一种具有抗菌抗凝的两亲生物碳复合物及其制法和用途的制作方法

本发明涉及一种抗菌抗凝的两亲生物碳复合物。

背景技术：

细菌感染和血栓形成是导致医用导尿管相关性疾病的主要原因，导尿管中细菌和血小板等的粘附容易形成生物被膜和血栓，使得导尿管相关性疾病发病率大大提高。为了解决上述问题，传统的方法一般是通过浸渍法将抗菌剂或用抗凝剂等涂覆导尿管，利用抗菌剂的抗菌作用或者抗凝剂的抗凝作用来实现抗菌或者抗血栓的功能。虽然经过涂覆后的导尿管具有了抗血栓或抗细菌感染的作用，但浸渍法依然存在作用时间短、使用不便等缺点。如何通过简单有效的方法实现有效的抗细菌感染/血栓仍然是当今医用导尿管领域的难点。

纳米银具有很强的杀菌作用，目前被广泛应用于陶瓷滤水器、活性炭空气过滤器、伤口敷料等领域中；肝素的抗凝作用使其在血液透析、产科相关疾病、抗血栓等领域展现出的优良的应用前景。以酵母菌为基础制备的两亲生物碳材料富含大量的疏水的芳环结构和亲水的羧基，能在疏水和亲水溶剂中高度分散，同时具有强吸附性和较大的比表面积，为其进一步进行功能化修饰提供了基础，这使其可以做为一个理想的载体。

本发明以负载纳米银的两亲生物碳材料和修饰肝素的两亲生物碳材料为基础，制备了具有抗菌抗凝功能的复合物，在抗医用导尿管感染领域有广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有抗菌抗凝功能的复合物及其制备方法，该复合物可以持久稳定的抑制细菌生长、抑制血小板粘附，在医用导尿管或器材抗相关性感染领域中有潜在的应用。

本发明的技术方案如下：

一种抗菌抗凝的两亲生物碳复合物，它是以两亲生物碳材料为载体，分别通过共价键修饰了抗血小板粘附功能的肝素的两亲生物碳材料以及通过静电作用负载的纳米银的两亲生物碳材料，并将它们均匀掺杂到疏水性树脂中制备得到具有抗菌抗凝功能的复合物。

上述的抗菌抗凝的两亲生物碳复合物，所述的疏水性树脂是用于制备医用导尿管的医用橡胶，包括二甲基硅橡胶、甲基乙基硅橡胶、甲基苯基乙烯基硅橡胶、氟基硅橡胶、热塑性聚氨酯弹性体橡胶。

上述的抗菌抗凝的两亲生物碳复合物，所述的两亲生物碳材料与医用橡胶的质量比是1:100～50。

一种上述抗菌抗凝的两亲生物碳复合物的制法，它包括以下步骤：

步骤1.两亲生物碳材料的制备

取啤酒酵母细胞加入去离子水使其分散均匀，室温静置10min，去除液体表面的杂质漂浮物，将上层分散液离心，然后弃去上清液，并且向下层的沉淀物中加入丙酮后充分搅拌至其均匀分散，然后在摇床振摇20min，再次离心并加丙酮均匀分散重复上述操作，而后用去离子水清洗，去掉残留的丙酮溶剂，最后将沉淀物加入到先前配制好的2％戊二醛-磷酸缓冲溶液中并分散均匀，倒入高压反应釜中，180℃反应12h，反应完全后待温度降至室温后取出，弃去上层漂浮的杂质，下层沉淀物用去离子水进行分级清洗，离心并将沉淀真空干燥，得到黄色细粉，记为acps备用；

步骤2.壳聚糖修饰的两亲生物碳材料的制备

称取上步合成的acps超声分散在ph5.3的磷酸缓冲溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，室温条件下于摇床上活化羧基2h，之后取壳聚糖并将其完全溶解在1％的醋酸水溶液中，将活化羧基后的acps和完全溶解的壳聚糖溶液混合，室温条件下于摇床上反应过夜，离心保留下层沉淀物，然后用1％的醋酸水溶液清洗并离心，再分别以去离子水和无水乙醇清洗并离心，将得到的沉淀真空干燥得到浅黄色细粉记为acps-cs备用；

步骤3.纳米银溶液的制备

将硝酸银加入到棕色锥形瓶中并加入去离子水超声至完全溶解，制得的硝酸银溶液的浓度为1—3mmol/l，随后在磁力搅拌下将聚乙烯磺酸钠水溶液滴加到上述硝酸银溶液中，搅拌反应20min，随后逐滴加入还原剂硼氢化钠，溶液颜色由无色迅速变为黄褐色，搅拌反应5h，即可得到由聚乙烯磺酸钠包覆的纳米银溶液，记为pvs-ag备用；

步骤4.负载纳米银的两亲生物碳微粒的制备

称取步骤2中的acps-cs材料加入到步骤3中的pvs-ag溶液中，在室温下避光振荡反应8h，反应结束后，离心并去离子水清洗数次，真空干燥，即可得到负载纳米银的两亲性生物碳微粒，记为acps-ag；

步骤5.负载肝素的两亲生物碳微粒的制备

将肝素钠溶解在ph5.3的磷酸缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，室温条件下于摇床上活化羧基2h，之后取干燥acp-cs加入到上述溶液中，在4℃下避光振荡反应24h，反应结束后，离心弃去上清液，然后用去离子水清洗、离心直至洗液变为无色，无水乙醇清洗一次，真空干燥6h，即可得到负载肝素的两亲生物碳微粒，保存备用，记为acps-hep；

步骤6.抗菌抗凝复合物的制备

取热塑性聚氨酯弹性体橡胶(tpu)于避光棕色玻璃瓶中，再分别称取等量的acps-ag和acps-hep两亲生物碳微粒加入到容器中，随后加入n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，超声分散均匀后，加入到上述含有tpu的棕色玻璃瓶中，封口并磁力搅拌5h，吸取上述tpu/材料的混合液至模具中，然后在55℃真空干燥，即得tpu/acps-ag/acps-hep复合材料。

上述的制备方法，步骤2中所述的两亲性生物碳材料与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺、壳聚糖的质量比均为1:(1～4):(1～4):(1～4)。

上述的制备方法，步骤3中所述的聚乙烯磺酸钠的溶液的浓度为0.1—0.5mg/ml。

上述的制备方法，步骤4中两亲性生物碳材料与pvs-ag的质量比是1:(2～4)。

上述的制备方法，步骤5中壳聚糖修饰的两亲性生物碳材料与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺、肝素的质量比是1:(1～4):(1～4):(1～4)。

上述的制备方法，步骤6中抗菌抗凝复合物的制备，两亲生物碳材料与医用橡胶的质量比是1:100～50。

上述抗菌抗凝的两亲生物碳复合物，在制备抗菌抗凝薄膜、导尿管或器件中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明制备的两亲生物碳材料本身无抗菌抗凝性质，但是它富含大量的疏水的芳环结构和亲水的羧基，使其能在疏水和亲水溶剂中高度分散，同时具有强吸附性和较大的比表面积，为其进一步进行功能化修饰提供了基础，这使其可以做为一个理想的载体来负载抗菌剂纳米银或抗凝剂肝素，两者结合能够有效的抑制细菌生长、抑制血小板粘附，从而实现抑制导尿管相关性感染的目的。

(2)本发明选用具有良好生物相容性的壳聚糖作为中间连接体，其表面含有的大量氨基基团为其在两亲生物碳材料的后续修饰提供了可能，壳聚糖作为天然高分子材料，具有血液相容性和安全性。

(3)以聚乙烯磺酸钠为配体制备的阴离子型纳米银溶液稳定性很高，本实验制备得到的阴离子型纳米银溶液在常温下可保存半年不变质。纳米银表面所带的负电荷恰好可以与壳聚糖修饰的两亲生物碳表面的氨基基团结合，制备得到抗菌性能良好的负载纳米银的两亲生物碳材料。

(4)肝素为表面带负电基团的抗凝血功能分子，不仅具有优良的抗凝活性，还具有抗炎性质。此外制备肝素功能化的生物碳材料，可以与负载纳米银的两亲生物碳材料均匀混合在医用橡胶中，不存在配伍禁忌，这也是我们在第三点中选择制备阴离子型纳米银溶液的主要原因。

附图说明

图1为两亲生物碳材料的扫描电镜图，a为两亲生物碳材料(acps)，b为负载肝素的两亲生物碳材料(acps-hep)，c为负载纳米银的两亲生物碳材料(acps-ag)。从a图中可以看出acps为椭圆球状颗粒，表面略粗糙，b也同样为椭球颗粒，表明修饰肝素后acps的表面没有明显变化，而c为acps-cs负载聚乙烯磺酸钠修饰的纳米银(pvs-ag)之后的扫描图，表面上带有部分小颗粒，说明pvs-ag在acps-cs表面的成功接枝。

图2为不同浓度的聚乙烯磺酸钠修饰的纳米银(pvs-ag)的紫外-可见吸收光谱图。图中可以看出在pvs-ag在397nm有最大吸收峰，与文献报道相符。

图3为zeta电位图。其中曲线a为两亲生物碳材料acps，曲线b为壳聚糖修饰的两亲生物碳材料acps-cs，曲线c为负载纳米银的两亲生物碳材料acps-ag，三种材料表面带电情况及大小依次为：-38.0mv，+36.1mv，-53.1mv。

图4为负载纳米银的两亲生物碳材料(acps-ag)的两亲性分析图，结果表明acps-cs和acps-ag两种材料在不同极性的h2o，dmf，chcl3中均可均匀分散，表明制备的acps-cs和acps-ag具有两亲性。并且上述两种材料可以分散在两种不同极性的溶剂中，最终分散在油水界面。证明cs共价接枝到acps表面以及pvs-ag修饰在acps-cs表面上后，并不影响材料的两亲性。

图5为负载纳米银的两亲生物碳材料(acps-ag)的抗菌效果图。选择革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌、真菌白色念珠菌以及耐药菌耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌为研究。由图可知，acps-ag对这四种细菌的最低抑菌浓度为3.0μgml^-1左右。

图6.负载肝素的两亲生物碳材料的zeta电位图。其中曲线a为两亲生物碳材料acps，曲线b为壳聚糖修饰的两亲生物碳材料(acps-cs)，曲线c为负载纳米银负载的两亲生物碳材料(acps-hep)，三种材料表面带电情况及大小依次为：-38.0mv，+36.1mv，-48.7mv。

图7.为负载肝素的两亲生物碳材料(acps-hep)的两亲性分析图。结果表明acps-hep材料在不同极性的溶剂中均能够均匀的分散，制备的acps-hep材料跟acps一样既亲水又亲油。在不同极性的两种溶剂中，acps-hep材料能够分散于水油界面。因此，可以证明在acps-cs表面共价接枝上肝素后，并不影响acps-cs的两亲性。

图8为复合物膜照片。a、b、c、d、e、f分别为tpu、tpu/acps、tpu/acps-cs、tpu/acps-ag、tpu/acps-hep和tpu/acps-ag/acps-hep复合膜，由图可以看出功能化两亲性生物碳材料材料都可以均匀的分散于tpu基质中，并形成均匀稳定的膜。

图9.五种不同膜的接触角图片。a、b、c、d、e、f分别为空白膜、tpu/acps膜、tpu/acps-cs膜、tpu/acps-ag膜、tpu/acps-hep膜以及tpu/acps-ag/acps-hep复合膜的接触角图片。

图10为不同acps添加量的复合物膜的力学性质。随着acps在tpu基质中浓度的增加，膜的拉伸强度和断裂伸长率整体呈现先逐渐升高后逐渐降低的趋势，在浓度为3.0wt.％时拉伸强度处于最优状态，在浓度为4.0wt.％时断裂伸长率处于最优状态。因此后期应用时可以根据应用领域的不同在tpu膜基质中添加不同浓度的功能化生物碳材料，图中看出在浓度不超过5.0wt.％的情况下，不会影响tpu基质的力学性能。

图11.复合膜抗菌实验结果。表示复合膜与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和耐药金黄色葡萄球菌接触后的上清液抗菌细菌存活率图，各图中a、b、c、d、e和f分别表示tpu膜、tpu/acps膜、tpu/acps-cs膜、tpu/acps-hep膜、tpu/acps-ag以及tpu/acps-ag/acps-hep复合膜的复合膜上清液的细菌生长情况，表明tpu/acps-ag膜对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和耐药金黄色葡萄球菌具有较强杀菌能力。

图12.复合膜抗血小板粘附结果。a，b，c，d，e，f分别代表空白膜，tpu/acps-cs膜，tpu/acps-ag膜，tpu/acps-hep膜,1％的tpu/acps-ag/acps-hep膜和3％的tpu/acps-ag/acps-hep膜，表示六种膜分别与血液接触3h后血小板在膜上的粘附情况。表明随着acps-hep含量的增加，抗血小板粘附作用增强。

图13.制备的新型硅橡胶导尿管实物。空白对照硅橡胶导尿管(a)，添加acps的硅橡胶导尿管(b)以及添加acps-ag和acps-hep的硅橡胶导尿管(c)。

图14.硅橡胶导管抗菌实验结果。空白对照硅橡胶导尿管(a)，添加acps的硅橡胶导尿管(b)以及添加acps-ag和acps-hep的硅橡胶导尿管(c)。表明添加acps-ag和acps-hep的硅橡胶导尿管对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和耐药金黄色葡萄球菌具有较强杀菌能力。

图15.硅橡胶导管抗血小板黏附结果，分别代表空白对照硅橡胶导尿管(a)，添加acps的硅橡胶导尿管(b)以及添加acps-ag和acps-hep的硅橡胶导尿管(c)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作详细描述：

实施例1

(1)两亲生物碳材料(acps)的制备：称取50.0g啤酒酵母细胞，加入200ml去离子水使其分散均匀，室温静置10min，去除液体表面的杂质漂浮物滤掉，将上层分散液以8000rpm离心3min，然后弃去上清液，并且向下层的沉淀物中加入丙酮后用玻璃棒充分搅拌至其均匀分散，之后用玻璃棒充分搅拌至其均匀分散，然后置于摇床振摇20min，再次离心并加丙酮均匀分散重复两遍上述操作，除去酵母细胞内容物；而后用去离子水清洗三遍，去掉残留的丙酮溶剂。最后将沉淀物加入到先前配制好的2％戊二醛-磷酸缓冲溶液中并分散均匀，最后倒入反应釜中在180℃水热反应12h，反应完全后待温度降至室温后取出，用吸管吸取上层漂浮的杂质弃去，下层沉淀物则利用去离子水进行分级清洗至烧杯底部无黑色杂质，离心均匀分散的混合液，弃去上清，将沉淀真空干燥得到黄色细粉记为acps备用。

(2)壳聚糖修饰的两亲生物碳材料(acps-cs)的制备：称取上步合成的acps150mg，将其超声分散在40mlph5.3磷酸缓冲溶液中，分别称取活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺各100mg混合溶解在10mlph5.3磷酸缓冲溶液中，然后将上述两溶液混合摇匀，室温条件下于摇床上以180rpm的转速活化羧基反应2h，另取壳聚糖200mg并将其完全溶解在1％的醋酸水溶液中备用，将活化羧基后的acps和完全溶解的壳聚糖溶液混合，室温条件下于摇床上以180rpm的转速反应过夜，离心保留下层沉淀物，然后分别用1％的醋酸水溶液清洗两遍并离心，以去掉残留的过量壳聚糖，去离子水清洗两遍并离心，以去掉残留的醋酸溶液，无水乙醇清洗一遍并离心，最后将得到的下层沉淀真空干燥得到浅黄色细粉记为acps-cs备用。

(3)聚乙烯磺酸钠修饰的纳米银(pvs-ag)的制备

精密称定硝酸银16.9mg，加入到100ml棕色锥形瓶中避光，加入46ml去离子水超声至完全溶解，300rpm磁力搅拌，使用移液枪取10μl20％wt聚乙烯磺酸钠(pvs)水溶液加入到2ml去离子水中涡旋分散均匀后使用一次性吸管逐滴加入到上述硝酸银溶液中，搅拌20min。称取硼氢化钠3.78mg，用2ml去离子水溶解完全后，以10秒每滴的速度加入到上述反应体系中，溶液颜色由无色迅速变为黄褐色，磁力搅拌5h。即可得到由pvs包覆的纳米银溶液，记为2mmoll^-1的pvs-ag备用。将此pvs-ag胶体溶液密封并在黑暗条件下室温存储可稳定保存数月。

(4)负载纳米银的两亲生物碳材料(acps-ag)的制备：精密称取干燥备用的acps-cs材料60mg于40ml离心管中，加入36ml上述pvs-ag溶液，在室温下避光振荡反应8h，反应结束后，8000rpm离心3min，弃上清液，用去离子水清洗离心直至洗液变为无色，60℃真空干燥6h，即可得到负载纳米银的两亲性生物碳材料保存备用，记为acps-ag。

(5)负载肝素的两亲生物碳材料(acps-hep)的制备：称取25mg肝素钠溶解至50mlph5.3磷酸缓冲溶液中，分别加入50mg活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺活化羧基，反应时间为1h。之后称取50mg干燥的acps-cs材料置于40ml离心管中，加入30ml上述经活化的肝素钠溶液，在4℃下避光振荡反应24h，反应结束后，8000rpm离心3min，弃去上清液，然后用去离子水清洗离心直至洗液变为无色，除去未负载到acps-cs材料表面的hep，无水乙醇清洗一次，在60℃条件下真空干燥6h，即可得到负载肝素的功能化两亲性生物碳材料保存备用，记为acps-hep。

(6)复合物膜的制备取4.95g热塑性聚氨酯弹性体橡胶(tpu)于避光棕色玻璃瓶中备用，再分别称取25mg的acps-ag和acps-hep两亲生物碳微粒加入到另一玻璃瓶中，随后加入n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，超声分散均匀后加入到上述含有tpu的棕色玻璃瓶中，封口并磁力搅拌5h，然后吸取5ml上述tpu与材料的混合液倾至底部平整、直径为40mm的培养皿中，平铺均匀，通过抽真空除去表面的气泡，用扎了孔的保鲜膜封口(此步骤的目的是防止空气中的杂质落入皿中，同时减慢溶剂的挥发速度，以便形成薄厚较为均一的膜)，然后55℃干燥6h后，用镊子轻轻的将形成的tpu薄膜取出，即得tpu/acps-ag/acps-hep复合膜，复合物膜放置于4℃冰箱中保存备用。

对于上述实验结果，本发明分别通过测定两亲生物碳材料的扫描电镜、zeta电位、热重分析法等方法进行验证。

本实施例采用血浆再钙化时间实验测定负载肝素的两亲生物碳材料(acps-hep)的抗凝血性，结果如下：

实验阴性对照组生理盐水、acps、acps-cs和acps-ag分别表现为血浆再钙化时间，时间较短，说明其作为对照组不具备抗凝作用。在acps-hep浓度达到3.0mgml^-1时，和0.1mgml^-1的阳性对照肝素钠溶液有相同的抗凝结果，由此可见，acps-hep具有较强的抗凝作用。

实施例2制备tpu/acps-ag/acps-hep抗菌硅橡胶导尿管

1、制备抗菌硅橡胶导尿管

分别称取25mg的acps-ag和acps-hep两亲生物碳微粒，按照质量分数1:100的比例加入到5g硅橡胶液中，充分混合均匀。之后按照常规导尿管的制备工艺制成新型抗菌导尿管。

2.对acps-ag/acps-hep抗菌硅橡胶导尿管的抗菌抗凝性质进行验证。抗菌结果如图14，acps-ag/acps-hep抗菌硅橡胶导尿管对金葡菌、大肠杆菌、白色念珠菌以及耐药金葡菌均有良好的抗菌效果；抗凝结果如图15，acps-ag/acps-hep抗菌硅橡胶导尿管有较强的抗血小板粘附性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，在不背离本发明精神及其实质的情况下，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明所附的权利要求的保护范围之内。