一种产氧水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种产氧水凝胶及其制备方法和应用，属于药物制剂技术领域。

背景技术：

我国的癌症发病率和死亡率一直在上升，使癌症成为2010年以来的主要死因，也是我国的一个主要公共卫生问题，给人类生命健康的维系带来巨大威胁。为应对这一挑战，研究开发了多种治疗手段，如手术治疗、化学治疗、放射治疗、基因治疗、生物疗法、光疗以及免疫治疗等。在目前已有的治疗方式中，由于低毒性、高靶向性和无耐药性的特点，光动力治疗（photodynamictherapy，pdt）日渐成为一种具有前景的治疗方式，受到研究学者和临床医生的极大关注。光动力治疗使用特定波长的光激发光敏剂将能量传递给氧气并产生高活性的单线态氧，诱导肿瘤细胞凋亡坏死并损伤微血管。目前，大多数现有的光动力治疗系统具有高度的氧依赖性，并且需要消耗大量的氧气。然而，由于实体瘤内部肿瘤细胞的过度增殖和血液供应不足，实体瘤内的氧气浓度分布不均匀，一些内部区域的氧气浓度非常低，氧分压甚至小于5mmhg。肿瘤内的氧气不足导致光动力治疗的抗肿瘤效果显著降低，尤其是在需要进行多次光动力治疗的情况下。因此，肿瘤缺氧是光动力治疗受限制的关键所在。近年来，人们在克服低氧对光动力治疗的限制方面做了大量的努力。其中常用的策略为通过直接或间接升高光动力治疗之前、光动力治疗过程中和治疗后的肿瘤内氧气含量来提高其治疗效果。此外，对于局部缺氧病症如伤口感染、创面愈合、关节炎等，都需要通过补充氧气提高疗效。

因此，需要开发一种能够产氧的水凝胶，用于局部缺氧环境改善，以起到辅助治疗增加疗效的作用。

技术实现要素：

目的：本发明提供一种产氧水凝胶及其制备方法和应用，该产氧凝胶不仅能够用于肿瘤治疗，针对肿瘤缺氧微环境对化学治疗、放射治疗、光动力治疗等治疗方式产生的抗性，通过改善肿瘤微环境的缺氧，达到协同治疗的目的，在缺氧性相关疾病如伤口愈合、关节炎等方面，也具有极好的应用前景。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种产氧水凝胶，所述产氧水凝胶包括光合微藻和生物可降解的水凝胶，通过使用生物相容性良好的水凝胶包裹光合微藻形成产氧水凝胶；

水凝胶中的光合微藻利用光分解水进行产氧，增加局部产氧量，以改善所在部位的缺氧微环境。

作为优选方案，所述光合微藻选自小球藻（chlorellasp.）、蛋白核小球藻（chlorellapyrenoidosa）、普通小球藻（chlorellavulgaris）、椭圆小球藻（chlorellaellipsoidea）、聚球藻（synechococcussp.）、细长聚球藻（synechococcuselongatus）、小球衣藻（chlamydomonasmicrosphaera）中的一种或多种。

作为优选方案，所述水凝胶选自海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、明胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维蛋白凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种或多种。

更为优选的，所述光合微藻为小球藻（chlorellasp.）、蛋白核小球藻（chlorellapyrenoidosa），所述水凝胶选自海藻酸钠。

光合微藻作为一种古生物光合细菌，为单细胞自养光合绿藻，其叶绿体内分布有丰富的叶绿素a和叶绿素b，是一种很有前景的氧源。海藻酸盐是一种由α-l-古洛糖醛酸（g-嵌段）和β-d-甘露糖醛酸（m-嵌段）残基组成的天然多糖，具有粘附性，并且已经具有成熟的细胞包埋应用。通过钙交联方式将微藻包裹进入凝胶内部制备产氧凝胶。该产氧凝胶可以通过微创手术、注射、喷洒等方式植入肿瘤组织周围。在光照过程中，凝胶中的光合微藻利用光动力治疗的光分解水进行产氧，为光动力治疗提供大量氧气以产生足够的单线态氧，从而杀伤肿瘤组织并增强光动力治疗的疗效。由于海藻酸钠的保护，产氧凝胶在体内可以长时间保持供氧活性，满足光动力治疗重复治疗的要求。

根据本发明的另一方面，还提供所述产氧水凝胶的制备方法，包括：

步骤1）配置光合微藻培养基，灭菌，接入光合微藻藻种，静态培养，计数，浓缩，得光合微藻浓缩液；

步骤2）配置0.1~10%（w/v）的水凝胶溶液，灭菌；

步骤3）将水凝胶溶液与光合微藻浓缩液混合，形成水凝胶溶液与光合微藻浓缩液的混合溶液，进行制胶处理得到产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有海藻酸钠，制胶处理为：使用0.01~5%（w/v）氯化钙生理盐水溶液将水凝胶与光合微藻混合溶液进行钙交联得产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有透明质酸，制胶处理为：将水凝胶溶液与光合微藻浓缩液混合即得到产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有壳聚糖，制胶处理为：将壳聚糖溶液与光合微藻浓缩液混合，使用1%~2%（w/v）戊二醛交联得产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有琼脂糖，制胶处理为：0.1%~3%（w/v）的琼脂糖生理盐水溶液加热至90°c以上，冷却后与光合微藻浓缩液混合成为产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有明胶，制胶处理为：将明胶加热溶解，冷却后与光合微藻浓缩液混合成为产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有卡拉胶，制胶处理为：将卡拉胶加热溶解，冷却后与光合微藻浓缩液混合成为产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有羧甲基纤维素，制胶处理为：将羧甲基纤维素溶液与光合微藻浓缩液混合，使用agno3交联剂制备产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有纤维蛋白凝胶，制胶处理为：将纤维蛋白原和光合微藻浓缩液混合液与凝血酶溶液混合放置即为产氧水凝胶。

所述步骤3）中，当水凝胶中包括有聚丙烯酰胺凝胶，制胶处理为：5%~13%（w/v）的丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲基双丙烯酰胺=3：1）与小球藻浓缩液混合溶液加入引发剂即为产氧水凝胶。

进一步的，所述产氧水凝胶的制备方法，还包括：将产氧水凝胶进行清洗，常温保存或直接使用。

作为优选方案，所述产氧水凝胶的制备方法，光合微藻浓缩液中，光合微藻的含量为1×10⁵~1×10¹²个/ml；

每毫升水凝胶溶液与光合微藻浓缩液的混合溶液中，含有光合微藻数量为1×10⁵~1×10¹²个，含有水凝胶0.01~0.1g；

所述的水凝胶溶液与光合微藻浓缩液的体积比为0.1：1~10：1。

作为优选方案，所述光合微藻培养基的成分为：nano31.5g/l；k2hpo40.04g/l；mgso4·7h2o0.075g/l；cacl2·2h2o0.036g/l；柠檬酸0.006g/l；柠檬酸铁铵0.006g/l；edtana20.001g/l；na2co30.02g/l；a51ml/l；其中，a5溶液组分和浓度如下：h3bo32.86g/l；mncl2·4h2o1.86g/l；znso4·7h2o0.22g/l；na2moo4·2h2o0.39g/l；co(no3)2·6h2o0.05g/l，使用去离子水配制；

培养条件为：静态培养5~10天，每天给予12小时的光照和12小时的暗处理。

根据本发明的另一方面，还提供所述的产氧水凝胶在制备预防和/或治疗缺氧性相关疾病的药物中的应用。进一步的，所述缺氧性相关疾病包括：实体瘤、伤口愈合、关节炎。

有益效果：本发明提供的产氧水凝胶与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明创新性的提出了一种产氧水凝胶，通过增加治疗过程中肿瘤内部的氧气含量来增加光动力治疗疗效。在光动力治疗期间，光合微藻通过利用间隙二氧化碳和水产生大量的氧气，缓解肿瘤内部的缺氧环境，并促进光动力治疗的疗效。

2、使用微创手术、原位注射或喷洒的方式将该产氧水凝胶原位埋植于肿瘤周边，大大增加了局部氧气产生量，避免了传统递药体系静脉注射引起的低靶向问题，能够产生足量的氧气用于光动力治疗和缓解肿瘤缺氧。

3、该产氧水凝胶也可用于局部缺氧疾病的缺氧环境改善，如伤口感染、创面愈合、关节炎等。

附图说明

图1为实施例产氧水凝胶照片和光学显微镜下的局部放大照片。

图2为实施例产氧水凝胶在光照和黑暗条件下的产氧情况。

图3为实施例产氧水凝胶接受多次光照的产氧情况。

图4为实施例在缺氧和常氧条件下，给予细胞不同处理后的细胞生存率检测。

图5为实施例在肿瘤周围埋植产氧水凝胶前后的肿瘤内氧含量光声成像图。

图6为实施例产氧水凝胶植入肿瘤周围并接受光照后，在第1，3，5天肿瘤组织的缺氧免疫荧光染色图。

图7为实施例不同处理组小鼠肿瘤的生长曲线。

图8为实施例不同处理组小鼠肿瘤组织的解剖图。

图9为实施例不同处理组小鼠肺部转移情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。

本发明是通过以下的技术方案实现的，具体步骤如下：

配置光合微藻培养基，灭菌，接入光合微藻藻种，静态培养，计数，浓缩，得光合微藻浓缩液；配置3~10%（w/v）的水凝胶溶液，灭菌，将水凝胶溶液与光合微藻浓缩液按照体积比0.1：1~10：1比例混合，形成水凝胶溶液与光合微藻浓缩液的混合溶液。称取氯化钙配置成0.01%~5%（w/v）的氯化钙生理盐水溶液。取上述水凝胶溶液与光合微藻浓缩液的混合溶液与氯化钙生理盐水溶液中进行钙交联，得产氧水凝胶。

光合微藻培养基的成分为：nano31.5g/l；k2hpo40.04g/l；mgso4·7h2o0.075g/l；cacl2·2h2o0.036g/l；柠檬酸0.006g/l；柠檬酸铁铵0.006g/l；edtana20.001g/l；na2co30.02g/l；a51ml/l。其中，a5溶液组分和浓度如下：h3bo32.86g/l；mncl2·4h2o1.86g/l；znso4·7h2o0.22g/l；na2moo4·2h2o0.39g/l；co(no3)2·6h2o0.05g/l。培养条件为：静态培养5~10天，每天给予12小时的光照和12小时的暗处理。

上述产氧水凝胶，测定其具体表征。

上述产氧水凝胶在制备实体瘤药物治疗中的应用。产氧水凝胶的给药方式包括埋植在肿瘤周围、通过原位注射的方式植入肿瘤周围、将产氧水凝胶喷洒在肿瘤组织或手术切除部位。

产氧水凝胶接受的光照包括日光灯光源和具有组织穿透性的600~700nm的可见光。

实施例1

产氧水凝胶制备方案具体如下：

配置光合微藻培养基，121°c高压灭菌30分钟，接入蛋白核小球藻藻种，静态培养7天。每天给予12小时的光照和12小时的暗处理。在超净台内处理蛋白核小球藻，使用2500转每分钟转速离心浓缩收集蛋白核小球藻。稀释浓缩藻液，测量其在680nm处的紫外吸光度，计算微藻浓度。配置5%的海藻酸钠溶液，121°c高压灭菌30分钟后，将海藻酸钠溶液与蛋白核小球藻浓缩液按照体积比1：1比例混合，得到海藻酸钠和蛋白核小球藻混合溶液，称取氯化钙使用生理盐水配置成1%（w/v）的氯化钙生理盐水溶液。使用1毫升注射器将海藻酸钠和蛋白核小球藻混合溶液逐滴滴入氯化钙生理盐水溶液中进行钙交联，将所得钙交联后的产氧水凝胶进行清洗，得产氧水凝胶产品1。

光合微藻采用小球藻（chlorellasp.），水凝胶采用透明质酸，参考实施例1的制备方法，处理方法采用将灭菌后透明质酸溶液与光合微藻浓缩液混合制备得到产氧水凝胶产品2。

光合微藻采用聚球藻（synechococcussp.），水凝胶采用壳聚糖，参考实施例1的制备方法，处理方法采用将壳聚糖溶液与光合微藻浓缩液混合，使用1%~2%（w/v）戊二醛交联制备得到产氧水凝胶产品3。

光合微藻采用小球衣藻（chlamydomonasmicrosphaera），水凝胶采用聚丙烯酰胺凝胶，参考实施例1的制备方法，处理方法采用5%~13%（w/v）的丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲基双丙烯酰胺=3：1）与小球藻浓缩液混合溶液加入引发剂制备得到产氧水凝胶产品4。

光合微藻采用椭圆小球藻（chlorellaellipsoidea），水凝胶采用卡拉胶，参考实施例1的制备方法，处理方法采用将卡拉胶水溶液加热溶解后，冷却与小球藻浓缩液混合制备得到产氧水凝胶产品5。

实施例1制备的产氧凝胶产品1-产品5照片和光学照片如图1所示。该产氧凝胶为绿色球体，小球藻均匀分布在凝胶内部。

本实施例中，说明书中提到的水凝胶为生物相容性良好可体内代谢的凝胶材料，与上述实施例中海藻酸钠具有相同性质的凝胶材料，可用于替换使用；说明书中所提到的光合微藻，与本实施例中的蛋白核小球藻具有类似产氧能力的，可替换使用。

实施例2

产氧水凝胶的光照产氧情况。使用磷酸盐缓冲液作为测量介质，在搅拌状态下使用溶氧仪测量加入产氧水凝胶和不加入产氧水凝胶、给予光照和暗处理条件下的磷酸盐缓冲液中的氧气含量。光照为635nm可见光，光剂量为50mwcm^-2。图2为产氧水凝胶在光照和黑暗条件下的产氧情况。

实施例3

产氧水凝胶的重复产氧能力的检测。在黑暗条件下稳定溶氧仪示数，重复实施例2中加入产氧凝胶给予光照的实验步骤，重复四次，测量产氧凝胶在相同光照条件下的氧气产生量。图3为产氧水凝胶接受多次光照的产氧情况。

实施例4

产氧水凝胶协同光动力治疗的细胞生存率实验。将细胞在常氧和缺氧条件下与光敏剂共孵2小时，在加入和不加入产氧凝胶的条件下，给予光照30分钟后，于常氧条件下继续培养24小时，对细胞最终存活率进行检测。本实施例使用细胞噻唑蓝（mtt）染色，测定490nm处的吸光度并计算细胞生存率，实验结果如图4所示。

实施例5

使用光声成像检测产氧水凝胶增加肿瘤内部氧气含量的情况。使用接种200mm³肿瘤的小鼠用于光声成像检测。使用超声和氧气检测模式检测在产氧水凝胶埋植前，和在产氧水凝胶埋植、接受光照后肿瘤内部的氧气含量。图5为在肿瘤周围埋植产氧凝胶前后的肿瘤内氧含量光声成像图。

实施例6

产氧水凝胶长时间改善肿瘤缺氧微环境的检测。使用接种200mm³肿瘤的小鼠用于肿瘤免疫荧光染色。在小鼠肿瘤周围埋植产氧凝胶，在第1天，第3天和第5天，用635nm光照射肿瘤30分钟，手术切除小鼠肿瘤。使用缺氧探针对肿瘤组织切片进行免疫荧光染色，荧光较强区域为缺氧区域，荧光越亮表示缺氧越严重。图6为产氧凝胶植入肿瘤周围并接受光照后，在第1，3，5天肿瘤组织的缺氧免疫荧光染色图。

实施例7

使用产氧凝胶进行光动力治疗的小鼠体内实验。将产氧水凝胶埋植在小鼠肿瘤周围，通过尾静脉注射光敏剂。给药后4小时后对小鼠肿瘤部位给予光照，进行光动力治疗。每隔一天给予一次光动力治疗，一共3次。在实验过程中使用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，记录并统计。埋植产氧凝胶并给予光动力治疗的组别可以达到肿瘤组织的完全消融。图7为不同处理组小鼠肿瘤的生长曲线。

实施例8

小鼠肿瘤组织解剖图。在实施例7中所述实验结束后，取出小鼠肿瘤组织，对其进行拍照。图8为不同处理组小鼠肿瘤组织的解剖图。

实施例9

小鼠肺组织h&e染色结果。在实施例7所述实验结束后，取出小鼠肺组织，对其进行固定、包埋、切片和h&e染色。密集细胞团簇为转移的肿瘤结节。图9为不同处理组小鼠肺部转移情况。可以发现在埋植产氧凝胶给予光动力治疗后，小鼠肺组织基本没有肿瘤转移。

本实施例中使用海藻酸钠作为凝胶载体包裹蛋白核小球藻制备产氧凝胶，将其埋植在肿瘤组织周围。通过尾静脉注射光敏剂，药物蓄积在肿瘤部位后对肿瘤组织进行光动力治疗。埋植在肿瘤组织周边的产氧凝胶在接受光照后能够产生大量氧气改善肿瘤组织缺氧环境并提高光动力治疗疗效。同时由于凝胶的保护作用，该光合微藻能够长时间保持产氧活性，满足光动力治疗重复治疗的要求。此外，由于肿瘤微环境的改善和高效的光动力治疗，肿瘤组织的转移被成功抑制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。