一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂的制作方法

本发明属于药物化工领域，更具体地说，它涉及一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂。

背景技术：

脂肪干细胞具有类似于骨髓干细胞的间充质干细胞特性，并且由于其来源较广，获取后对供区几乎没有太多的损伤，因此被认为是极具潜力的间充质干细胞来源。除了具有多分化能力外，目前的研究越来越关注其旁分泌能力，其无血清培养基中被发现具有血管内皮生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β等重要的生长因子，甚至有人认为其起作用的原因更多的来源于旁分泌的多种生长因子，而非细胞直接分化。再者，由于培养基中不含有细胞，因而其抗原性相对脂肪干细胞更小，其适用的人群也不仅仅局限于脂肪提供者本人。

但脂肪干细胞无血清培养基是液体，虽说具有生长因子但较难在创面局部聚集，造成较大的浪费。另外，培养基中的生长因子的量是一定的，如果需要加大生长因子的量就必须相应的提高使用培养基的容积，在临床应用上有很大的不便。因此需要提出一种新的技术方案来解决上述问题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，旨在通过冻干的方式，提纯脂肪干细胞中的生长因子成分，结合透明质酸钠，制作成凝胶状，使培养基中的生长因子成分在创面局部发挥作用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，包括如下操作步骤：

提取脂肪干细胞并培养传代；

传至至少3代时用消化液消化，终止消化后离心5-15分钟，以不含血清的培养基进行重悬后接种至培养皿中；

培养7天后收集培养基，经冻干方式得到的冻干提取物，其与透明质酸钠混合，获得脂肪干细胞无血清培养基冻干提取物—透明质酸钠凝胶。

通过采用上述技术方案，冻干方式是指将培养基内的含有脂肪干细胞的溶液，经冷冻的方式将溶液中的水分直接从液体变成固态，然后继续冷冻之后使得固态的水分直接升华挥发成气态后，此时在上述培养基内会形成多孔结构的有效成分，这类有效成分可以直接粉碎得到含有生长因子的冻干粉。因此通过冻干的方式，提纯脂肪干细胞中的生长因子成分，然后与透明质酸钠结合，此时生长因子可以混合在透明质酸钠中从而被制作成凝胶状，此时操作者可将其敷在创面局部，此时可使培养基中的生长因子成分在创面局部发挥作用，而不会因不能聚集而流散开来，提高了含有生长因子在创面局部的聚集度，有效了浪费，从而有效提高了对冻干制剂的综合利用率。

进一步的，所述消化液为胰酶溶液，消化温度控制在30-40℃。

进一步的，消化的最佳温度为37℃。

进一步的，胰酶溶液的制备方法为：称取025克胰蛋白酶(活力为1:250)，加入100ml无ca²⁺、mg²⁺的hank’s液或者edta溶液溶解，过滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。

进一步的，所述离心的条件采用1000-1500g的离心力离心3-20分钟。

进一步的，离心的条件采用1200g的离心力离心5-15分钟。

进一步的，所述不含血清的培养基采用如下一种：

加入有1％的青链霉素双抗的dmem培养基；

加入有1％的青链霉素双抗和10％的胎牛血清的dmem培养基；

dmem培养基。

通过采用上述技术方案，因为双抗毕竟属于抗生素，在人体使用的话可能产生不必要的问题。这里使用的培养基，有些文献中也叫做条件培养基，与完全培养基的区别是不含血清成分。胎牛血清作为牛的血液制品，多少会存在一些抗原性，可能存在过敏等情况，并不适用于临床，且血清中本身就存在有生长因子，对干细胞的生长因子分泌情况的评估会产生一定能程度的干扰。因此可根据需要选择上述三种中的任意一种进行试验，可以竟可能的减少干扰情况的出现，提高了检测和评估的准确性。

进一步的，所述透明质酸钠选自低分子非交联透明质酸钠。

通过采用上述技术方案，透明质酸钠是整形科常用的试剂，用于创面的话需要其保留一段时间，但这段时间又不能太长，因此选用非交联的低分子透明质酸钠，更容易吸收，并且可以协同促进创面周围组织的生长。

进一步的，所述透明质酸钠的配置浓度为3wt％，溶媒选自灭菌注射用水。

通过采用上述技术方案，配置浓度为3wt％是指每1ml液体中加入30mg透明质酸钠，使用时可以将冻干粉与对应量的透明质酸钠粉混合，用溶媒溶解后形成凝胶状，直接分装入注射器中。

进一步的，将多份培养基获取的冻干提取物进行混合，用生理盐水或pbs缓冲液对其溶解，形成含有脂肪干细胞分泌的生长因子的溶液，将所述含有脂肪干细胞分泌的生长因子的溶液与透明质酸钠混合，获得脂肪干细胞无血清培养基冻干提取物—透明质酸钠凝胶。

进一步的，所述冻干提取物粉碎后制得冻干粉，所述冻干粉与透明质酸钠混合，用溶媒溶解后形成脂肪干细胞无血清培养基冻干提取物—透明质酸钠凝胶。

进一步的，所述溶媒选自灭菌注射用水或者生理盐水。

通过采用上述技术方案，通过溶液方式进行混合，还是粉末状态下混合，均能达到良好的混合作用，上述两种方式制得的冻干制剂能够满足不同的市场需求，提高了冻干制剂剂型的多样性。

进一步的，所述冻干粉与透明质酸钠的比例为1:(2～8)。

本发明的一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂在创伤面的应用。

进一步的，冻干技术是对相关的液态有效成分(如细菌悬液)进行冷冻后，使用升华的方式将其中的水分去除，从而留下溶液中想要的有效成分。透明质酸钠溶液为胶体，具有一定的黏稠性，并且具有保湿补水的作用，其低分子量制剂即水光针的主要成分在面部美容中有充分的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过冻干的方式，提纯脂肪干细胞中的生长因子成分，结合透明质酸钠，制作成凝胶状，使培养基中的生长因子成分在创面局部发挥作用；

2、优化的，培养基内的含有生长因子的培养液可使用升华的方式将其中的水分去除，从而留下溶液中想要的有效成分；同时透明质酸钠溶液为胶体，具有一定的黏稠性，并且具有保湿补水的作用，其低分子量制剂即水光针的主要成分在面部美容中有充分的应用。

附图说明

图1为一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂中实施例1的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合各实施例对本发明作进一步详细说明。

一、实施例1-5

实施例1，一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，如图1所示，包括如下操作步骤:

步骤一、从志愿者脂肪中以经典酶消化法提取脂肪干细胞，其提取的方式参考公告号为cn104357387的中国发明专利一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法中实施例1中的步骤分离提取得到脂肪干细胞。具体操作如下：

步骤(一)、从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞：

(1)清洗：取15ml人脂肪组织，用生理盐水反复冲洗人脂肪组织三遍，以除去人脂肪组中的血液。

(2)胶原酶消化：将清洗后的人脂肪组织放入50ml的离心管中，然后向离心管中加入等体积量的ⅰ型胶原酶溶液，混匀。放入恒温振荡器中，在37℃下，以150r/min的离心速率消化1h。离心管内的液体分为三层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体。

(3)收集：吸出离心管中的下层液体，下层液体用网孔孔径为100μm的滤网过滤，得过滤液。向过滤液中加入生理盐水(30ml)，以1500r/min的速率离心10min，除去上层清液后，得到人的脂肪干细胞。

步骤(二)、细胞原代培养(p0代)：

向装有上述人脂肪干细胞的离心管加入5ml无血清培养基(即无血清的dmem培养基)，上述获得的无血清培养基是采用0.45微米的无菌滤膜过滤后得到的，其目的是为了去除细胞碎片和细菌，再向培养瓶中加入10ml无血清培养基，轻摇培养瓶以混匀瓶内液体。将培养瓶放入37℃，co2含量为5％的培养箱中进行培养。

第一次全量换液：细胞原代培养24小时后，将培养瓶从培养箱中取出，进行全量换液。即将旧的无血清培养基吸出，加入12ml新的无血清培养基，然后将培养瓶放回培养箱中继续进行培养。

第二次全量换液：继续培养第48小时后，将培养瓶从培养箱中取出，进行全量换液。即将旧无血清培养基吸出，加入12ml新的无血清培养基，然后将培养瓶放回培养箱中继续进行培养。

第三次全量换液：继续培养第5天后，将培养瓶从培养箱中取出，无血清培养基的颜色改变，呈浅黄色，进行全量换液。即将旧的无血清培养基吸出，加入12ml新的无血清培养基，然后将培养瓶放回培养箱中继续进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。

消化收获：轻轻晃动培养瓶，将旧的无血清培养基转移至50ml离心管中，用4-5ml氯化钠注射液轻轻冲洗培养瓶1-2遍，洗涤后的氯化钠注射液弃去。按照每75cm²加入2ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-edta的比例向培养瓶中加入浓度为0.25％的胰蛋白酶-edta(胰蛋白酶使用前放置在20-25℃下)，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶-edta流遍所有细胞表面，消化时间为2-2.5min(同时用倒置显微镜观察，观察到大部分细胞的形状由梭形变为圆形并脱落时完成消化)。然后向离心管中加入旧的无血清培养基以终止消化。用移液管反复吹打培养瓶的瓶底至大部分细胞从瓶壁脱落，然后将无血清培养基转移到50ml的离心管中，并向原培养瓶中加入4-5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，洗涤液并入离心管中。用移液管吹打悬浮细胞后，用网孔孔径为100μm的无菌滤网过滤，将过滤液收集到50ml的离心管中，离心洗涤(离心力设为210g，离心时间设为10min)。弃去离心管内的上层清液，然后再加入适量的氯化钠注射液，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用氯化钠注射液定容至30ml，再用移液管吹打混匀并进行二次离心(离心力设为210g，离心时间设为10min)。上层清液送检，检测上层清液是否有菌；下层为细胞沉淀。

步骤(三)、传代培养:

第一次传代培养：在上述装有细胞沉淀(p0代人脂肪干细胞)的离心管中加入适量的无血清培养基(10ml)，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用无血清培养基定容至30ml并接种到新的培养瓶中，细胞密度为5000-6000/cm²。将培养瓶放入37℃，co2含量为5％的培养箱中进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。

如上述步骤(二)中的消化收获操作，收获p1代人脂肪干细胞。

第二次传代培养：在上述装有细胞沉淀(p1代人脂肪干细胞)的离心管中加入适量的无血清培养基(10ml)，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用无血清培养基定容至30ml并接种到新的培养瓶中，细胞密度为5000-6000/cm²。将培养瓶放入37℃，co2含量为5％的培养箱中进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。

再如上述步骤(二)中的消化收获操作，收获p2代人脂肪干细胞，并且在进行二次离心(210g，10min)前，对已经过第一次离心并定容至30ml的细胞溶液进行过滤处理，用100μm的细胞过滤器将细胞和溶液滤至另一50ml的离心管中，再用移液管轻轻吹打离心管内的液体。至此，得到传代二次后的人脂肪干细胞。

第三次传代培养：在上述装有细胞沉淀(p2代人脂肪干细胞)的离心管中加入适量的无血清培养基(10ml)，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用无血清培养基定容至30ml并接种到新的培养瓶中，细胞密度为5000-6000/cm²。将培养瓶放入37℃，co2含量为5％的培养箱中进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。

步骤二、传至3代时，将上述第三次传代培养后得到培养基进行如步骤(二)中的消化收获操作，按照每75cm²加入2ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-edta的比例向上述第三次传代培养后的培养瓶中加入浓度为0.25％的胰蛋白酶-edta(胰蛋白酶使用前放置在20-25℃下)，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶-edta流遍所有细胞表面，消化时间为2-2.5min(同时用倒置显微镜观察，观察到大部分细胞的形状由梭形变为圆形并脱落时完成消化)。然后向离心管中加入旧的无血清培养基以终止消化。用移液管反复吹打培养瓶的瓶底至大部分细胞从瓶壁脱落，然后将无血清培养基转移到50ml的离心管中，并向原培养瓶中加入4-5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，洗涤液并入离心管中。用移液管吹打悬浮细胞后，用网孔孔径为100μm的无菌滤网过滤，将过滤液收集到50ml的离心管中，离心洗涤(离心力设为1200g，离心时间设为5min)。弃去离心管内的上层清液，然后再加入适量的氯化钠注射液，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用无血清培养基定容至30ml并接种到新的培养瓶中，细胞密度为5000-6000/cm²。将培养瓶放入37℃，co2含量为5％的培养箱中进行培养。

步骤三、培养7天后，收集步骤二中的培养基经冻干技术得到的冻干提取物，其具体的冻干方式为：

s1、培养7天后收集步骤二中的培养基，对培养基内的脂肪干细胞的混合物测定其共晶点数值，并登记，上述共晶点数值为4～5℃。

s2、培养7天后收集步骤二中得到的培养基(在冻干技术过程中，下面均简称培养基)装入真空冷冻干燥机(即冻干箱)内，把冻干箱的温度设置到培养基共晶点以下，此时控制冻干箱的温度为3～4℃。

s3、让冻干箱内的温度预先降至-1～0℃，然后将培养基装入冻干箱内保温冻干2小时进行预冷冻处理；

s4、在2～3℃，10～15pa的真空条件下进行升华干燥，至水分含量小于3％。培养基的的干燥进入解吸干燥阶段时，在20～25℃的解吸干燥温度下保持3～4小时，结束冻干。随后将冷冻后的培养基取出后经粉碎机粉碎，得到含有大量生长因子的冻干提取物；

步骤四、首先采用灭菌注射用水配置浓度为3wt％的透明质酸钠(每1ml灭菌注射用水中加入30mg透明质酸钠)。随后将步骤三得到的多份冻干提取物进行混合，用适量生理盐水对其完全溶液，形成含有脂肪干细胞分泌的生长因子的溶液。接着将含有脂肪干细胞分泌的生长因子的溶液与3wt％的低分子非交联透明质酸钠混合，两者的混合比例为1：5，获得脂肪干细胞无血清培养基冻干提取物—透明质酸钠凝胶。

本发明的一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，可在创伤面、面部美容方向进行应用。

实施例2：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：在步骤四中，将步骤三得到的多份冻干提取物进行混合，然后将其与低分子非交联透明质酸钠粉混合，两者的混合比例为1：2。接着用灭菌注射用水使其溶解后得到含有3wt％的透明质酸钠的凝胶，使用0.22um滤膜过滤，得到脂肪干细胞无血清培养基冻干提取物—透明质酸钠凝胶。

实施例3：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：在步骤四中，将步骤三得到的多份冻干提取物进行混合，然后将其与3wt％的低分子非交联透明质酸钠混合，两者的混合比例为1：8。接着用灭菌注射用水使其溶解后得到含有3wt％的透明质酸钠的凝胶，使用0.22um滤膜过滤，得到脂肪干细胞无血清培养基冻干提取物—透明质酸钠凝胶。

实施例4：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：不含血清的培养基采用加入有1wt％的青链霉素双抗的dmem培养基。

实施例5：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：不含血清的培养基采用加入有1wt％的青链霉素双抗和10wt％的胎牛血清的dmem培养基。

二、对比例1-5

对比例1：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：在冻干方法的s3中，让冻干箱内的温度预先降至-6～-5℃，然后将培养基装入冻干箱内保温冻干2小时。

对比例2：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：在冻干方法的s3中，让冻干箱内的温度预先降至-11～10℃，然后将培养基装入冻干箱内保温冻干2小时。

对比例3：一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：在冻干方法的s3中，首先将培养基装入冻干箱内，然后开始降至-1～0℃，温冻干2小时。

对比例4：一种脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：不含有透明质酸钠，直接将步骤三得到的多份冻干提取物进行混合，用适量生理盐水对其完全溶液，形成含有脂肪干细胞分泌的生长因子的溶液。

对比例5：一种甘油复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂，与实施例1的不同之处在于：将步骤三得到的多份冻干提取物进行混合，用适量生理盐水对其完全溶液，形成含有脂肪干细胞分泌的生长因子的溶液，与3wt％的甘油(每1ml灭菌注射用水中加入30mg甘油)混合得到的制剂。

三、试验数据检测

试验一：冻干方法对脂肪干细胞内有效成分含量的影响

试验对象：将实施例1制得的冻干提取物—透明质酸钠凝胶作为试验对样1，将对比例1-5制得的冻干提取物—透明质酸钠凝胶作为对照样品1-5。

试验方法：随机选取28只无毛的小白鼠，随后在每只小白鼠的背部皮肤用刀(医用酒精消毒后的刀)划开长度大概2cm左右的伤口，随机平均分为7组，每组4只分别关在7个无菌的笼子中，分别标记笼子1-7。

然后将分别采用洁净的棉签对28只小白鼠的伤口分别采用相对应的样品(试验样品1、对照样品1-5)，空白样品是对其伤口不做额外的处理，直接采用纱布包扎。其他样品按照每天2次的频率，每次间隔12小时对伤口涂抹1次，每次涂抹完后用纱布包扎固定。接着连续观察10-15天，伤口的评价标准参考如表1所示，同时记录第1天、3天、5天、7天和10天时伤口愈合情况，取平均值，四舍五入后保留整数，并记录在表2中。

表1中显示的评价标准，分数越高愈合越好，具体分为：0-30分表明伤口明显开裂，有细胞组织细胞外翻；或者有发炎现象。31-60分表明伤口开裂，无细胞组织外翻现象。61-100分表明伤口开裂不明显或已经愈合。

表1评价标准

表2

试验结果：如表1和表2所示，根据空白样品与试验样品1对比可知，采用对照样品1的小白鼠大概在第7天左右伤口开裂不明显，且已经出现愈合的迹象。而空白样品的小白鼠在第10天伤口还是显示有开裂的现象，但是细胞组织显示已经没有外翻的现象。采用试验样品1与对比样品1-3相互比较发现，对比样品1-3在第10天伤口已经出现愈合的迹象，伤口整体开裂不明显，但是比试验样品1而言愈合速度明显慢了两到三天，效果相对较差，由此可知采用对比例1-3的冻干方式进行冻干操作会影响最终冻干提取物中的有效成分的含量。采用试验样品1与对照样品4-5对比，发现对照样品4在使用过程中不容易粘附在伤口附近，流失比较多，此时伤口的愈合速度较慢，在第10天的时候伤口还是有部分开裂的现象，此时说明书对样样品4中含有可以帮助伤口愈合的有效成分，但是伤口聚集度不高，所以有效成分不容易停留在伤口表面或附近，造成了伤口愈合速度降低的现象；而对照样品5采用甘油代替透明质酸钠，与冻干粉混合。此时甘油具有粘合的作用，此时试验数据显示在第10天伤口基本愈合了，但是效果没有试验样品1的伤口愈合的好，分析可知一方面甘油的油度较大(粘度大)附着在伤口表面会遮盖伤口，形成一层类似油膜，遮盖了伤口处的细胞，因此反而不利于伤口处的细胞正常的呼吸，另外皮肤对透明质酸钠(尤其是非交联的低分子透明质酸钠)的吸收较好，此时富含在上述透明质酸钠内的冻干提取物中的有效成分能够随之被肌肤吸收，从而进一步提高了对伤口的愈合作用。

具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。