一种NK细胞和CD20+靶点抗体的组合物及在淋巴瘤上应用的制作方法

本发明涉及一种nk细胞和cd20+靶点抗体的组合物及在淋巴瘤上应用，组合物包括免疫治疗细胞和抗体，具体涉及nk细胞及cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体，使用该组合物在癌细胞rec-1人淋巴瘤细胞上的应用。

背景技术：

细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤或其他疾病。目前，nk细胞免疫治疗受到越来越多的重视。nk细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为cd3-cd56+，nk细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的cd56highcd16-细胞和具有细胞毒活性的cd56dimcd16+细胞。nk细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，nk细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是nk细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。

nk细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，nk细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是nk细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。最新的研究表明，阻断nk细胞表面的免疫检测点受体tigit，可以有效的阻止nk细胞的耗竭，促进nk细胞依赖的肿瘤免疫，抑制多种小鼠恶性肿瘤的生长。因此，nk细胞在机体免疫系统抵抗肿瘤的反应中发挥必不可少的作用，机体nk细胞功能紊乱，是肿瘤发生、发展的可能原因之一。自体或者同种异体nk细胞已经用于治疗恶性淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性/难治性急性白血病、急性髓性白血病、儿童复发/难治性神经母细胞瘤、晚期胃癌、结直肠癌、结直肠癌/胰腺癌肝转移以及多种复发性、转移性实体瘤。临床显示出良好的耐受性和一定的治疗效果。

b淋巴细胞抗原cd20+是在淋巴b细胞表面表达的糖基化磷蛋白，在人体b细胞的发育分化周期中，从前b细胞到成熟b细胞阶段cd20+的抗原表面丰度逐渐增加，但在b细胞发育的最初和最后阶段cd20+不表达。cd20+在b细胞淋巴瘤，白血病，b细胞慢性白血病和黑色素瘤肿瘤干细胞中均有表达。cd20+在正常生理组织和肿瘤组织的表达特征使cd20+可以作为一个很好的b细胞疾病相关的靶点。

临床上治疗非霍奇金淋巴瘤传统单独使用chop方案或者联合依托泊苷，临床缓解率可大45-55％。科学家研究发现大部分非霍奇金淋巴瘤来源于b细胞，其中90％表现为cd20+，所以治疗大部分非霍奇金淋巴瘤的有效靶点为cd20+，随着利妥昔单抗的应用，临床上大部分患者病情得到缓解。但仍有部分cd20+的患者对利妥昔单抗产生耐药，还有一部分出现对利妥昔单抗不敏感，因此针对目前临床cd20+的产生耐药或者不敏感的患者需要提供更有效的治疗方法或者治疗药物。

技术实现要素：

针对上述所述问题，本发明提出了一种细胞组合物，组合物具体包括nk细胞及以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体，该组合物在癌细胞rec-1人淋巴瘤细胞上的应用。且组合物中的nk细胞通过活化扩增培养，扩增出具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点的nk细胞，扩增培养后的nk细胞同以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体复合形成一种细胞组合物，其具有非常好的临床应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

所述组合物包括：nk细胞及以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体以及稳定剂。

其中所述稳定剂选用枸橼酸。

其中上述稳定剂不仅包含枸橼酸，可以包括其他可以稳定组合物体系的其他稳定剂或缓冲剂等。

所述组合物的制备方法包括以下步骤：

(1)nk细胞的获得；

(2)步骤1中的细胞与以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体混合获得组合物。

其中组合物中以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体含量为10-1000μg/ml。

其中组合物中nk细胞为1-1.5*10¹⁰个/ml。

其中组合物中稳定剂百分比含量0.01-0.05％。

其中所述的以cd20+为靶点的抗体为利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、obinutuzumab以及其他以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体一种或多种。

细胞与以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体在无菌条件下混合，将抗体加入细胞液中，并在37℃水浴锅中孵育10-30min，并通过常规方法混匀细胞组合物，后分装细胞组合物于容器中。

其中上述nk细胞的获得方法如下：

(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％fbs或自体血清的rmpi1640和0％-50％x-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；

(2)nk细胞的诱导：加入含浓度为500～3000u/mlil-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有500～3000u/mlil-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％co2培养箱中培养；

(3)培养2～3天，在培养瓶或培养袋中增补2ml无血清混合培养基和il2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；

(4)培养4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶或培养袋中的细胞分别转至t25细胞培养瓶中，再然后，更换5mlex培养基进行扩增培养，依次加入无血清ex培养基、il2细胞因子；

(5)培养3-4天后，在t25细胞培养瓶中增补5ml无血清ex培养基、il2细胞因子，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20ml；

(6)培养3-5天后，检测nk细胞总数。

优选的，il-2浓度为1000u/ml。

优选的，在一个实施案例中混合培养基中含10vt％fbs或自体血清的rmpi1640的比例为50vt％，x-vivo15培养基的比例为50vt％。

上述所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和ipscs诱导分化得到的单个核细胞。

所述细胞因子中所用il-2的浓度优选为1000-1800u/ml。

上述组合物在非霍奇金淋巴瘤中晚期抗肿瘤治疗上的应用或者复发性/对靶向cd20+单抗耐药/对靶向cd20+单抗不敏感肿瘤上的应用。

本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：

(1)nk细胞同以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体混合后的细胞组合物对rec-1人淋巴瘤细胞杀伤作用强，且可以抑制rec-1人淋巴瘤细胞转移及肿瘤病灶的形成。

(2)稳定剂的加入可以调节抗体与nk细胞体系的稳定性，促进抗体与nk细胞活性的保持；

(3)抗肿瘤免疫细胞组合物共同作用于受体，相较于单独疗法可大幅度降低治疗成本，获得有效的治疗效果，简化了在临床治疗过程；

(4)组合物对cd20+靶点抗体产生耐药或者不敏感的患者有较好的效果，可以为临床治疗方案提供参考。

附图说明：

图1为扩增培养nk细胞生长曲线。

图2为nk细胞、抗体、细胞组合物对rec-1人淋巴瘤细胞细胞的杀伤活性检测。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1nk细胞的获得

nk细胞的获得从外周血中分离单个核细胞(pbmcs)并扩增nk细胞：

(1)使用前30分钟开启生物安全柜；

(2)使用前从冰箱中取出d-pbs，室温放置30分钟；

(3)将30ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml离心管，每管15ml，然后向每管加入22.5ml无菌d-pbs，反复颠倒离心管，充分混匀；

(4)另取两个50ml无菌离心管，分别加入15mlficoll-paqueplus溶液，然后分别缓慢的加入24ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；

(5)将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用10ml吸管吸掉15ml血清层，装入一个新的无菌50ml离心管中，56℃灭活30分钟待用(用于配制混合培养基)；

(6)吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(pbmcs)，转入一个新的50ml无菌离心管；

(7)向步骤6装有pbmcs细胞悬液的离心管中加入其3倍体积的无菌pbs，并用无菌移液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；

(8)弃上清，加入50ml无菌pbs，缓慢重悬pbmc；

(9)20℃，400×g，离心10分钟；

(10)加入5ml50vt％含步骤5自体血清的rmpi1640+50vt％x-vivo15的混合培养基，混匀，取10μl用于计数；

(11)由步骤10中取一半量的外周血单个核细胞(pbmcs),加入一定体积含有1000u/mlil-2的混合培养基调整细胞浓度至1×10⁶cells/ml，使用t-175培养瓶培养细胞；

(12)混合培养基体外刺激4天后加入含有500u/mlil-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％co2培养箱中培养；

(13)培养2天，在培养瓶中增补2ml无血清混合培养基和il2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；

(4)培养3-4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶中的细胞分别转至t25细胞培养瓶中，再然后，更换5mlex培养基进行扩增培养，依次加入无血清ex培养基、il2细胞因子，使得il2细胞因子最终浓度与原始浓度相同；

(5)培养3-4天后，在t25细胞培养瓶中增补5ml无血清ex培养基、il2细胞因子，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20ml；

(6)培养3-5天后，检测nk细胞总数。

在培养第0、4、6、9、12、16、18天统计细胞数，制作细胞生长曲线，如图1所示，接种3000万细胞，扩增18天，细胞总数可达约420亿，完全满足临床应用需要。

实施例2组合物对rec-1人淋巴瘤细胞细胞的杀伤活性

细胞组合物的制备：将实施例1制备的nk细胞制备成1*10¹⁰个/ml的细胞悬液，后将以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体，优选利妥昔单抗溶液，缓慢加入细胞悬液中，无菌密封环境下将混合物在37℃水浴中孵育20min，同时细胞混合物按照常规方法均匀混合，必须保证无菌操作。

其中利妥昔单抗溶液含有稳定剂枸橼酸，且使利妥昔单抗、枸橼酸混合于细胞悬液中的终浓度或含量分别为500μg/ml、0.02％。

实验组别：空白对照组：生理盐水；

组合物组：nk细胞与利妥昔单抗及稳定剂(500μg/ml利妥昔单抗、0.02％稳定剂)；

单抗组：利妥昔单抗及稳定剂(500μg/ml利妥昔单抗、0.02％稳定剂)；

细胞组：nk细胞(1*10¹⁰个/ml的细胞悬液)

实验方法：

取对数生长期的rec-1人淋巴瘤细胞细胞，按照每孔100ul(6000-8000个细胞)接种96孔板中，待细胞贴壁后每孔分别加入空白对照组、组合物组、单抗组、细胞组各100ul进行试验，37℃孵育4h和8h后，加入1μg/ml的pi染料，cfse+pi双阳性的细胞为死亡细胞，如图2所示，细胞组合物能显著地增强对癌细胞的杀伤活性，可以达到90％的杀伤率。

实施例3组合物抑制rec-1人淋巴瘤细胞的迁移

实验材料：(1)transwellchamber:24-well,8.0-μmporemembranes(corning)；

(2)细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养基，pbs，0.02％edta；

(3)固定液：甲醇；

(4)染色液：giemsa染液；

(5)封片剂：中性树胶；

(6)其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片；

(7)rec-1人淋巴瘤细胞：按照常规方法从已对利妥昔单抗治疗反应敏感度小的患者中分离获得淋巴瘤细胞系并培养作为实施例3和实施例4的研究用细胞。

实验组别：制备方法同实施例2细胞组合物制备

空白对照组：生理盐水；

组合物组：nk细胞与利妥昔单抗及稳定剂(500μg/ml利妥昔单抗、0.02％稳定剂)；

单抗组：利妥昔单抗及稳定剂(500μg/ml利妥昔单抗、0.02％稳定剂)；

细胞组：nk细胞(1*10¹⁰个/ml的细胞悬液)

实验过程：

(1)所有细胞培养试剂和transwellchamber放在37℃温育；

(2)取对利妥昔单抗不敏感型rec-1人淋巴瘤细胞培养至对数生长期，消化细胞，用pbs和rmpi1640+50vt％x-vivo15的混合培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×10⁵/ml；

(3)在下室(即24孔板底部)加入600－800μl含10％自体血清的rmpi1640+50vt％x-vivo15的混合培养基，上室加入100－150μl细胞悬液，同时分别加入各实验组的物质，按照1:1进行，继续在孵箱培养24小时；

(4)用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟；

(5)取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μlgiemsa染液的孔中，室温染色15－30分钟；

(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

(7)用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；

(8)显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。统计结果见表1。

表1细胞迁移统计数目(个)

通过上述实验统计得到：在4组实验中，组合物组的rec-1人淋巴瘤细胞细胞迁移最少，当nk细胞同抗体联合作用于癌细胞后，可以有效阻止癌细胞的迁移及转移，rec-1人淋巴瘤细胞有一部分凋亡，其余细胞迁移性降低，因此组合物对于rec-1人淋巴瘤转移性及成瘤有效，此种方法可以降低rec-1人淋巴瘤转移及成瘤风险。

实施例4组合物对体内肿瘤作用

细胞组合物的制备：将实施例1制备的nk细胞制备成1*10¹⁰个/ml的细胞悬液，后将以cd20+为靶点的单抗和/或双特异性抗体，优选利妥昔单抗溶液，缓慢加入细胞悬液中，无菌密封环境下将混合物在37℃水浴中孵育20min，同时细胞混合物按照常规方法均匀混合，必须保证无菌操作。

其中利妥昔单抗溶液混合于细胞悬液中的终浓度或含量分别为500μg/ml。

实验组别：空白对照组：生理盐水；

组合物组：nk细胞与利妥昔单抗及稳定剂(500μg/ml利妥昔单抗、0.02％稳定剂)；

单抗组：利妥昔单抗及稳定剂(500μg/ml利妥昔单抗、0.02％稳定剂)；

细胞组：nk细胞(1*10¹⁰个/ml的细胞悬液)

实验方法：

将处于对数生长期的不敏感型rec-1人淋巴瘤细胞制备成单细胞悬液，调整细胞浓度1*10⁷/ml(共48只，每组12只)，预备接种体积为0.2ml/只。将小鼠置于专用固定器中固定，用1ml一次性无菌注射器将细胞悬液在小鼠腹骨皮下缓慢注射进入小鼠体内。待小鼠身体状况趋于稳定后正常饲养，待肿瘤长至100mm³左右后，通过尾静脉注射给药，药物分为四组，见实验组别设计，之后每星期尾静脉注射药物2次，每次给药0.2ml，定期观察，当出现身体瘦弱、呼吸衰竭等症状时脱臼处死小鼠，未死亡小鼠在尾静脉注射给药2个月后脱臼处死解剖，观察小鼠体内肿瘤情况。具体统计结果见表2。

表2小鼠统计状况

其中抑瘤率计算公式如下：

抑瘤率＝(空白对照组瘤重-给药组瘤重)/空白对照组瘤重*100％

由表2可以看出，组合物组对不敏感型rec-1人淋巴瘤细胞(对利妥昔单抗不敏感)肿瘤具有强有效的敏感反应，可以有效抑制肿瘤生长，抑制率可以达到60％。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。