GLP-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂药物中的应用的制作方法

本发明属于生物制药领域,具体涉及glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂以及高血脂所导致的相关疾病药物中的应用。

背景技术：

动脉粥样硬化性心血管疾病(cvd)严重危害人类健康,且其发病率呈逐年上升的趋势。血浆低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)异常升高在动脉粥样硬(as)发病机制中的作用已倍受关注,并已确定为诱发cvd的主要危险因素(natrevdisprimers2017,3:17093)。除此之外,越来越多的临床试验发现,确定性危险因素如ldl-c校正后,冠状动脉粥样硬化性心脏病(chd),的患病风险仍然存在,而甘油三酯(tg)水平的升高与患者死亡率、心肌梗死率及冠状动脉事件复发率增高显著相关(eurheartj2011,32(11):1345.)。大量流行病学研究已确认,tg水平与cvd的发生发展关系十分密切,高血浆浓度tg已成为诱发动脉粥样硬化等心血管疾病cvd的独立危险因素(natrevcardiol201714(7):401)。此外,高甘油三酯(tg)血症与非酒精性脂肪肝(nafld)、肥胖、肝纤维化、胰腺炎等慢性代谢性疾病关系密切。因此,研制降高甘油三酯药物对于防治动脉粥样硬化等心血管疾病(cvd)、非酒精性脂肪肝(nafld)、肥胖、肝纤维化、胰腺炎等慢性代谢性疾病具有重要意义。

艾塞那肽(exendin-4)是一种从北美洲西北部钝尾毒蜥唾液中发现的外源性glp-1受体多肽激动剂,由39个氨基酸组成,与glp-1氨基酸序列具有约53％的同源性。它在哺乳动物体内的生理功能与glp-1相似,能够刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌,即只在机体血糖浓度高时发挥作用,而在血糖正常或偏低时不发挥作用。艾塞那肽于2005年4月由美国amylin与elililly公司开发上市,并于2009年8月在中国上市,用于2型糖尿病患者降血糖治疗。与glp-1相比,虽然艾塞那肽对二肽基肽酶ⅳ(dipeptidylpeptidase4,dpp-4)不敏感,其体内半衰期得到延长,达到3.3～4小时(barnettah.drugstoday(barc).2005；41:563-78；koltermanog.amjhealthsystpharm.2005；62:173-81),但临床上仍需每天注射2次,因此,延长其体内半衰期将有利于降低其临床使用剂量和频次,并提高其治疗效果。

cn201610678121.0公开了一种高活性长效降糖融合蛋白，由高活性艾塞那肽突变体通过连接肽或者直接与优化突变的人免疫球蛋白igg1的fc片段连接而成。该融合蛋白具有长效的降糖作用，并且能够在大肠杆菌e.coli中进行可溶性表达。

技术实现要素：

本发明的研究者在前期研究中公开了一种高活性长效降糖融合蛋白(中国专利文献cn201610678121.0)，该融合蛋白由高活性艾塞那肽突变体通过连接肽或者直接与优化突变的人免疫球蛋白igg1的fc片段连接而成，具有长效的降糖作用，并且能够在大肠杆菌e.coli中进行可溶性表达。

本发明在前期研究基础上，进一步对该融合蛋白的药理活性进行了研究，意外发现该融合蛋白相较于艾塞那肽能够更加显著地降低其血浆高甘油三酯(tg)、高低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)及高总胆固醇(tc),且具有体内半衰期长的优点,可应用于制备治疗高血脂以及高血脂所导致的相关疾病药物。

本发明具体技术方案如下：

glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂以及高血脂所导致的相关疾病药物中的应用。

优选的，所述glp-1受体激动剂融合蛋白为艾塞那肽或其突变体通过连接肽或直接与天然的或优化突变的人免疫球蛋白igg的fc片段连接而成的融合蛋白。更优选的，所述glp-1受体激动剂氨基酸序列如seqidno:1(或seqidno:2所示。

本发明所述高血脂包括高甘油三酯、高低密度脂蛋白胆固醇、高总胆固醇中的一种或几种。所述高血脂所导致的相关疾病包括非酒精性脂肪肝、肥胖、动脉粥样硬化等心脑血管疾病。

本发明公开了一种艾塞那肽或其突变体构建成的长效融合蛋白的新用途,该融合蛋白由艾塞那肽或其突变体通过连接肽或直接与优化突变的人免疫球蛋白igg的fc片段构建而成,可有效抑制高脂饮食诱导的金黄色地鼠肝脏中甘油三酯合成酶的表达,显著降低高脂饮食诱导的金黄色地鼠血清中高甘油三酯(tg)、高低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)及高总胆固醇(tc)水平,且具有体内半衰期长的优点,因此可用于制备治疗高甘油三酯(tg)、高低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)及其相关性疾病如非酒精性脂肪肝、肥胖、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的药物。

上述长效glp-1受体激动剂融合蛋白,可通过与药学上可以接受的辅料制成药学上可以接受的剂型。

附图说明

图1本发明所述融合蛋白改善hepg2细胞中棕榈酸诱导的脂质积累考察结果。图1a-1c依次为exendin-4、ex4-fc及ex-l21k-fc给药后的细胞活力；图d为细胞脂质堆积油红o染色结果，显微放大倍率为200及400倍；图e为溶解染料后染色液的吸光度值a510nm(e)。^####p<0.0001与未处理对照组比较；^***p<0.001,^****p<0.0001与pa组比较(n＝3,means±sem)。

图2本发明所述融合蛋白激活amp依赖的蛋白激酶(ampk)磷酸化的研究结果。(图2a-2e依次为给药后hepg2细胞中p-ampk/t-ampk、nsrebp-1c、fas、p-acc/acc、scd-1蛋白的表达水平。^#p<0.05,^##p<0.01与未处理对照组比较；^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001与pa组比较(n＝8,means±sem)。

图3本发明所述融合蛋白给药后对hfd喂养的lvg叙利亚金黄地鼠体重及进食量的影响。图3a为每周测定一次hfd喂养及给药期间金黄地鼠体重变化；图3b为给药前及给药期间金黄地鼠平均进食量变化。(n＝8,means±sem)。

图4本发明所述融合蛋白皮下给药对hfd喂养的lvg叙利亚金黄地鼠血清中tg、tc、ldl-c及hdl-c的影响。图4a:血清甘油三酯(tg)含量；图4b:血清总胆固醇(tc)含量；图4c:血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)含量；图4d:血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量。^###p<0.001与chow+pbs组比较；^*p<0.05,^**p<0.01,^****p<0.0001与hfd+pbs组比较(n＝8,means±sem)。

图5本发明所述融合蛋白给药后对hfd喂养的lvg叙利亚金黄地鼠肝脏形态和肝脏脂质积累的影响。图5a:降低hfd喂养的lvg叙利亚金黄地鼠肝体指数；图5b:改善肝脏病理性肥大；图5c:改善肝脏病理变化(伊红-苏木素染色后肝脏病理切片,显微放大200倍)；图5d:降低肝脏组织tg含量；图5e:降低肝脏组织tc含量。^##p<0.01与chow+pbs组比较；^*p<0.05,^**p<0.01与hfd+pbs组比较(n＝3-8,means±sem)。

图6本发明所述融合蛋白给药后对hfd喂养的lvg叙利亚金黄地鼠肝组织ampk磷酸化的影响。图6a-6e依次为p-ampk/t-ampk、nsrebp-1c、fas、p-acc/acc、scd-1蛋白表达水平。^#p<0.05,^##p<0.01,^####p<0.0001与chow+pbs组比较；^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001,^****p<0.0001与hfd+pbs组比较(n＝8,means±sem)。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤,但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,该实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

下述实例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。

实施例1长效融合蛋白改善hepg2细胞中棕榈酸诱导的脂质积累

本发明所用长效融合蛋白ex4-fc(seqidno:1)及ex-l21k-fc(seqidno:2)即中国发明专利cn201610678121中ex-higg1fc和ex-l21k-mhigg1fc的简称，并按该专利所述方法制备得到，摩尔浓度计算方法也按单链分子量计算得到。

人肝癌hepg2(购自中科院上海细胞库)用含10％fbs(cat:10099141,gibco)mem培养基(41500034,gibco)重悬后,以5×10⁵个细胞/孔接种于96孔细胞培养板内培养,待汇合率达到70％时,用无血清opti-mem培养基处理4h后,弃掉培养基,加入200μl0～40nmexendin-4及其融合蛋白培养24h,每孔加入20μlmtt,继续培养4h后弃掉原培养基,加入150μl二甲基亚砜,置于37℃摇床上低速振摇10min,使结晶物充分溶解,测定各孔a570nm吸光度值。mtt实验结果(图1a-c)显示,hepg2细胞经过0～40nm药物处理后,各组间细胞活力未出现显著差异(p>0.05),说明在该浓度范围内药物处理未产生细胞毒性作用,可用于后续药物处理实验。

hepg2细胞均匀铺在六孔细胞培养板内培养,待汇合率至70％,用无血清opti-mem培养基处理4h后,加入400μm棕榈酸(palmiticacid,pa)诱导hepg2细胞脂肪堆积,同时分别加入20nm的药物处理细胞24h。用4℃预冷的pbs清洗3次,4％多聚甲醛固定30min,室温下油红o染色1h,蒸馏水清洗,显微镜(200×400)观察染色结果。干燥后每孔加入1ml异丙醇,37℃振摇溶解染料10min,测定a510nm吸光度。结果(图1d-e)显示,pa模型组与未处理对照组相比,油红o着色较多,说明经pa诱导的hepg2细胞已形成脂质堆积,造模成功。与pa模型组相比,给药组hepg2细胞油红o着色减少,脂质堆积情况得到改善,且pa+ex-l21k-fc组改善效果最明显(^****p<0.0001vs.pagroup)。

实施例2长效融合蛋白激活hepg2细胞中amp依赖的蛋白激酶(ampk)磷酸化,使其底物乙酰辅酶a羧化酶磷酸化后失活，同时ampk磷酸化激活后可降低核内固醇调节元件结合蛋白1c(nsrebp-1c)水平,下调tg合成相关的脂肪酸合成酶(fas)、乙酰辅酶a羧化酶(acc)及硬脂酰辅酶a脱氢酶(scd-1)表达。

amp依赖的蛋白激酶(adenosine5‘-monophosphate(amp)-activatedproteinkinase，ampk)是生物能量调节的关键分子,能够调控包括糖类及脂质代谢等多种代谢途径。p-ampk(即磷酸化amp依赖的蛋白激酶)可将acc磷酸化成p-acc使其失活，此时p-acc/acc比值升高，减少脂质合成。

按实例1处理hepg2细胞细胞后,与正常对照组相比,pa组细胞中p-ampk/ampk比例显著降低(^##p<0.01)。与pa组相比，融合蛋白ex-fc和ex-l21k-fc可显著促进ampk磷酸化,显著提高p-ampk/t-ampk比例(^**p<0.01,^***p<0.001vs.pagroup)<0.05vs.pagroup(图2a)，且融合蛋白ex-l21k-fc激活ampk磷酸化的活力高于ex-fc融合蛋白。

固醇调节元件结合蛋白1c(sterol-regulatoryelementbindingprotein-1c,srebp-1c)是成年人肝脏中主要的srebp-1亚型,是调节脂质合成基因的关键转录因子,细胞核内srebp-1c(nsrebp-1c)后可与固醇调节元件(sre)结合，增强脂肪酸合成酶(fattyacidsynthetase,fas)、乙酰辅酶a羧化酶(acetylcoacarboxylase,acc)及硬脂酰辅酶a脱氢酶(stearylcoenzymeadehydrogenase-1,scd-1)等多种脂质合成相关基因的表达。

按实例1方法处理细胞后,与正常对照组相比,pa组hepg2细胞中p-acc/acc比值降低，而nsrebp-1c、fas及scd-1表达水平上升(分别^##p<0.01,^#p<0.05,^##p<0.01)(图2b-2e)。与pa组相比，药物组hepg2细胞中p-acc/acc比值出现不同程度升高，且pa+ex-l21k-fc组升高水平最显著(^*p<0.05vs.pagroup)。与pa组相比，融合蛋白ex-fc和ex-l21k-fc组nsrebp-1c、fas及scd-1水平显著下降,且pa+ex-l21k-fc组升高水平最显著(图2b-e)。该结果说明,在pa诱导脂质积累的hepg2细胞中,融合蛋白ex-fc和ex-l21k-fc能够通过ampk信号途径将acc磷酸化成p-acc使其失活，此时p-acc/acc比值升高,同时显著降低pa诱导引起的tg合成关键转录因子nsrebp-1c水平,从而显著降低tg合成相关酶fas及scd-1的表达。

实施例3长效融合蛋白给药后降低金黄地鼠体重和进食量

lvg叙利亚金黄地鼠(lvggoldensyrianhamsters)40只购自北京维通利华模式动物有限公司,6～7周龄,雄性,体质量(134±4)g,实验动物生产许可证号scxk(京)2016-0011,品系代码501。金黄地鼠饲养于spf级动物房,室温控制在24～26℃,湿度40～60％,明暗各12h,食物、水源充足,适应性饲养1周后按照体重随机分组进行实验。第一组8只,给予正常饮食；另一组32只,给予高脂饮食(hfd)。喂养4周,高脂饮食组形成高甘油三酯血症及肝脏脂肪堆积。随后,高脂饮食组金黄地鼠按体重随机分为4组,皮下注射给药,给药量20nmol﹒kg^-1,给药容积5ml﹒kg^-1。chow+pbs组、hfd+pbs组及hfd+ex4组每天给药1次,hfd+ex4-fc组和hfd+ex-l21k-fc组每周给药2次,给药周期为4周,每周记录2次体重和进食量。给药4周后,金黄地鼠禁食8小时,安乐死后取血,取肝脏中叶进行固定、包埋。同时,取部分肝脏组织加入匀浆介质,机械匀浆后取上清测定肝脏组织内tg含量,其余部分立即置于液氮罐中冷冻保存,用于后续tg合成相关酶表达水平检测。

如图3a及表1所示,前4周正常饮食组及高脂饮食组金黄地鼠体重均稳定增长,高脂饮食组体重增加较正常饮食组更为迅速。经4周高脂饮食诱导造模后,hfd+pbs组、hfd+ex4组、hfd+ex4-fc组及hfd+ex-l21k-fc组体重(g)分别为163.72±4.43、163.07±5.11、162.47±2.57、161.46±4.71,与正常饮食组146.33±1.95g相比,具有极显著差异(^####p<0.0001),说明高脂饮食组已形成高脂表型,而各hfd组之间无显著性差异。给药4周后,hfd+ex4组、hfd+ex4-fc组及hfd+ex-l21k-fc组体重均出现明显下降,其中hfd+ex-l21k-fc组金黄地鼠体重下降最为明显。

给药前后进食量变化如图3b,正常饮食组金黄地鼠在整个实验期间进食量较为稳定,而hfd+ex4组、hfd+ex4-fc组及hfd+ex-l21k-fc组金黄地鼠在给药后进食量急剧减少,后缓慢增加至趋于稳定状态,且hfd+ex-l21k-fc组金黄地鼠在给药后进食量减少最为明显。

上述结果表明exendin-4及融合蛋白ex4-fc和ex-l21k-fc均可有效抑制高脂饮食组金黄地鼠体重的增加，并减少其进食量，且ex-l21k-fc组作用效果更显著。

表1长效融合蛋白对hfd喂养的lvg叙利亚金黄地鼠体重的影响

^###p＜0.001，^####p＜0.0001vs.chow+pbsgroup；^****p＜0.0001vs.hfd+pbsgroup；^δδδp＜0.001，p＜0.001，^δδδδp＜0.0001vs.hfd+ex4group(n＝8，valuesaremeans±sem).

实施例4长效融合蛋白给药后显著降低lvg叙利亚金黄地鼠血浆tg、tc及ldl-c水平

按实施例3造模给药后所得的金黄地鼠处死后，所取新鲜血样于4℃冰箱静置4h后，于4℃、3500rpm离心10min，得到上层血清，采用生化检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定tg、tc、ldl-c及hdl-c含量。结果显示，金黄地鼠经高脂饮食诱导后，血清中tg、tc、ldl-c含量较正常对照组明显升高，但hdl-c含量未见影响(图4d)。给药4周后，与模型组相比，给药组金黄地鼠血清中tg、tc、ldl-c含量均出现不同程度降低，且hfd+ex-l21k-fc组在降低tg方面表现出极显著差异(^****p＜0.0001vs.hfd+pbsgroup)(图4a)，在降低tc及ldl-c方面也表现出显著差异(^*p＜0.05，^**p＜0.001vs.hfd+pbsgroup)(图4b、c)。

实施例5长效融合蛋白改善金黄地鼠肝脏形态及降低肝脏组织中脂质积累

按实施例3造模给药后所得的金黄地鼠处死后，取新鲜肝脏，称重并记录肝脏重量，计算肝体指数。如图5a所示，与chow+pbs组相比，hfd+pbs组肝体指数显著升高(^####p＜0.0001)，说明经hfd喂养后金黄地鼠肝脏较正常金黄地鼠产生病理性肥大。给药后肝脏肥大得到不同程度缓解，其中hfd+ex-l21k-fc组肝体指数降低最为显著(^***p＜0.001)，说明exendin-4及融合蛋白能够有效改善肝脏的病理性肥大状态，且glp-1受体激动剂融合蛋白ex-l21k-fc效果最为显著。

如图5b所示，chow+pbs组金黄地鼠肝脏色泽较深，肝脏表面细腻光滑，而hfd+pbs组、hfd+ex4组、hfd+ex4-fc组及hfd+ex-l21k-fc组肝脏均出现不同程度肥大、边缘变钝,肝脏表面较为粗糙且色泽发白。但与hfd+pbs组相比,hfd+ex4组、hfd+ex4-fc组及hfd+ex-l21k-fc组肝脏形态均有不同程度改善,且hfd+ex-l21k-fc组肝脏形态改善更为明显。

肝脏组织石蜡切片h&e染色后,细胞核呈紫蓝色,胞浆呈红色,胞内脂质堆积处形成脂肪空泡,因此可依据胞内脂肪空泡的大小判断肝脏细胞内脂肪堆积的程度。结果如图5c,chow+pbs组肝细胞呈条索状排列整齐,细胞核结构完整；hfd+pbs组金肝细胞排列明显紊乱,可见有细胞核碎裂现象,细胞内脂肪空泡较大,说明该组肝脏脂质积累明显高于chow+pbs组；hfd+ex4组及hfd+ex4-fc组与hfd+pbs组相比脂肪空泡数量及大小均有所减少,说明肝脏脂质积累得到一定改善；而hfd+ex-l21k-fc组与hfd+pbs组相比,肝细胞排列明显整齐,细胞核碎裂现象明显改善,脂质空泡数量及大小均亦明显减少。

准确称取金黄地鼠肝脏组织重量,按照肝重(g):体积(ml)＝1:9的比例,加入无水乙醇作为匀浆介质,冰浴条件下机械匀浆后于4℃、2500rpm离心10min,取上清,生化检测试剂盒检测肝脏组织中tg、tc含量。结果显示,ex-l21k-fc可显著降低肝脏组织中tg(图5d)及tc(图5e)含量,说明ex-l21k-fc在降低肝脏组织tg含量及改善肝脏脂质积累方面作用明显,效果优于exendin-4。

实施例6长效融合蛋白给药后激活金黄地鼠肝脏组织中ampk磷酸化,抑制nsrebp-1c表达,进而抑制tg合成酶基因表达

为了进一步验证该新型融合蛋白在改善htg方面的作用机制,再次检测了高脂饮食喂养的金黄地鼠肝脏中调节tg合成及氧化分解相关基因的表达水平(图6)。由图中可以看出,肝脏细胞中相关基因的表达水平与hepg2细胞中的含量趋势一致,hfd+pbs组金黄地鼠较chow+pbs组相比,肝脏中p-ampk/ampk比例显著降低(^####p<0.0001),exendin-4及其融合蛋白能够促进ampk磷酸化,p-ampk/ampk比例升高(图6a)。hfd+pbs组金黄地鼠经高脂饮食喂养后,nsrebp-1c、fas及scd-1表达水平较正常组相比升高(分别^##p<0.01,^##p<0.01,^#p<0.05),p-acc/acc的比值下降,hfd+ex4组、hfd+ex4-fc组及hfd+ex-l21k-fc组在给药后,nsrebp-1c、fas及scd-1表达水平下降,p-acc/acc的比值出现不同程度升高,且hfd+ex-l21k-fc组升高水平最明显(^**p<0.01)(图6b-e)。

序列表

<110>中国药科大学

<120>glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂药物中的应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<130>ex4-fc

<210>1

<211>277

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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151015

gluglualavalargleupheileglutrpleulysasnglyglypro

202530

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354045

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