶和n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶的ht-1080细胞的fge和对照质粒*>表示方向5’到3’实验程序材料和方法对产生艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶和n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶的ht-1080细胞的转染采集ht-1080细胞，以得到对于每次电穿孔有9-12x106的细胞。用两种质粒重复转染两次：一种是待测试(fge)的，而另一种作对照；在此情形中对照质粒包含相对于cmv启动子以反向克隆的fgecdna。细胞以约1000rpm离心5分钟。细胞以16x106个细胞/ml悬浮在1xpbs中。将100μg的质粒dna加到电穿孔小杯的底部，将750μl的细胞悬浮液(12x106个细胞)加入小杯中的dna溶液中。细胞和dna用塑料移液管轻轻混合，小心不要产生泡沫。细胞以450v,250μf(bioradgenepulser)进行电穿孔。记录时间常数。让电穿孔的细胞静置10-30分钟。然后加入1.25ml的dmem/10％小牛血清到每一个小杯，混合，并将所有细胞转移到含有20mldmem/10的新鲜的t75烧瓶。24小时后，烧瓶中再注入20mldmem/10以除去死亡的细胞。转染后48-72小时，收集培养基样本，从完全一样的t75烧瓶采集细胞。培养基制备1ldmem/10(含有：23ml的2mml－谷氨酸，115ml小牛血清)细胞在不含氨甲蝶呤(mtx)的培养基中被转染。24小时后，细胞用含有适量mtx(36f＝1.0μmmtx,30c6＝0.1mmtx)的培养基再进行培养。再培养后24、48和72小时，收获培养基和收集细胞。活性分析艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(i2s)nap5脱盐柱(amershampharmaciabiotechab,uppsala,sweden)用透析缓冲液(5mm醋酸钠,5mmtris,ph7.0)平衡。含有i2s的样本被加到柱上，并让其进入柱床。样本以1ml的透析缓冲液洗脱。脱盐的样本用反应缓冲液(5mm醋酸钠,0.5mg/lbsa,0.1％tritonx-100,ph4.5)进一步稀释到约100ng/mli2s。将10μl的每一i2s样本加入96-孔的fluormetricplate(perkinelmer,norwalk,ct)的顶上一排，并在37℃预培育15分钟。底物通过将4-甲基-形基硫酸酯(fluka,buchs,switzerland)溶解在底物缓冲液(5mm醋酸钠,0.5mg/mlbsa,ph4.5)中至最终浓度为1.5mg/ml而制备。100μl的底物被加至含有i2s样本的每一孔中，并将平板在37℃于黑暗中培育1小时。培育后，将190μl的终止缓冲液(332.5mm甘氨酸,207.5mm碳酸钠,ph10.7)加至含有样本的每一孔中。4-甲基伞形酮(4-muf,sigma,st.louis,mo)储液在试剂级水中制备成最终浓度为1μm以作为产物标准。150μl的1μm4-muf储液和150μl终止缓冲液加至平板中的顶上一排。150μl的终止缓冲液加至96孔平板中剩下的每一孔中。从平板的每一列的顶上一排至最后一排制备两倍的系列稀释液。平板在fusionuniversalmicroplateanalyzer(packard,meriden,ct)上以330nm的激发过滤波长和440nm的发射过滤波长进行阅读。得到4-muf储液的微摩尔数量对荧光的标准曲线，而未知样本具有由此曲线推断的荧光。结果以“单位/ml”(一个单位的活性等于在37℃下每分钟产生1μmole的4-muf)显示。n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶(galns)galns活性分析利用了荧光底物4-甲基形基-β-d-吡喃半乳糖苷-6-硫酸酯(torontoresearchchemicalsinc.,目录号m33448)。分析包括两个步骤。在第一步骤中，75μl的在反应缓冲液(0.1m醋酸钠,0.1m氯化钠,ph4.3)中制备的1.3mm底物与10μl的培养基/蛋白质样本或其相应的稀释液在37℃培育4小时。反应通过加入5μl的2m磷酸二氢钠以抑制galns活性而被终止。加入约500u的来自米曲霉(aspergillusoryzae)的β-半乳糖苷酶(sigma,目录号g5160)后，反应混合物在37℃再培育1小时以释放底物的荧光部分。第二反应通过加入910μl的终止溶液(1％甘氨酸,1％碳酸钠,ph10.7)而被终止。所得混合物的荧光通过使用359nm的测量波长和445nm的参考波长，并以4-甲基伞形酮(钠盐，sigma,目录号m1508)用作参考标准来测量。一个活性单位对应每小时释放的4-甲基伞形酮的nmole数量。免疫分析(elisa)艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(i2s)96孔平底平板用在50nm碳酸氢钠(ph9.6)中稀释到10μg/ml的小鼠单克隆抗-i2s抗体于37℃包被1小时。抗纯化的、重组产生的全长人i2s多肽的小鼠单克隆抗-i2s抗体在与mainebiotechnologyservices,inc.(portland,me)的合同下应用标准杂交瘤产生技术来制备。平板用含有0.1％tween-20的1xpbs清洗3次和用清洗缓冲液中的2％bsa在37℃封闭1小时。含2％bsa的清洗缓冲液用于稀释样本和标准物。i2s标准物被稀释到100ng/ml至1.56ng/ml，并如此进行应用。除去封闭缓冲液后，样本和标准被施加到平板上，并在37℃培育1小时。将探测抗体，即缀合辣根过氧化物酶的小鼠抗-i2s抗体，在含2％bsa的清洗缓冲液中稀释到0.15μg/ml。平板清洗3次，将探测抗体加至平板，并在37℃培育30分钟。为使平板显色，制备tmb底物(bio-rad,hercules,ca)。平板清洗3次，将100μl的底物加至每一孔中，并在37℃培育15分钟。反应用2n硫酸(100μl/孔)终止，和将平板在微量滴定平板读取器上于450nm，并用655nm作为参考波长进行阅读。n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶(galns)两种小鼠单克隆抗-galns抗体提供了galnselisa的基础。抗纯化的、重组产生的全长人galns多肽的小鼠单克隆抗-galns抗体也在与mainebiotechnologyservices,inc.(portland,me)的合同下应用标准杂交瘤产生技术来制备。为捕获galns，第一抗体被用于在包被缓冲液(50mm碳酸氢钠,ph9.6)中对f96maxisorpnunc-immunoplate(nalgenunc,目录号442404)进行包被。在37℃培育1小时和用清洗缓冲液清洗后，平板用封闭缓冲液(pbs,0.05％tween-20,2％bsa)在37℃封闭1小时。然后将实验和对照样本与galns标准物一起装载到平板上，并进一步在37℃培育1小时。在用清洗缓冲液清洗后，抗体，即缀合hrp的探测抗体被加到封闭缓冲液中，之后在37℃培育30分钟。再次清洗平板后，加入bio-radtmb底物试剂，并培育15分钟。然后加入2n硫酸以终止反应，结果通过应用moleculardevice平板读取器在450nm波长以分光光度测量法进行评分。讨论fge对硫酸酯酶活性的影响galns相对于对照水平观察到大约50倍的总galns活性的增长(图5)。此增长的活性的水平在全部三个培养基取样时间点都被观察到。此外，galns活性随时间线性积累，在24和48小时之间具有4倍的增长，在48和72小时之间的时间点有2倍的增长。i2s虽然是更小的绝对数量级，但对于总i2s活性，也观察到类似效应，其中相对于对照水平观察到大约5倍的总i2s活性增长。此增长的活性的水平在实验延续过程中维持不变。i2s活性在培养基中随时间线性积累，类似于用galns所见到的结果(在24和48小时之间为2.3倍，在48和72小时之间为1.8倍).fge对硫酸酯酶比活性的影响galnsfge在36f细胞中的表达以相对于对照水平的40-60倍增强了galns的表观比活性(由elisa测得的酶活性对总酶的比率)(图6)。此比活性的增长在研究中的三个时间点都维持不变，并似乎在转染后积累的三天中一直增长。i2s用i2s见到类似效应，其中相对于对照值(0.5-0.7u/mg)观察到比活性的6-7倍的增长(3-5u/mg)。galns(图7)和i2s的elisa值都没有受到fge的转染的明显影响。这表明fge的表达没有影响到参与硫酸酯酶产生的翻译和分泌途径。总之，两种硫酸酯酶的所有这些结果表明，fge表达在过表达galns和i2s的细胞系中显著地增长了硫酸酯酶的比活性。fge(sumf1)和其它硫酸酯酶基因的共表达为测试fge(sumf1)在正常细胞中对另外的硫酸酯酶活性的效应，我们在共转染或没有共转染fge(sumf1)cdna的不同细胞系中过表达arsa(seqidno:14),arsc(seqidno:18)和arse(seqidno:22)cdna，并测量硫酸酯酶活性。硫酸酯酶cdna在cos-7细胞中的过表达引起硫酸酯酶活性的适度增长，而当硫酸酯酶基因和fge(sumf1)基因共表达时，观察到惊人的协同性增长(20到50倍)。虽然更弱但类似的效应在三种另外的细胞系即hepg2、le293和u2os中被观察到。多重硫酸酯酶cdna的同时过表达引起每一种专一硫酸酯酶活性相对于单一硫酸酯酶过表达时更少的增长，表明存在不同硫酸酯酶对修饰机制的竞争。为测试fge(sumf1)基因在进化过程中的功能保守性，我们在共转染或没有共转染多种硫酸酯酶缺乏症cdna的多种细胞系中过表达arsa、arsc和arsecdna，并测量硫酸酯酶活性。鼠和果蝇的fge(sumf1)基因对全部三种人硫酸酯酶都有活性，果蝇fge(sumf1)效率更低。这些数据证明fge(sumf1)在进化过程中的高度功能保守性，暗示了对细胞功能和生存的显著的生物重要性。通过应用fge2(sumf2)基因观察到虽然弱得多但类似和一致的效应，暗示由此基因编码的蛋白质也具有硫酸酯酶修饰活性。这些数据证明fge(sumf1)所编码的蛋白质的数量是对硫酸酯酶活性的限制性因素，这是一个对于大规模生产用于酶替代治疗的活性硫酸酯酶具有重要暗示的发现。实施例4:通过应用微细胞介导的染色体转移的功能互补来鉴定多种硫酸酯酶缺乏症中突变的基因在应用微细胞介导的染色体转移以功能互补反式进行的单独的实验中，我们证实了多种硫酸酯酶缺乏症中突变的基因是fge。我们的发现提供了对于影响某一在关系较疏远的生物体中的整个蛋白质家族的新生物机制的进一步见解。除了鉴别罕见遗传病的分子基础之外，我们的数据进一步证实了fge基因产物对硫酸酯酶活性的有力的增强效应。后一发现对于至少8种由硫酸酯酶缺乏引起的人类疾病的治疗具有直接的临床意义。染色体3p26的多种硫酸酯酶缺乏症基因图谱为鉴别多种硫酸酯酶缺乏症中突变的基因的染色体位置，我们尝试以通过微细胞介导的染色体转移的功能互补来补救缺陷性的硫酸酯酶。含有单独的用显性可选择标记hytk标记的正常人染色体的一组人/小鼠杂交细胞系，被用作人染色体供体的来源，并与来自多种硫酸酯酶缺乏症患者的永生化细胞系融合。所有22条人常染色体被一条条地转移到患者细胞系，用潮霉素选出杂交体。在22个转移实验的每一个中，挑选出大约25个存活的克隆。这些克隆单独生长，并进行采集以用于随后的酶测试。对于大约440个(20x22)克隆的每一个，测试芳基硫酸酯酶a(arsa)(seqidno:15),芳基硫酸酯酶b(arsb)(seqidno:17)和芳基硫酸酯酶c(arsc)(seqidno:19)活性。此分析清晰地表明源自染色体3转移的数个克隆的硫酸酯酶活性比其它所有克隆都显著地高。当分析源自染色体3转移的每一单独克隆的活性时，观察到惊人的可变性。为核实是否每一克隆都具有来自供体细胞系的完整的人染色体3，我们应用一组23个染色体3多态性遗传标记，它们沿染色体的长度均匀分布，并于先前基于在供体和患者细胞系之间具有不同等位基因而挑选出来。这允许我们检测供体染色体的存在和鉴别由于偶然染色体断裂而造成的特异区域可能的丢失。每一具有高酶活性的克隆保持了完整的来自供体细胞系的染色体3，然而根据来自供体细胞系的染色体3等位基因的缺失，低活性的克隆似乎已没有了完整的染色体。后者的克隆很可能保持了含有可选择标记基因的供体染色体的小区域，这些标记基因使得这些克隆能够在含有潮霉素的培养基中存活。这些数据表明正常的人染色体3能对在多种硫酸酯酶缺乏症患者细胞系中所观察到的缺陷进行补充。为确定含有对于补充活性起着作用的基因的特异染色体区域，我们应用被发现已丢失染色体的多个部分的neo-标记的染色体3杂交体。此外，我们进行了hytk-标记的人染色体3的经辐射微细胞介导的染色体转移。通过使用一组31个跨越整个染色体的多态性微卫星标记，对115个染色体3被辐射的杂交体进行硫酸酯酶活性测试和基因型的确定。显示高酶活性的所有克隆似乎已保存了染色体3p26。应用来自此区域的另外标记的更高分辨率的分析绘制出了在标记d3s3630和d3s2397之间的补充基因的推定位置。多种硫酸酯酶缺乏症中突变的基因的鉴别我们研究了来自涉及多种硫酸酯酶缺乏症患者中的突变的3p26基因组区域的基因。每一包括拼接接点的外显子进行pcr扩增，和通过直接测序进行分析。突变分析在12位不相关的被影响的个体中完成；5位是前述的msd患者，而7位是未发表的病例。从我们的多种硫酸酯酶缺乏症群体中，在已表达序列标志(est)ak075459(seqidnos:4,5)中鉴定了数个突变，该已表达序列标志对应于未知功能的基因，这强烈暗示了这是涉及多种硫酸酯酶缺乏症的基因。发现每一个突变在100个对照个体中不存在，因此排除了序列多态性的存在。另外的确证性突变分析是对于反转录的患者rna来进行的，特别是在基因组dna分析显示突变存在于拼接位点或其附近而有可能影响拼接的那些情况下。移码、无义、拼接和错义突变也被鉴别，暗示此病由于功能机制的丧失而引起，正如对隐性疾病所预言的。这也与以下的观察相一致，即几乎所有的错义突变影响在整个进化中高度保守的氨基酸(参见下面)。表8:另外的被鉴别的多种硫酸酯酶缺乏症突变在每一位被测试的多种硫酸酯酶缺乏症患者中鉴定突变，因此排除了座位点异质性。在所鉴定的突变的类型和患者中所报道的表型的严重程度之间没有观察到明显的相关性，暗示临床上的可变性不是由等位基因异质性引起的。在三种情况下，发现不同患者(表6中的病例1和4,病例6和9,和病例11和12)携带相同突变。这些患者中的两位(病例11和12)来自sicily中的同一城镇，这暗示单元型分析(haplotypeanalysis)所真正确证的建立者效应的存在。令人惊讶的是，发现大多数患者是双重杂合子，携带不同的等位突变，而只有一小部分是纯合子。虽然与父母所报告的不存在近亲关系相一致，但这是关于非常罕见的隐性疾病例如多种硫酸酯酶缺乏症的无法预料的发现。fge基因和蛋白质人fge(也在本文中可互换性地用作sumf1)cdna(seqidno:1)的共有cdna序列组装自数个已表达序列标志(est)克隆，并部分组装自对应的基因组序列。此基因包含9个外显子，并跨越大约105kb(参见实施例1)。序列比较也鉴别了位于人染色体7上的fge基因平行进化同源物的存在，我们将其指定为fge2(也在本文中可互换性地用作sumf2)(seqidnos:45,46)。硫酸酯酶缺乏的功能补充来自两位多种硫酸酯酶缺乏症患者(表8中的病例1和12，在他们中我们鉴别了fge(sumf1)基因的突变(细胞系ba426和ba920))的成纤维细胞用含有fge(sumf1)cdna的野生型和两个突变形式(r327x和△ex3)的hsv病毒感染。arsa、arsb和arsc活性在感染后72小时进行测试。野生型fge(sumf1)cdna的表达导致全部三种活性的功能补充，而突变体fge(sumf1)cdna则没有(表9)。这些数据提供了对鉴别fge(sumf1)作为多种硫酸酯酶缺乏症基因的决定性的证据，且它们证明了患者中发现的突变的相关性。疾病相关的突变引起硫酸酯酶缺乏，因此证明fge(sumf1)是硫酸酯酶活性的必需因素。表9:硫酸酯酶缺乏的功能补充(1)所有酶活性均以释放的4-甲基伞形酮的nmole数.mg蛋白质-1.3hrs表示多种硫酸酯酶缺乏症细胞系ba426和ba920单独用hsv扩增子感染，和用携带突变体或野生型sumf1cdna的的构建体感染。在用野生型sumf1基因感染的成纤维细胞中的单一的芳基硫酸酯酶活性，相对于只用载体感染的细胞的活性的增加在括号中指出。标明了在未感染的对照成纤维细胞中测得的活性。多种硫酸酯酶缺乏症的分子基础基于这样的假设即疾病基因应能补偿患者细胞系中的酶缺乏，我们完成了微细胞介导的染色体转移，转移到来自多种硫酸酯酶缺乏症患者的永生化的细胞系。此技术已成功用于其预期功能能在细胞系中评估(例如通过测量酶活性或通过探测形态学特征)的基因的鉴别。为说明酶活性随机变化性的问题，我们在互补分析中测量了三种不同硫酸酯酶(arsa,arsb和arsc)的活性。染色体转移的结果清晰地指明了补充性基因在染色体3上的位置。亚区域的图谱绘制通过产生染色体3的放射杂合组而实现。单独的杂交体克隆同时在基因组水平(通过在供体和受体细胞系之间显示不同等位基因的31个微卫星标记的分型)和功能水平(通过测试硫酸酯酶活性)被表征。对130个这类杂交体的分析导致对染色体3p26补充区域的图谱绘制。一旦关键的基因组区域被确定，fge(sumf1)基因也通过患者dna中的突变分析而鉴别。突变在所有测试患者中被发现，显示出单一基因涉及多种硫酸酯酶缺乏症。所发现的突变是不同的类型，其中的主要部分(例如拼接位点,起始位点,无义,移码)估计会导致所编码蛋白质的功能丧失，如对隐性疾病所预计的。大多数错义突变影响对应于进化过程中高度保守的氨基酸的密码子，暗示这些突变也导致功能的丧失。在突变类型和表现型的严重程度之间没有相关性，表明后者是由于不相关的因素造成的。对于罕见的遗传疾病出乎意料的是，许多患者被发现是杂合子，携带两种不同的突变。然而，对源自sicily中的一个小城镇的一个突变的奠基者效应被鉴别。fge(sumf1)基因功能对fge(sumf1)基因作为“互补因子”的鉴别，通过插入病毒载体中的外源性fge(sumf1)cdna在两种不同患者细胞系的表达挽救了四种不同硫酸酯酶的酶性缺乏这一点而肯定地被证明。在每一病例中，所有硫酸酯酶活性的一致的和部分的(相对于以空载体转染的对照患者细胞系的)恢复被观察到。平均地，酶活性的增加范围在1.7到4.9倍之间，达到在正常细胞系中所观察到的大约一半的水平。酶活性与在每一实验中所用的病毒颗粒的数目相关，也与(通过标记蛋白质(gfp)分析所测试的)感染效率相关。在相同实验中，含有携带在患者中发现的两种突变(r327x和△ex3)的fge(sumf1)cdna的载体被应用，而没有显著的酶活性增加被观察到，因此证明这些突变的功能相关性。如本文中其它部分所提到的，schmidt等首先发现硫酸酯酶经历高度保守的半胱氨酸到cα-甲酰甘氨酸的翻译后修饰，其被发现位于大多数硫酸酯酶的活性位点。它们也显示出，此修饰在多种硫酸酯酶缺乏症中有缺陷(schmidt,b.等,cell,1995,82:271-278)。我们的突变性和功能性的数据为以下这点提供了有力的证据，即fge(sumf1)对此修饰负责。fge(sumf1)基因在所有被分析的远距离相关物种(从细菌到人)中显示非常高程度的序列保守性。我们提供了证据，即人fge(umf1)基因的果蝇同源物能激活过表达的人硫酸酯酶，证明所观察的远距离相关物种的fge(sumf1)基因的高水平的序列类似性与惊人的功能保守性相关。值得注意的例外是酵母，其似乎缺失了fge(sumf1)基因以及任何的硫酸酯酶编码基因，说明硫酸酯酶功能不为此生物所需，也暗示对fge(sumf1)和硫酸酯酶基因的进化的互惠性影响的存在。有趣的是，在所有被分析的脊椎动物包括人的基因组中存在两个同源性的基因fge(sumf1)和fge2(sumf2)。如系统发生树上明显的，fge2(sumf2)基因似乎已独立地从fge(sumf1)基因进化。在我们的分析中，fge2(sumf2)基因也能激活硫酸酯酶，然而它以相对于fge(sumf1)基因效率低很多的方式完成。这可解释在多种硫酸酯酶缺乏症患者中发现的残余硫酸酯酶活性，并暗示完全的硫酸酯酶缺乏将是致命的。此时，我们不能排除fge2(sumf2)基因具有另外而仍然未知的功能的可能性。在因硫酸酯酶缺乏导致的疾病的治疗方面的影响相对于只过表达单一硫酸酯酶的细胞，硫酸酯酶活性的强增长(高至50倍)在fge(sumf1)cdna与arsa,arsc或者arsecdnas一起过表达的细胞中被观察到。在所有细胞系中，显著的协同效应被发现，表明fge(sumf1)是硫酸酯酶活性的限制性因子。然而，可变性在不同硫酸酯酶中被观察到，可能是由于fge(sumf1)-编码蛋白质与多种硫酸酯酶的不同亲和性。可变性也在可能具有内源性甲酰甘氨酸生成酶的不同水平的不同细胞系之间观察到。与这些观察相一致，我们发现多种硫酸酯酶缺乏症基因的表达在不同组织间变化，在肾和肝中具有显著的高水平。这可具有重要的意义，因为具有fge(sumf1)基因低表达水平的组织不太能够有效修饰外源性递送的硫酸酯酶蛋白质(参见下面)。这些数据合在一起暗示着fge(sumf1)基因的功能已进化到实现双重调节系统，每一硫酸酯酶被两个机制同时控制，一个是负责每一结构性硫酸酯酶基因的mrna水平的单独机制，一个是所有硫酸酯酶共享的普遍机制。此外，fge2(sumf2)提供了对硫酸酯酶修饰的部分冗余。这些数据对将在酶替换治疗中应用的活性硫酸酯酶的大量生产具有深远的意义。酶替换研究已在硫酸酯酶缺乏的动物模型上报道，例如，粘多糖病vi的猫科动物模型，并被证明是在防止和治愈数个症状中有效。针对两种源于硫酸酯酶缺乏的先天疾病mpsii(hunter综合症)和mpsvi(maroteaux-lamy综合症)的人的治疗性试验目前正在进行，并将很快扩展到大量的患者。实施例5:以fge-激活的galns对morquio病mpsiva的酶替换疗法morquio患者中主要的骨病理学原因是硫酸角质素(ks)在骺盘(生长平板)软骨细胞中因缺乏溶酶体硫酸酯酶(galns)而积累。体内研究的基本目标是确定是否静脉内(iv)施用的fge-激活的galns能渗透生长平板的软骨细胞以及其它正常小鼠中的合适的细胞类型。尽管一般缺乏骨畸形，galns缺乏的小鼠模型(morquioknock-in-mki,s.tomatsu,st.louisuniversity,mo)也被用于证明重复施用的fge-激活的galns的体内生化活性。小鼠模型中的骨病理的缺乏反映了这样的事实，即骨ks在啮齿动物中或剧烈减少或者缺乏(venng,&masonrm.,biochemj.,1985,228:443-450)。然而，这些小鼠的确显示了gag和其它细胞异常在多种器官和组织中的可探测的积累。因此，研究的总体目标是证明fge-激活的galns渗透进了生长平板(生物分布研究)和显示涉及积累的gag在受影响组织中的清除的功能性galns酶活性(药物动力学研究)。这些研究的结果证明iv注射的fge-激活的galns被生长平板的软骨细胞内化，虽然相对于其它组织是相对较低的水平。此外,fge-激活的galns在mki小鼠中持续16周的注射有效清除了积累的gag，也减少了在所有被检测的软组织中溶酶体生物标记染色。总之，实验成功证明了galns到生长平板软骨细胞的转运，也证明了关于gag在多种组织中的清除方面的生化活性。生物分布研究四周大的icr(正常)小鼠被给予单次5mg/kgfge-激活的galns的iv注射。肝,股骨,心脏,肾和脾在注射后两小时被收集，并为组织学检测作准备。抗-人galns的单克隆抗体被用于探测注射的galns在多种组织中的存在。与载体对照相比，galns在所有被检测的组织中被探测。此外，应用辣根过氧化物酶报告系统，galns很容易地在所有被检测的组织中被观察到，但骨例外。对galns在生长平板中吸收的证明需要更灵敏的荧光素-异硫氰酸酯(fitc)报告系统的应用，说明了虽然galns渗透进生长平板，但相对于软组织的细胞，它不那么容易渗透至生长平板软骨细胞。尽管需要更灵敏的荧光探测方法，与载体对照相比，galns到骨生长平板软骨细胞的转运在所有被检测的生长平板切片中被观察到。mki小鼠中的药物动力学研究四周大的mki或野生型小鼠每周性地被给予iv注射(每组n＝8)直到20周龄。每一次每周性的注射由2mg/kgfge-激活的galns或者载体对照(对野生型小鼠没有注射)所组成。所有小鼠在20周龄时被杀死用于组织学检测，并用下面的方法染色：苏木精和曙红用于细胞形态学，爱茜蓝用于gag的探测。积累的gag的清除通过在所有被检测的软组织(肝、心脏、肾和脾)中减少的或缺乏的爱茜蓝染色而证明。这只在galns注射的小鼠中被观察到，虽然mki小鼠中的生长平板如正常骨形态学所证实的是正常发挥功能，但存在被观察到的更细微的细胞异常(包括没有明显病理效应的软骨细胞空泡化)。生长平板肥大和增生区域的空泡化的软骨细胞没有受galns施用影响。这与生长平板的钙化区中的软骨细胞相反，在那种情形中，空泡化的减弱在galns注射的小鼠中被观察到。一般地，由于已知的ks在小鼠的生长平板中的缺乏，软骨细胞的空泡化和推测的非-ksgag在mki小鼠的生长平板中的积累是令人惊讶和出乎意料的。这些特别的观察结果很可能反映了这样的事实，即在敲入(knock-in)小鼠中，存在突变体galns的高水平(与敲除小鼠相反，其中不存在残余的突变体galns，不存在生长平板软骨细胞空泡化，也不存在gag积累——tomatsus.等,humanmoleculargenetics,2003,12:3349-3358)。生长平板中的空泡化现象也许表明对表达突变体galns的细胞的亚类的第二效应。但是，持续16周的酶注射有力证明了多种组织的fge-激活的galns运送和体内酶活性的事实。附图详述图1:p23在来自牛睾丸微粒体的可溶性抽提物缺乏(a)或存在(b)条件下培育后的maldi-tof质谱6pmol的p23在标准条件下37℃培育10分钟，其中缺乏或存在1μl的微粒体抽提物。按实验程序所述为maldi-tof质谱制备样本。p23(2526.28)和其fgly衍生物(2508.29)的单种同位素质量mh+被指出。图2:源自人fge和pfam-duf323种子的21种蛋白质的比对的系统发生树分支处的数目指出了系统发生距离。蛋白质通过它们的tremblid数目和物种名称被指定。hfge-人fge。右上部：系统发生距离的标尺。星号表示基因已进一步地被研究。顶部的7种基因是fge基因家族的部分。图3:人和鼠fge基因位点的组织外显子被显示成以暗盒(人位点)和亮盒(鼠位点)来按比例表示。右下方角落的横杆显示标尺。外显子之间的线显示内含子(没有按比例)。内含子线上的数字表示以kb表示的内含子的大小。图4:显示fge表达质粒pxmg.1.3图谱的图图5:描述在以fge表达质粒瞬时转染的36f细胞中的n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶活性的柱状图在不含氨甲蝶呤(mtx)的培养基中以带有反向的fgecdna的对照质粒pxmg.1.2,或者fge表达质粒pxmg.1.3转染细胞。24小时后，细胞被含有1.0μmmtx的培养基再培养。再培养24,48和72小时后，采集培养基并收集细胞。n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶活性通过活性分析被测定。显示的每一值是两次分别转染的平均值，标准方差以误差标尺指出。图6:描述在以fge表达质粒瞬时转染的36f细胞中的n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶比活性的柱状图在不含氨甲蝶呤(mtx)的培养基中以带有反向的fgecdna的对照质粒pxmg.1.2,或者fge表达质粒pxmg.1.3转染细胞。24小时后，细胞被含有1.0μmmtx的培养基再培养。再培养24,48和72小时后，采集培养基并收集细胞。n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶比活性通过活性分析和elisa被测定，并以n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶活性/每毫克elisa-反应性的n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶的比率表示。每个显示的值是两次分别转染的平均值。图7:描述在以fge表达质粒瞬时转染的36f细胞中的n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶的产生的柱状图在不含氨甲蝶呤(mtx)的培养基中以带有反向的fgecdna的对照质粒pxmg.1.2,或者fge表达质粒pxmg.1.3转染细胞。24小时后，细胞被含有1.0μmmtx的培养基再培养。再培养24,48和72小时后，采集培养基并收集细胞。n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶总蛋白通过elisa测定。显示的每一值是两次分别转染的平均值，标准方差以误差标尺指出。图8:描述在以fge表达质粒瞬时转染的30c6细胞中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性在不含氨甲蝶呤(mtx)的培养基中以带有反向的fgecdna的对照质粒pxmg.1.2,或者fge表达质粒pxmg.1.3转染细胞。24小时后，细胞被含有1.0μmmtx的培养基再培养。再培养24,48和72小时后，采集培养基并收集细胞。艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性通过活性分析测定。显示的每一值是两次分别转染的平均值。图9:描述体现本发明特征的试剂盒本文中公开的所有参考文献都以全文被整合而作为参考。权利要求出现在下面，并在其后给出序列表。本发明包括下述各项内容：1.分离的核酸分子，选自：(a)核酸分子，其在严格条件下与由seqidno:1所示的核苷酸序列组成的分子杂交，且其编码具有cα-甲酰甘氨酸产生活性(fge)的多肽，(b)核酸分子，其由于遗传密码的简并性而在在密码子序列中不同于(a)的核酸分子，和(c)(a)或(b)的互补序列。2.项目1的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子包含seqidno:1所示的核苷酸序列。3.项目1的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子由seqidno:3所示的核苷酸序列或其片段组成。4.分离的核酸分子，选自：(a)seqidno:1所示的核苷酸序列的独特片段，和(b)(a)的互补序列。5.项目4的分离的核酸分子，其中所述独特片段具有的大小选自至少：8个核苷酸,10个核苷酸,12个核苷酸,14个核苷酸,16个核苷酸,18个核苷酸,20个核苷酸,22个核苷酸,24个核苷酸,26个核苷酸,28个核苷酸,30个核苷酸,50个核苷酸,75个核苷酸,100个核苷酸,和200个核苷酸。6.项目4的分离的核酸分子，其中所述分子编码免疫原性的多肽。7.表达载体，包含可操作性地连接启动子的项目1,2,3,4,5或6的分离的核酸分子。8.表达载体，包含可操作性地连接启动子的项目4的分离的核酸分子。9.被项目7的表达载体所转化或转染的宿主细胞。10.被项目8的表达载体所转化或转染的宿主细胞。11.分离的多肽，其由项目1,2,3或4的核酸分子所编码，其中所述多肽或其片段具有cα-甲酰甘氨酸生成活性。12.项目11的分离的多肽，其中所述多肽由项目2的核酸分子编码。13.项目12的分离的多肽，其中所述多肽包含具有seqidno:2的氨基酸1-374序列的多肽。14.分离的多肽，由项目1,2,3或4的核酸分子编码，其中所述多肽或其片段具有免疫原性。15.项目14的分离的多肽，其中所述多肽的所述片段或所述片段的部分结合人类抗体。16.分离的结合多肽，其选择性地结合由项目1,2,3或4的分离的核酸分子所编码的多肽。17.项目16的分离的结合多肽，其中所述分离的结合多肽结合具有seqidno:2的氨基酸序列的多肽。18.项目17的分离的结合多肽，其中所述分离的结合多肽是抗体或选自fab片段,f(ab)2片段或包括cdr3区域的片段的抗体片段。19.分离的具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽的家族，每一所述多肽从氨基端到羧基端包含：(a)氨基端亚结构域1；(b)包含120到140个氨基酸的含有至少8个色氨酸的亚结构域2；(c)包含35到45个氨基酸的羧基端亚结构域3；其中所述亚结构域2与选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76和78的多肽的亚结构域2具有至少约50％的同源性；和其中亚结构域3与选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76和78的多肽的亚结构域3具有至少约75％的同源性和大致相等的长度。20.项目19的多肽,其中每一所述多肽的亚结构域3与选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76和78的多肽的亚结构域3具有至少约80％－约100％的同源性。21.在受试者中测定fge表达水平的方法，包含在来自所述受试者的测试样本中测量fge的表达以确定fge在受试者中表达的水平。22.项目21的方法，其中在测试样本中测得的fge表达与含有已知水平的表达的对照中的fge表达进行比较。23.项目21的方法，其中fge的表达是fgemrna表达。24.项目21的方法，其中fge的表达是fge多肽的表达。25.项目21的方法，其中测试样本是组织。26.项目21的方法，其中测试样本是生物液体。27.项目23的方法，其中fgemrna表达应用pcr测量。28.项目23的方法，其中fgemrna表达应用rna印迹测量。29.项目24的方法，其中fge多肽表达应用针对fge的单克隆抗体测量。30.项目24的方法，其中fge多肽表达应用针对fge的多克隆抗血清测量。31.项目24的方法，其中fge多肽表达应用cα-甲酰甘氨酸生成活性测量。32.鉴别可用于调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的物质的方法，包含：(a)将具有cα-甲酰甘氨酸生成活性的分子与候选物质接触,(b)测量所述分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性，和(c)将测得的所述分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性与对照比较以确定候选物质是否调节所述分子的cα-甲酰甘氨酸生成活性，其中所述分子是具有seqidno:1所示的核苷酸序列的核酸分子或其表达产物。33.在受试者中诊断多种硫酸酯酶缺乏症的方法，所述方法包含：(a)将来自被怀疑患有多种硫酸酯酶缺乏症的受试者的生物样本与试剂接触，所述试剂特异性结合选自下列的分子：(i)具有seqidno:1所示核苷酸序列的核酸分子，(ii)(i)的核酸分子的表达产物，或(iii)(ii)的表达产物的片段；和b)测量所结合的试剂的量，并由此而确定所述核酸分子或其表达产物的表达是否异常，异常表达表明受试者患有多种硫酸酯酶缺乏症。34.对以核酸分子或其表达产物的异常表达为特征的病症进行诊断的方法，所述方法包含：a)将来自受试者的生物样本与试剂接触，其中所述试剂特异结合所述核酸分子、其表达产物或其表达产物的片段；和b)测量结合的试剂数量并由此确定所述核酸分子或其表达产物的表达是否异常，异常表达表明患有所述病症；其中所述核酸分子具有seqidno:1所示的核苷酸序列，而所述病症是多种硫酸酯酶缺乏症。35.在受试者中确定特征为核酸分子或其表达产物的异常表达的多种硫酸酯酶缺乏症的方法，包含：对来自患者的样本监测选自下面的参数，作为对受试者中的多种硫酸酯酶缺乏症的测定：(i)具有seqidno:1所示核苷酸序列的核酸分子，(ii)所述核酸分子编码的多肽,(iii)来源于所述多肽的肽,和(iv)选择性结合所述多肽或肽的抗体。36.项目35的方法，其中所述样本是生物液体或组织。37.项目35的方法，其中监测步骤包含将样本与选自下面的可检测的试剂接触：(a)在严格条件下与(i)的核酸分子选择性杂交的分离的核酸分子,(b)与(ii)的多肽或(iii)的肽选择性结合的抗体，和(c)与(iv)中的抗体结合的多肽或肽。38.项目37的方法，其中所述抗体、多肽、肽或核酸用放射性标记或酶进行标记。39.项目35的方法，包含检测样本中的所述肽。40.包含包装的试剂盒，所述包装包含：选择性结合项目1的分离的核酸或其表达产物的试剂，和对照，其用于与所述试剂和项目1的分离的核酸或其表达产物的结合的测量值进行比较。41.项目40的试剂盒，其中所述对照是用于与测量值比较的预定值。42.项目40的试剂盒，其中所述对照包含项目1的核酸的表达产物的表位。43.项目40的试剂盒，进一步包含选择性结合选自下面的多肽或其肽的第二试剂：艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,和hsulf-6,和对照，用于与所述第二试剂和所述多肽或其肽结合的测量值进行比较。44.在受试者中治疗多种硫酸酯酶缺乏症的方法，包含：对需要这种治疗的受试者施用调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为在受试者中治疗多种硫酸酯酶缺乏症的有效量。45.项目44的方法，进一步包含共施用选自下列的试剂：编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5,或hsulf-6的核酸分子，所述核酸分子的表达产物，和所述核酸分子的表达产物的片段。46.项目44的方法，其中调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是项目1-8中的核酸分子或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸。47.项目44的方法，其中调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是项目11-15,19,20中的肽或具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽。48.项目44的方法，其中调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是由表达项目1-8中的fge核酸分子或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的fge核酸分子的细胞产生。49.项目48的方法，其中表达fge核酸分子的细胞表达外源fge核酸分子。50.项目48的方法，其中表达fge核酸分子的细胞表达内源fge核酸分子。51.在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法，包含：对受试者施用本发明的分离的fge核酸分子或其表达产物，用量为在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。52.治疗患多种硫酸酯酶缺乏症的受试者的方法，包含：对需要这种治疗的受试者施用调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为在受试者中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。53.项目52的方法，其中调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是项目1-8中的有义核酸或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的fge核酸分子。54.项目52的方法，其中调节cα-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是项目11-15,19,20中的分离的多肽或具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,和78的序列的肽。55.在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法，包含：将细胞与项目1的分离的核酸分子或其表达产物接触，所述核酸分子或其表达产物的用量为在细胞中增加cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。56.药物组合物，包含：包含治疗多种硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的项目1-8中任一项的分离的核酸分子，具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的fge核酸分子，或其表达产物的试剂，和药学上可接受的载体。57.鉴别可用于治疗多种硫酸酯酶缺乏症的候选物质的方法，包含：测定一套核酸分子在细胞或组织中的表达，条件为在候选物质缺乏时允许该套核酸分子的最初量表达，其中该套核酸分子包含至少一种选自下面的核酸分子：(a)核酸分子，其在严格条件下与由seqidno:1所示核苷酸序列组成的分子杂交，并编码具有cα-甲酰甘氨酸生成活性(fge)的多肽，(b)由于遗传密码的简并性，在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子，(c)具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,和80-87的序列的核酸分子，和(d)(a)或(b)或(c)的互补序列，将细胞或组织与候选物质接触，并检测该套核酸分子表达的测试量，其中在候选物质存在的条件下表达的测试量相对于表达最初量的增加表明候选物质可用于治疗多种硫酸酯酶缺乏症。58.固相核酸分子阵列，其基本上由固定于固体基质的一套核酸分子、其表达产物或其片段组成，每一核酸分子编码选自下面的多肽：seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76和78,艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5和hsulf-6。59.项目58的固相核酸分子阵列，进一步包含至少一种对照核酸分子。60.项目58的固相核酸分子阵列，其中该套核酸分子包含至少一种编码选自下列的多肽的核酸分子：seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76和78,艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5和hsulf-6。61.项目58的固相核酸分子阵列，其中该套核酸分子包含至少两种核酸分子，每一核酸分子编码选自下列的多肽：seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76和78,艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5和hsulf-6。62.在细胞中增加硫酸酯酶活性的方法，包含：将表达硫酸酯酶的细胞与足以在所述细胞中增加硫酸酯酶活性的有效量的项目1-8中的分离的核酸分子、或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77和80-87的序列的核酸分子或其表达产物接触。63.项目62的方法，其中细胞表达内源硫酸酯酶。64.项目62的方法，其中细胞表达外源硫酸酯酶。65.项目63的方法，其中内源硫酸酯酶是被激活的。66.根据项目62-66中任一项的方法，其中硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5和hsulf-6。67.项目62的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。68.药物组合物，包含：治疗硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的细胞产生的硫酸酯酶，和药学上可接受的载体，其中所述细胞已与包含项目1-8中的分离的核酸分子,或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77和80-87的序列的核酸分子，或其表达产物的试剂接触。69.人fge基因的分离的变体等位基因，其编码变体fge多肽，包含：在seqidno:2含有至少一种变异的氨基酸序列，其中所述至少一种变异包括：met1arg；met1val；ser155pro；cys218tyr；ala279val；arg327stop；cys336arg；arg345cys；arg349trp；arg349trp；arg349gln；ser359stop；或其组合。70.分离的变体人fge多肽，包含：在seqidno:2包含至少一种变异的氨基酸序列，其中所述至少一种变异包含：met1arg；met1val；ser155pro；cys218tyr；ala279val；arg327stop；cys336arg；arg345cys；arg349trp；arg349trp；arg349gln；ser359stop；或其组合。71.抗体，其以项目69的变体人fge多肽作为免疫原。72.项目71的抗体，其是多克隆抗体。73.项目71的抗体，其是单克隆抗体。74.项目71的抗体，其是嵌合抗体。75.项目71的抗体，其可检测性地被标记。76.项目75的抗体，其中所述可探测性的标记包含放射性元素，荧光化学物或酶。77.产生硫酸酯酶的细胞，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率得到增加，细胞包含：(i)表达增强的硫酸酯酶，和(ii)表达增强的甲酰甘氨酸生成酶，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少5％。78.项目77的方法，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少10％。79.项目77的方法，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少20％。80.项目77的方法，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少50％。81.项目77的方法，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少100％。82.用硫酸酯酶治疗硫酸酯酶缺乏症的方法，所述方法通过对需要这种治疗的受试者施用硫酸酯酶以治疗硫酸酯酶缺乏症而完成，改进包含对受试者施用足以增加硫酸酯酶比活性的有效量的与甲酰甘氨酸生成酶接触的硫酸酯酶。83.项目82的方法，其中硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,硫酸胺酶,n-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶,n-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶,芳基硫酸酯酶a,芳基硫酸酯酶b,芳基硫酸酯酶c,芳基硫酸酯酶d,芳基硫酸酯酶e,芳基硫酸酯酶f,芳基硫酸酯酶g,hsulf-1,hsulf-2,hsulf-3,hsulf-4,hsulf-5和hsulf-6。84.项目82的方法，其中甲酰甘氨酸生成酶被项目1-8中的核酸分子，或具有选自seqidno:1,3,4,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77和80-87的序列的核酸所编码。85.项目82的方法，其中甲酰甘氨酸生成酶是项目11-15,19,20中的肽，或具有选自seqidno.2,5,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76和78的序列的肽。序列表<110>夏尔人类遗传性治疗公司k·冯菲古拉b·施密特t·蒂尔克斯m·w·希尔特莱恩m·p·考斯玛a·巴拉比奥<120>使用甲酰-甘氨酸生成酶（fge）对多种硫酸酶缺乏症和其它病症进行诊断和治疗<130>023236-8008cn03<150>us60/447,747<151>2003-02-11<160>95<170>patentinversion3.2<210>1<211>1180<212>dna<213>智人<220><221>cds<222>(20)..(1141)<223>fgecdna<400>1acatggcccgcgggacaacatggctgcgcccgcactagggctggtgtgtgga52metalaalaproalaleuglyleuvalcysgly1510cgttgccctgagctgggtctcgtcctcttgctgctgctgctctcgctg100argcysprogluleuglyleuvalleuleuleuleuleuleuserleu152025ctgtgtggagcggcagggagccaggaggccgggaccggtgcgggcgcg148leucysglyalaalaglyserglnglualaglythrglyalaglyala303540gggtcccttgcgggttcttgcggctgcggcacgccccagcggcctggc196glyserleualaglysercysglycysglythrproglnargprogly455055gcccatggcagttcggcagccgctcaccgatactcgcgggaggctaac244alahisglyserseralaalaalahisargtyrserargglualaasn60657075gctccgggccccgtacccggagagcggcaactcgcgcactcaaagatg292alaproglyprovalproglygluargglnleualahisserlysmet808590gtccccatccctgctggagtatttacaatgggcacagatgatcctcag340valproileproalaglyvalphethrmetglythraspaspprogln95100105ataaagcaggatggggaagcacctgcgaggagagttactattgatgcc388ilelysglnaspglyglualaproalaargargvalthrileaspala110115120ttttacatggatgcctatgaagtcagtaatactgaatttgagaagttt436phetyrmetaspalatyrgluvalserasnthrglupheglulysphe125130135gtgaactcaactggctatttgacagaggctgagaagtttggcgactcc484valasnserthrglytyrleuthrglualaglulyspheglyaspser140145150155tttgtctttgaaggcatgttgagtgagcaagtgaagaccaatattcaa532phevalphegluglymetleusergluglnvallysthrasnilegln160165170caggcagttgcagctgctccctggtggttacctgtgaaaggcgctaac580glnalavalalaalaalaprotrptrpleuprovallysglyalaasn175180185tggagacacccagaagggcctgactctactattctgcacaggccggat628trparghisprogluglyproaspserthrileleuhisargproasp190195200catccagttctccatgtgtcctggaatgatgcggttgcctactgcact676hisprovalleuhisvalsertrpasnaspalavalalatyrcysthr205210215tgggcagggaagcggctgcccacggaagctgagtgggaatacagctgt724trpalaglylysargleuprothrglualaglutrpglutyrsercys220225230235cgaggaggcctgcataatagacttttcccctggggcaacaaactgcag772argglyglyleuhisasnargleupheprotrpglyasnlysleugln240245250cccaaaggccagcattatgccaacatttggcagggcgagtttccggtg820prolysglyglnhistyralaasniletrpglnglyglupheproval255260265accaacactggtgaggatggcttccaaggaactgcgcctgttgatgcc868thrasnthrglygluaspglypheglnglythralaprovalaspala270275280ttccctcccaatggttatggcttatacaacatagtggggaacgcatgg916pheproproasnglytyrglyleutyrasnilevalglyasnalatrp285290295gaatggacttcagactggtggactgttcatcattctgttgaagaaacg964glutrpthrserasptrptrpthrvalhishisservalglugluthr300305310315cttaacccaaaaggtcccccttctgggaaagaccgagtgaagaaaggt1012leuasnprolysglyproproserglylysaspargvallyslysgly320325330ggatcctacatgtgccataggtcttattgttacaggtatcgctgtgct1060glysertyrmetcyshisargsertyrcystyrargtyrargcysala335340345gctcggagccagaacacacctgatagctctgcttcgaatctgggattc1108alaargserglnasnthrproaspserseralaserasnleuglyphe350355360cgctgtgcagccgaccgcctgcccaccatggactgacaaccaagggtagtctt1161argcysalaalaaspargleuprothrmetasp365370ccccagtccaaggagcagt1180<210>2<211>374<212>prt<213>智人<400>2metalaalaproalaleuglyleuvalcysglyargcysprogluleu151015glyleuvalleuleuleuleuleuleuserleuleucysglyalaala202530glyserglnglualaglythrglyalaglyalaglyserleualagly354045sercysglycysglythrproglnargproglyalahisglyserser505560alaalaalahisargtyrserargglualaasnalaproglyproval65707580proglygluargglnleualahisserlysmetvalproileproala859095glyvalphethrmetglythraspaspproglnilelysglnaspgly100105110glualaproalaargargvalthrileaspalaphetyrmetaspala115120125tyrgluvalserasnthrglupheglulysphevalasnserthrgly130135140tyrleuthrglualaglulyspheglyaspserphevalpheglugly145150155160metleusergluglnvallysthrasnileglnglnalavalalaala165170175alaprotrptrpleuprovallysglyalaasntrparghisproglu180185190glyproaspserthrileleuhisargproasphisprovalleuhis195200205valsertrpasnaspalavalalatyrcysthrtrpalaglylysarg210215220leuprothrglualaglutrpglutyrsercysargglyglyleuhis225230235240asnargleupheprotrpglyasnlysleuglnprolysglyglnhis245250255tyralaasniletrpglnglyglupheprovalthrasnthrglyglu260265270aspglypheglnglythralaprovalaspalapheproproasngly275280285tyrglyleutyrasnilevalglyasnalatrpglutrpthrserasp290295300trptrpthrvalhishisservalglugluthrleuasnprolysgly305310315320proproserglylysaspargvallyslysglyglysertyrmetcys325330335hisargsertyrcystyrargtyrargcysalaalaargserglnasn340345350thrproaspserseralaserasnleuglypheargcysalaalaasp355360365argleuprothrmetasp370<210>3<211>1122<212>dna<213>智人<400>3atggctgcgcccgcactagggctggtgtgtggacgttgccctgagctgggtctcgtcctc60ttgctgctgctgctctcgctgctgtgtggagcggcagggagccaggaggccgggaccggt120gcgggcgcggggtcccttgcgggttcttgcggctgcggcacgccccagcggcctggcgcc180catggcagttcggcagccgctcaccgatactcgcgggaggctaacgctccgggccccgta240cccggagagcggcaactcgcgcactcaaagatggtccccatccctgctggagtatttaca300atgggcacagatgatcctcagataaagcaggatggggaagcacctgcgaggagagttact360attgatgccttttacatggatgcctatgaagtcagtaatactgaatttgagaagtttgtg420aactcaactggctatttgacagaggctgagaagtttggcgactcctttgtctttgaaggc480atgttgagtgagcaagtgaagaccaatattcaacaggcagttgcagctgctccctggtgg540ttacctgtgaaaggcgctaactggagacacccagaagggcctgactctactattctgcac600aggccggatcatccagttctcc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