虫草素在制备防治肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及虫草素在制备防治肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品中的应用。

背景技术：

肝脏缺血再灌注损伤(hepaticischemia-reperfusioninjury，hiri)是肝脏手术过程中常见的并发症之一，病理生理过程复杂，包含了器官缺血过程中的损伤及肝脏血流得到再灌注而产生的一系列损伤，是一种重要的临床病理过程。当各种原因导致的肝脏血流中断或不足使肝脏缺血，在恢复血供再灌注后，不仅不能使肝脏功能恢复，反而加重了肝细胞的功能障碍和结构破坏，缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury，iri)是影响肝切手术及肝移植预后的重要因素之一。由于缺血再灌注的疾病过程极为复杂，影响了基础研究向临床应用的转化。因此，如何有效减轻临床手术中iri将有助降低手术对肝脏功能的影响，是目前研究热点之一。

探讨hiri发病机制是寻找有效防治措施的前提。只有深入研究hiri的病理生理机制及相关信号通路，发现可通过药物处理的重要靶点，直接或间接的增强肝组织或肝细胞对iri的耐受能力，才能减轻损伤从而提高手术的安全性。iri是一个复杂的级联事件，目前已有的机制研究包括氧化应激、线粒体膜通透转换孔道、钙超载、hiri相关炎症因子、核转录因子、肝细胞凋亡、补体激活等，迄今对其发生机制尚无明确认识。其机制主要发生在肝脏缺血性损伤和炎症介导的再灌注损伤两个相互促进相互关联的过程，前者主要是肝脏实质细胞的损伤，后者主要是肝脏间质细胞(kupfer细胞(kcs)、白细胞、树突状细胞等)的损伤以及局部微循环的紊乱。在缺血期，血窦内皮细胞水肿，产生多种有害物质如氧自由基并激活kcs等炎症细胞。激活的kcs进一步促进氧化反应，释放大量的促炎因子。这些促炎因子在移植后可引起血管周围中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润。因此，iri病理生理过程主要是由肝脏固有免疫细胞识别受体介导的炎症反应过程。先天免疫系统，如补体、细胞因子、趋化因子、中性粒细胞和巨噬细胞均参与了hiri。hiri的损伤机制有诸多因素参与，既相互制约又相互促进。

补体的过度激活会直接或间接地导致机体自身损伤，许多实验研究证明，补体异常激活是hiri的重要病理特征之一，因此，采取有效的干预措施减轻补体激活程度，可减轻肝细胞的损伤，是防治hiri的一个重要策略。补体体系统(complementsystem)是人和脊椎动物血清及体液中的一组具有酶活性的蛋白质，是机体内重要的效应与效应放大系统，可参与机体的特异性和非特异性免疫机制，同时介导炎性反应，导致组织细胞损伤。marshall等发现，小鼠全肝缺血30分钟，再灌注24小时后，肝组织中的补体c3a、c5a、攻膜复合体(mac)蛋白显著增加(marshallkm,hes,zhiz,atkinsonc,tomlinsons.dissectingthecomplementpathwayinhepaticinjuryandregenerationwithanovelprotectivestrategy[j].jexpmed,2014,211(9):1793-1805)。当补体系统被激活，会形成一系列的级联放大反应。

补体的过度激活可通过一类补体调节蛋白来调节，减轻机体的免疫损伤。补体调节蛋白主要有可抑制c3转化酶活性的补体受体(如cr1，cr2)，可抑制c3和c5转化酶活性的衰变加速因子(daf)，啮齿类动物的crry蛋白，特异性抑制旁路途径的fh，以及特异性与c8、c9结合破坏mac的cd59。在补体治疗疾病的研究中，学者利用融合的补体调节蛋白(cr2-crry，cd59-2a-crig)以提高补体抑制效果。补体激活会加重iri的程度，但是补体的缺乏又会影响术后肝再生，因此产生了“补体双向作用”观点。有研究表明，缺乏补体c3和c5基因小鼠对iri的损伤敏感性明显降低，但是较正常小鼠，肝切除缺乏补体c3和c5基因的小鼠出现严重的肝再生障碍，早期补充c3a和c5a可以恢复术后肝再生能力。目前临床上尚无高效、低毒、专一的补体抑制剂。

虫草素(cordycepin)即3’-脱氧腺苷(3’-deoxyadenosine)，是蛹虫草的主要活性成分，是一种核苷类似物，因此能够参与如基因表达、嘌呤合成等多种生化反应，进而影响细胞周期、血小板凝集、炎症反应、肿瘤转移等生理、病理进程，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、清除氧自由基和免疫调节等作用。

目前为止，虫草素调控补体系统减轻小鼠hiri的研究未见报到。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种虫草素新的医药用途，具体是提供虫草素在制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品，所述的药物或保健品是以虫草素作为唯一活性成分，或以包含虫草素的药物组合物作为活性成分。所述的药物添加药学上可接受的辅料制成临床应用的药物制剂。

优选，所述的药物制剂包括口服制剂或注射制剂。所述的口服制剂包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、混悬剂等，所述的注射制剂包括输液、注射剂等。

本发明首次公开虫草素对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，其可用于制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品。经试验证明，一定浓度的虫草素可以调控补体系统的异常激活，减轻小鼠全肝缺血再灌注损伤，对缺血再灌注(ischemia-reperfusion，ir)引起的肝功能损伤有保护作用，降低ir引起的肝细胞肿胀、变性和淤血。补体系统是生物体的第一道防御体系，虫草素调控补体系统的平衡在保护肝功能和调节生理代谢紊乱中具有重要的作用。

附图说明

图1是小鼠全肝缺血再灌注手术。其中，a为小鼠全肝缺血阻断后肝脏和胃肠的状态；b为小鼠全肝再灌注后肝脏和胃肠的状态。

图2是虫草素降低全肝缺血再灌注损伤(thiri)小鼠血清中alt、ast水平(n＝6－8)。其中，sham：假手术组，cor-sham：虫草素假手术组，thiri：全肝缺血再灌注组，cor-thiri-5：5mg/kg虫草素处理的thiri组，cor-thiri-10：10mg/kg虫草素处理的thiri组，cor-thiri-20：20mg/kg虫草素处理的thiri组。*，**，***，****分别表示与sham组比较p＜0.05，＜0.01，＜0.001，＜0.0001；#，##，###，####分别表示与thiri组比较p＜0.05，＜0.01，＜0.001，＜0.0001。

图3是虫草素降低全肝缺血再灌注损伤(thiri)小鼠血清中补体c3a水平(n＝6－8)。其中，sham：假手术组，cor-sham：虫草素假手术组，thiri：全肝缺血再灌注组，cor-thiri-5：5mg/kg虫草素处理的thiri组，cor-thiri-10：10mg/kg虫草素处理的thiri组，cor-thiri-20：20mg/kg虫草素处理的thiri组。*，**，***，****分别表示与sham组比较p＜0.05，＜0.01，＜0.001，＜0.0001；#，##，###，####分别表示与thiri组比较p＜0.05，＜0.01，＜0.001，＜0.0001。

图4是虫草素对全肝缺血再灌注损伤(thiri)小鼠肝脏组织形态的影响(×200)。其中，a：sham组，b：cor-sham组，c：thiri(全肝缺血再灌注组)，d：cor-thiri-5组(5mg/kg虫草素处理的thiri组)，e：cor-thiri-10组(10mg/kg虫草素处理的thiri组)，f：cor-thiri-20组(20mg/kg虫草素处理的thiri组)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1、实验动物

雄性野生型c57bl/6小鼠，8至10周龄，20克左右。随机分组，每组6-8只，正常喂养。

2、动物模型的建立和分组

假手术组(sham)：正常喂养，腹腔注射生理盐水7天。在手术时仅行麻醉、剖腹，只牵拉分离肝组织，其他过程与thiri组相同。

虫草素假手术组(cor-sham)：正常喂养，连续腹腔注射10mg/kg虫草素7天。手术麻醉前15分钟，注射一次10mg/kg虫草素。在手术时仅行麻醉、剖腹，只牵拉分离肝组织，其他过程与thiri组相同。

全肝缺血再灌注组(thiri)：正常喂养，腹腔注射生理盐水7天。在手术时，腹腔注射戊巴比妥麻醉，固定动物，常规脱毛，碘伏棉球消毒。自剑突至耻骨上1cm沿腹正中线依次剪开皮肤、肌肉、进入腹膜。血管钳妥善止血的同时将切口以上腹壁组织向外上方牵拉，充分暴露隔下间隙和腹腔。尽量不直接接触肝脏表面，棉棒轻轻拨开肝组织，分离肝脏周围的镰状韧带和左右三角韧带，游离出肝左、中、右叶。将肝脏牵向左向上翻起，棉棒游离右下叶与后腹膜间的联系，用微型无损伤血管夹夹住肝蒂阻断肝动脉、门静脉和胆总管，即进入全肝缺血阶段。开始记时，用温热生理盐水纱布覆盖切口，并置小鼠于37℃环境。30分钟后松开血管夹，恢复入肝血流，记时，逐层关腹，小鼠置37℃环境。再灌注6小时后，取门静脉血以及生理盐水灌肝后取肝组织。

小鼠全肝缺血再灌注手术见图1。当微型无损伤血管夹夹住肝蒂阻断肝动脉、门静脉和胆总管(小鼠全肝缺血阻断)后可见整个肝脏颜色逐渐变暗，呈灰暗色缺血改变，胃肠处于淤血状态呈暗红色(图1a)。小鼠全肝缺血30分钟后，进入再灌注阶段。此时可见肝脏、胃肠逐渐充盈，肝脏从灰白色变红色但仍明显可见损伤(肝脏表面颜色不均，有褐色斑块)，胃肠暗红色变为鲜红色，说明肝脏再灌注成功(图1b)。在缺血和再灌注过程，肝细胞发生了各种病理变化，肝功能受损。

虫草素全肝缺血再灌注组(cor-thiri)：正常喂养，连续腹腔注射虫草素(10mg/kg)7天。手术麻醉前15分钟，再注射一次10mg/kg的虫草素，所行手术与thiri组一致。cor-thiri组中虫草素的浓度分3组，分别为5mg/kg(cor-thiri-5)，10mg/kg(cor-thiri-10)，20mg/kg(cor-thiri-20)。

3、肝脏功能的判定：取小鼠血液到1.5ml离心管，室温放置4小时，4000rpm离心5分钟，取上清到另一新管，全自动生化仪检测血清的各生化指标，包括ast(谷草转氨酶)、alt(谷丙转氨酶)的水平。

各组小鼠全肝缺血30分钟再灌注后6小时后，血清alt和ast水平见图2。与假手术组(sham组)比较，小鼠全肝缺血30分钟再灌注(thiri组)后6小时后，血清alt和ast都显著升高(2～3倍)，说明全肝缺血再灌注会严重破坏小鼠的肝功能。从图2可知：cor-sham组与sham组相比，sham组中的小鼠无论是否经虫草素(10mg/kg)处理，小鼠血清中的alt和ast水平都没有发生明显变化，说明适量浓度虫草素是不会引起肝功能损伤的；thiri组与sham组相比，ast和alt均显著增加(p＜0.0001)，说明肝功能损伤严重；经虫草素处理后再行全肝缺血再灌注处理(cor-thiri组)，无论虫草素浓度大小，alt和ast都无法完全恢复；与thiri组比，只有较高浓度处理的虫草素(20mg/kg)组(cor-thiri-20)的小鼠，其alt和ast均显著降低(p＜0.01)，低浓度虫草素(5mg/kg或10mg/kg)组(cor-thiri-5组或cor-thiri-10组)的小鼠alt和ast都有一定水平的降低，但总体数值仍然较高，说明只有合适浓度的虫草素对hiri才有一定的保护作用。

4、补体激活的水平：各组小鼠全肝缺血30分钟再灌注6小时后，麻醉取血，取适量的血清，按elisa试剂盒说明进行血清补体c3a水平检测，结果见图3。

由图3可知，sham组中的小鼠，无论是否进行虫草素(10mg/kg)处理，补体c3a没有发生明显变化，说明适量的虫草素不是引起补体变化的因素；小鼠在全肝缺血再灌注时(thiri组)，血清中的补体c3a水平明显高于sham组(p＜0.0001)，说明肝脏ir引起补体系统异常激活；经虫草素处理的小鼠再进行全肝缺血再灌注，无论虫草素浓度大小，血清中的补体c3a水平均降低；与thiri组相比，低浓度的虫草素降低ir激活的c3a水平不明显，只较高浓度(10mg/kg，20mg/kg)的虫草素才表现出对补体异常激活的抑制效果(p＜0.05，p＜0.01)，而且在适量浓度情况下，虫草素浓度越高对补体异常激活的抑制效果越好。

5、肝脏组织病理学：各组小鼠全肝缺血30分钟再灌注6小时后，麻醉处死，取新鲜肝组织进行苏木精—伊红染色(he)染色。取小鼠新鲜肝组织固定于4％多聚甲醛24～48h，后进行脱水和石蜡包埋。蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚5μm；切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片20min以防脱片。石蜡切片进行常规he染色，结果见图4。

由图4可知，sham组的小鼠无论是否注射虫草素都不影响肝组织的细胞结构。全肝缺血再灌注6h后，sham组和cor-sham组(虫草素假手术组)的肝脏组织结构清晰，无明显异常改变；thiri组(全肝缺血再灌注组)的小鼠肝细胞呈现明显的肿胀、坏死，肝纤维索断裂、溶解，肝窦淤血；三个不同浓度的虫草素处理组(cor-thiri-5、cor-thiri-10、cor-thiri-20)的小鼠病理损伤较thiri组明显减轻，部分肝细胞肿胀、变性，轻度肝窦淤血(图4)。结果说明全肝缺血30分钟再灌注后，即使在虫草素的处理下也不能完全恢复肝脏形态，但合适浓度的虫草素可以明显减轻缺血再灌注对肝细胞的损伤。

以上结果说明一定浓度的虫草素可以调控补体系统的异常激活，对ir引起的肝功能损伤有保护作用，降低ir引起的肝细胞肿胀、变性和淤血。补体系统是生物体的第一道防御体系，虫草素调控补体系统的平衡在保护肝功能和调节生理代谢紊乱中具有重要的作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。