一种含青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法与应用与流程

本发明涉及医药材料技术领域，尤其涉及一种含青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法与应用。

背景技术：

癌症是已经成为全球范围内危害人类生命健康的主要杀手之一，尽管随着现代医学的不断发展，癌症诊疗技术已经取得了显著进步，但癌症的发病率和死亡率仍然居高不下。化疗，一种通过使用化学治疗药物杀灭癌细胞达到治疗目的的治疗方法，是目前治疗癌症最有效的手段之一。然而，目前的化疗药物主要以化学合成药物为主，价格昂贵，并且肿瘤靶向性差，对正常组织的毒副作用大，大大限制了其治疗效果。因此，亟需发展低毒、高效并且能够响应特定肿瘤微环境，实现肿瘤精准靶向治疗的新技术。

与化学药物不同，从天然植物提取和筛选出来的天然药物表现出减少的毒副作用，受到人们的广泛关注。青蒿素(artemisinin)，一种从菊科植物黄花蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯类化合物，是世界公认的抗疟特效药，具有速效和低毒的特点。近年国内外研究发现，青蒿素及其衍生物对多种类型的癌细胞系具有明显的抑制作用，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，且对正常组织细胞几乎无毒性，在抗肿瘤方面有着良好的应用前景。

然而，青蒿素及其大多数衍生物水溶性差、生物利用度低等问题阻碍了青蒿素类药物的临床应用。此外，肿瘤微环境的高还原性特性进一步降低了青蒿素类药物的治疗效果。

随着纳米医学和纳米生物技术的高速发展，近年来基于纳米材料的纳米药物载体受到越来越多的关注。研究表明，使用设计的纳米载体输送疏水性青蒿素类药物，可有效提高其水溶性及其生物相容性，并通过增强渗透和保留效应改变药物在体内的分布，使其在肿瘤病灶高效富集，提高其生物利用度。目前，已有使用介孔二氧化硅、c60等纳米载体负载青蒿素类药物的报道。但是目前公开的负载青蒿素的复合材料的抗肿瘤效果还不是很好，如果提高青蒿素的抗肿瘤效果具有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种含青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法与应用，本发明提供的复合材料能够有效的提高青蒿素的抗肿瘤效果。

与现有技术相比，本发明提供了一种含青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法和应用，本发明提供的纳米复合材料包括内核和外壳；所述内核为负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子；所述外壳为二氧化锰壳层，通过实验发现，本发明提供的纳米复合材料可实现肿瘤微环境响应的可控药物释放与激活，降低对正常组织的毒副作用，同时还可以增强青蒿素的抗肿瘤效果，且具有良好的水溶性及生物相容性；此外，本发明提供的该纳米复合材料的制备方法制备的复合材料尺寸径均一，可高效负载青蒿素类药物，也解决青蒿素类药物在制备抗肿瘤药物中的溶解度差及生物利用度低的问题，且制备工艺简单，易于实现工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1各步骤所得样品的tem图；

图2为dha及本发明实施例1中制备的hpda、hpda@mno2及dha@h-pda@mno2的红外光谱图；

图3为本发明实施例2纳米复合材料不同ph值条件下dha及mn2⁺的释放曲线；

图4为本发明实施例3纳米复合材料消耗谷胱甘肽的曲线图；

图5为本发明实施例4纳米复合材料对肿瘤细胞及正常细胞的细胞毒性对比柱状图；

图6为本发明实施例5中对照组、dha、h-pda@mno2及dha@h-pda@mno2组活体治疗过程的小鼠体重变化图；

图7为本发明实施例5中对照组、dha、h-pda@mno2及dha@h-pda@mno2组活体治疗过程的肿瘤体积变化图及治疗后的肿瘤照片。

具体实施方式

本发明提供了一种含青蒿素类药物的纳米复合材料，该纳米复合材料包括内核和外壳；所述内核为负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子；所述外壳为二氧化锰壳层。

按照本发明，所述青蒿素类药物为青蒿素、双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯中的一种或多种；所述中空聚多巴胺纳米粒子为中空多孔结构；所述中空聚多巴胺纳米粒子的粒径优选为50～300nm，更优选为150～250nm；所述含青蒿素类药物的纳米复合材料颗粒的粒径优选为50～300nm，更优选为150～250nm；本发明中，本发明对中空聚多巴胺纳米粒子负载青蒿素的量没有特别要求，本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的担载量；本发明对外壳二氧化锰壳层的厚度也没有特殊要求，只要能完全包覆内核即可。

本发明还提供了一种本发明所述的含青蒿素类药物的纳米复合材料的制备方法，包括：

1)在中空聚多巴胺纳米粒子上负载青蒿素类药物，得到负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子；

2)在负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子的表面通过原位还原高锰酸钾来包覆二氧化锰壳层，得到含青蒿素类药物的纳米复合材料。

按照本发明，本发明首先在中空聚多巴胺纳米粒子上负载青蒿素类药物，得到负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子；其中，所述负载具体为向中空聚多巴胺-有机溶剂分散液中加入青蒿素类药物，加热挥发溶剂，然后缓慢滴加超纯水，搅拌，离心得到负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子；其中，挥发溶剂为挥发大部分的溶剂，但不是全部，本领域技术人员可以根据实际实验情况选择合适的挥发量；所述有机溶剂优选为丙酮、氯仿和乙醇中的一种或几种，优选为丙酮；所述青蒿素类药物优选为青蒿素、双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯中的一种或几种，更优选为双氢青蒿素；所述中空聚多巴胺纳米粒子与双氢青蒿素的的质量比为(3～10)∶(4～20)。

本发明中，所述中空聚多巴胺纳米粒子按照以下方法制备得到：

1-1)将盐酸多巴胺溶液、硅源和氨水混合反应，得到聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子；其中，所述硅源为正硅酸乙酯；所述盐酸多巴胺溶液的溶剂为水和乙醇的混合溶液；具体的，为了使反应更顺利的进行，本发明优选将盐酸多巴胺溶于10～100ml超纯水中，再加入15～200ml乙醇，并搅拌10～60分钟使混合均匀；在连续搅拌或超声条件下向上述溶液中滴加0.2～1.5ml正硅酸乙酯，在20～37℃条件下搅拌10～60分钟；接着向所得溶液中滴加入1～6ml氨水，在20～37℃条件下搅拌15～30小时。9000～12000rpm离心8～12min收集并洗涤沉淀，25～60℃真空烘干，得聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子。

1-2)将聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子、溶剂和氢氟酸溶液混合反应，得到中空聚多巴胺纳米粒子；其中，所述溶剂为水；所述氢氟酸溶液的浓度为3～8wt％，更优选为5～6wt％；所述反应为室温反应，所述反应的时间为4～6小时；更具体的，所述反应为：将20-100mg所得聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米粒子重新分散于5-25ml超纯水，连续搅拌条件下加入2-10ml5％hf反应4-6h。9000-12000rpm离心8-12min收集并用超纯水洗涤沉淀2-3次，25-60℃真空烘干，得中空聚多巴胺纳米粒子。

按照本发明，本发明还在负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子的表面通过原位还原高锰酸钾来包覆二氧化锰壳层，得到含青蒿素类药物的纳米复合材料，其中，所述原位还原高锰酸钾所用的还原剂为硫酸溶液、聚乙二醇、聚丙烯胺盐酸盐溶液和吗啉乙磺酸钠盐溶液中的一种或几种，优选为硫酸溶液；所述硫酸溶液的浓度优选为0.8～1.2m，更优选为1m；加入体系中的高锰酸钾为高锰酸钾的水溶液；所述高锰酸钾水溶液的浓度为25～35mm，更优选为30mm；具体的，所述原位还原的步骤为：将负载青蒿素类药物的中空聚多巴胺纳米粒子分散于5～20ml超纯水中；在搅拌条件下向上述溶液中加入0.5～4ml30mmkmno4溶液，然后迅速加入0.03～0.15ml1mh2so4溶液，继续搅拌1～3分钟后离心收集沉淀，并用超纯水洗涤2～3次，得到中空聚多巴胺/二氧化锰负载青蒿素的纳米复合材料(art@hpda@mno2纳米复合材料)。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括本发明所述的含青蒿素类药物的纳米复合材料。

本发明公开了一种中空聚多巴胺/二氧化锰负载青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法和应用，本发明提供的含青蒿素的抗肿瘤药物解决了现有青蒿素类药物溶解度差及生物利用度低的问题，还可以实现肿瘤微环境响应的可控药物释放与激活，降低对正常组织的毒副作用，同时可以调节肿瘤微环境以显著增强化疗效果，可应用于制备高效低毒的抗肿瘤药物。此外，本发明所述方法中，首先以sio2为模板，通过氢氟酸刻蚀制备中空聚多巴胺纳米粒子(hpda)；然后负载青蒿素类药物(art)，最后通过原位还原高锰酸钾在art@hpda表面包覆mno2壳层，得到art@hpda@mno2纳米复合材料；使得得到的复合材料尺寸均一，具有良好的水溶性及生物相容性，且制备工艺简单，成本低廉，适合工业化生产。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

中空聚多巴胺/二氧化锰负载青蒿素类药物的纳米复合材料的制备，包括以下步骤：

1)sio2@pda纳米粒子的制备：100mg盐酸多巴胺溶于16ml超纯水，再加入40ml乙醇。搅拌状态下逐滴加入0.30ml正硅酸乙酯，室温条件搅拌10min后，加入1ml氨水，继续搅拌24h。10000rpm离心10min收集纳米粒子并用超纯水洗涤3次，25℃真空烘干，得到sio2@pda纳米粒子；

2)中空聚多巴胺(hpda)的制备：取50mg步骤(1)中制得的sio2@pda，均匀分散于10ml超纯水，搅拌状态下加入5ml5％hf反应5h。10000rpm离心10min收集纳米粒子并用超纯水洗涤3次，得到hpda纳米粒子；

3)hpda负载双氢青蒿素(dha)：取5mg步骤(2)制得的hpda溶于3ml丙酮，加入5mgdha，37℃水浴下搅拌约5h使大部分溶剂挥发，而后逐滴缓慢加入3ml超纯水，继续搅过夜。10000rpm离心除去未负载的dha，分别用乙醇、水洗涤，收集全部上清液用紫外分光光度计测量在290nm处的吸收峰来测量dha负载率；

4)hpda@mno2的制备：将骤(2)制得的hpda溶于10ml超纯水，搅拌状态下加入2ml30mmkmno4溶液，待混匀后迅速加入0.05ml1m硫酸溶液，继续搅拌两分钟后10000rpm离心收集并用超纯水洗涤3次，得到hpda@mno2纳米粒子；

5)dha@hpda@mno2的制备：将骤(3)制得的dha@hpda溶于10ml超纯水，搅拌状态下加入2ml30mmkmno4溶液，待混匀后迅速加入0.05ml1m硫酸溶液，继续搅拌两分钟后10000rpm离心收集并用超纯水洗涤3次，得到dha@hpda@mno2纳米粒子；

结果如图1～图2所示：

图1为本发明实施例1各步骤所得样品的tem图，从图中可以看出，纳米复合材料dha@hpda@mno2为中空核壳结构，尺寸均一，粒径在200nm左右；

图2为dha及本发明实施例1中制备的hpda、hpda@mno2、dha@h-pda@mno2的红外光谱图，从图中可以看出，与hpda@mno2相比，负载dha后在吸收峰在3380cm^-1处出现dha的-oh特征峰，在800-900cm^-1出现dha的-o-o-特征峰，证明dha成功负载，通过紫外分光光度仪测得负载率为68.4％；

实施例2：

中空聚多巴胺/二氧化锰负载青蒿素类药物的纳米复合材料的应用于肿瘤微环境响应的可控药物释放与激活，包括以下步骤：

将实施例1中所得的dha@hpda@mno2纳米复合材料分别溶于ph7.4、ph6.5和ph5.0的pbs缓冲液中以分别模拟正常细胞环境，肿瘤酸性微环境和溶酶体环境；所得分散液在37℃下搅拌，在不同时间点进行离心，收集上清液；分别通过紫外紫外分光光度计和电感耦合等离子体光谱仪检测上清液中dha和mn²⁺的含量。

如图3所示，图3为本发明实施例3纳米复合材料不同ph值条件下dha及mn²⁺的释放曲线，发现在肿瘤微环境及溶酶体的酸性ph值条件下dha和mn²⁺的释放量显著增加，ph5.5条件下，dha及mn²⁺在48小时的释放量分别高达约50％和80％，与此相比，在ph7.4条件下释放量均低于20％，说明dha@hpda@mno2纳米复合材料可选择性的在肿瘤微环境的酸性条件下释放出dha及mn²⁺，二者相互作用产生治疗效果，实现了可控药物释放与激活。

实施例3：

中空聚多巴胺/二氧化锰负载青蒿素类药物的纳米复合材料在应用于制备高效且低毒的制备抗肿瘤药物。通过以下步骤测定其对谷胱甘肽的消耗：

取0.1mg实施例1中所得的dha@hpda@mno2纳米复合材料，均匀分散在100μm的谷胱甘肽溶液中，37℃条件下培养不同时间后，离心收集上清液；上清液中加入5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，通过紫外分光光度计测量在412nm处的吸收峰得到上清液中谷胱甘肽的剩余量，从而计算出谷胱甘肽的消耗量。

如图4所示，图4为本发明实施例3纳米复合材料消耗谷胱甘肽的曲线图，发现纳米复合材料可有效消耗谷胱甘肽，反应6h后，消耗量大于50％；可以证明本发明所述的纳米复合材料可通过有效消耗谷胱甘肽改善肿瘤微环境的高还原性，降低肿瘤高还原性对青蒿素类药物产生的自由基等的消耗，从而有效提高治疗效果；

实施例4：

中空聚多巴胺/二氧化锰负载青蒿素类药物的纳米复合材料在应用于制备高效且低毒的抗肿瘤药物。通过mtt实验研究dha@hpda@mno2纳米复合材料的细胞毒性，选取hela细胞为肿瘤细胞模型细胞，l929细胞为正常细胞模型细胞，具体测试方法如下：

1)取对数生长期的hela细胞或l929细胞(1×10⁵/ml)加入到96孔细胞培养板中(0.2ml/孔)，将96孔板中的细胞放在5％co2、37℃二氧化碳培养箱培养，至细胞以单层形式铺满孔底；

2)将实施例1中所得的dha@hpda@mno2纳米复合材料用细胞培养基分散，配成不同浓度的分散液，溶液浓度分别为10、25、50/100、200g/ml，分别加入培养hela和l929细胞的96孔板中，细胞与材料在5％co2，37℃下孵育24小时，对照组不加样品；

3)培养结束后，吸去孔内培养液，小心用pbs洗2-3遍，洗去材料，然后每孔加0.1ml含mtt的培养液(0.5mg/ml)，终止培养，mtt与活细胞琥珀酸脱氢酶作用下形成不溶性的蓝紫色物质甲瓒沉积在细胞中；

4)4小时后每孔加入0.1ml二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10min，使甲瓒充分溶解。在酶标仪上检测570nm处的吸光度值，计算细胞的存活率。

如图5所示，图5为本发明实施例4纳米复合材料对肿瘤细胞及正常细胞的细胞毒性对比柱状图，发现纳米复合材料可有效杀伤肿瘤细胞，在200μg/ml的浓度条件下，可以杀伤80％以上的肿瘤细胞，而对正常细胞的毒性很小。可以证明本发明所述的纳米复合材料具有良好的生物相容性，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞毒副作用较小，是制备高效且低毒的抗肿瘤药物的理想材料；

实施例5：

中空聚多巴胺/二氧化锰负载青蒿素类药物的纳米复合材料在应用于制备高效且低毒的制备抗肿瘤药物。在活体水平检测所述纳米复合材料的抗肿瘤效果，包括以下步骤：

选取体重30-35g的雌性昆明鼠作为模型鼠；通过在小鼠的前肢皮下注射10⁶个鼠源宫颈癌细胞(u14)建立肿瘤模型，当肿瘤体积达到100mm³时，将小鼠随机分成四组，每组10只，分别静脉注射生理盐水，dha，hpda@mno2及dha@h-pda@mno2，dha@h-pda@mno2，每隔一天注射一次。每隔一天测量一次肿瘤直径及小鼠体重。肿瘤体积通过如下公式计算：体积＝肿瘤长度×肿瘤宽度²/2。在第15天将小鼠处死，将肿瘤剥离下来并称重，来评估肿瘤治疗效率。

如图6所示，图6为本发明实施例5中对照组、dha、h-pda@mno2及dha@h-pda@mno2组活体治疗过程的小鼠体重变化图，可以看出小鼠体重保持稳定，表明本发明所述纳米复合材料具有良好的生物相容性；

如图7所示，图7为本发明实施例5中对照组、dha、h-pda@mno2及dha@h-pda@mno2组活体治疗过程的肿瘤体积变化图及治疗后的肿瘤重量，可以看出与控制组相比dha组的肿瘤抑制效率有限，而dha@h-pda@mno2组肿瘤的生长几乎被完全抑制了；说明本发明所述的纳米复合材料有效地提高了青蒿素类药物的治疗效果。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。