一种修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒及制备与应用的制作方法

本发明属于纳米生物医药领域，具体涉及一种修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒及制备与应用。

背景技术：

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重要因素之一。如何有效地治疗恶性肿瘤已经成为了当今社会的重大课题。目前由化疗药物诱导产生的肿瘤细胞免疫原性死亡，是一种有效激活抗肿瘤免疫效应的方式，因此被广泛关注。但是，实体瘤如乳腺癌，直肠癌，恶性黑素瘤等肿瘤均在一定程度上过表达透明质酸(ha)。过表达的ha使实体瘤细胞外基质呈凝胶状，使间隙流体压显著提高，阻碍药物和纳米载体进入瘤内细胞，降低了药物的利用效率，减弱了化疗药物的效果及所产生的免疫原性死亡，从而阻碍了对肿瘤的治疗。

透明质酸酶(hyal)为实体瘤的治疗带来了希望。hyal能使ha和硫酸软骨键中糖苷键发生水解，使其降解为低聚物或小分子。hyal的临床实验已经验证局部的皮下给药优于静脉全身给药，并且没有毒副作用，在1948年被fda批准应用于临床。近年来，许多科研工作者报道了瘤周或瘤内注射hyal可提高肿瘤治疗效果，hyal在肿瘤治疗中可作为溶瘤药物、纳米制剂药物、溶瘤病毒和放射免疫疗法的佐剂：瘤旁注射高剂量的hyal与阿霉素联合应用可加强阿霉素的抗肿瘤效应；瘤内注射hyal可有效提高阿霉素的渗透性。虽然透明质酸酶作为化疗佐剂已经应用到临床，但是，需要hyal和化疗药物分别给药。较高的瘤内压增加了瘤内注射的难度，反复的瘤内注射也会极大地加快肿瘤的恶化，因此限制了其临床应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于实体瘤治疗的纳米颗粒，该纳米颗粒可降解实体瘤中的透明质酸，实现化疗药物和佐剂同时给药，提高抗肿瘤药物的利用效率，增强肿瘤细胞免疫原性死亡，可实现有效的化疗和免疫肿瘤联合治疗，且制备简单，便于操作与使用。

根据本发明的第一方面，提供了一种修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒，所述修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒含有介孔二氧化硅和透明质酸酶；所述介孔二氧化硅表面通过静电相互作用吸附阳离子聚合物，或者所述介孔二氧化硅表面通过共价作用连接了带正电荷的官能团；所述透明质酸酶通过静电相互作用吸附所述阳离子聚合物或所述带正电荷的官能团。

优选地，所述介孔二氧化硅内部为中空空腔，外径为10nm-1μm，壁厚为2nm-480nm，中空空腔的直径小于1.0μm，介孔的孔径为0.5nm-50nm；

所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚(β-氨基酯)、聚乙烯吡啶、聚二烯丙基二甲基氯化铵或二乙氨乙基葡聚糖；所述带正电荷的官能团为氨基、酰胺基、胍基、季铵根离子或重氮根离子。

优选地，所述介孔二氧化硅的介孔中包载了抗肿瘤药物，或者所述介孔二氧化硅的介孔和中空部分包载了抗肿瘤药物；

优选地，所述抗肿瘤药物为阿霉素、喜树碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、达卡巴嗪、博来霉素或硼替佐米；所述抗肿瘤药物的载药量为1wt％-30wt％。

优选地，所述纳米颗粒中的透明质酸酶的含量为0.1wt％-50wt％。

按照本发明的另一方面，提供了一种修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒的制备方法，将带正电荷的介孔二氧化硅与透明质酸酶混合，进行孵育，洗去游离的透明质酸酶，即得到修饰有透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒；所述带正电荷的介孔二氧化硅为表面吸附了阳离子聚合物的介孔二氧化硅，或者为表面通过共价作用连接了带正电荷的官能团的介孔二氧化硅。

优选地，所述带正电荷的介孔二氧化硅与透明质酸酶孵育的温度为2℃-37℃，时间为2h-24h；

所述表面吸附了阳离子聚合物的介孔二氧化硅的制备方法为：将介孔二氧化硅与阳离子聚合物混合，进行孵育，所述孵育的温度为25℃-80℃，时间为0.5h-12h，使阳离子聚合物通过静电相互作用吸附在介孔二氧化硅表面，离心后进行水洗，以除去游离的阳离子聚合物，得到表面吸附了阳离子聚合物的介孔二氧化硅；

优选地，所述表面吸附了阳离子聚合物的介孔二氧化硅与阳离子聚合物混合之前，还包括包载抗肿瘤药物的步骤，具体为：将抗肿瘤药物在溶剂中溶解，得到药物溶液，将该药物溶液与介孔二氧化硅混合；在负压条件下除去溶剂，用水分散后再经离心，以除去游离的抗肿瘤药物，即得到装载了抗肿瘤药物的介孔二氧化硅纳米颗粒。

优选地，所述表面通过共价作用连接了带正电荷的官能团的介孔二氧化硅与透明质酸酶混合之前，还包括包载抗肿瘤药物的步骤，具体为：将抗肿瘤药物在溶剂中溶解，得到药物溶液，将该药物溶液与表面通过共价作用连接了带正电荷的官能团的介孔二氧化硅混合，在负压条件下除去溶剂，用水分散后再经离心，以除去游离的抗肿瘤药物，即得到装载了抗肿瘤药物的介孔二氧化硅纳米颗粒。

优选地，所述介孔二氧化硅纳米颗粒内部为中空结构；所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚(β-氨基酯)、聚乙烯吡啶、聚二烯丙基二甲基氯化铵或二乙氨乙基葡聚糖；所述带正电荷的官能团为氨基、酰胺基、胍基、季铵根离子或重氮根离子。

按照本发明的另一方面，提供了任一所述的修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒用于制备抗肿瘤制剂的应用；

优选地，所述肿瘤为表达透明质酸的实体瘤。

按照本发明的另一方面，提供了所述的修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒的应用，所述修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒与肿瘤细胞孵育后，作为制备肿瘤疫苗的应用。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明可有效联合透明质酸酶和化疗药物，降解实体瘤微环境的透明质酸，提高肿瘤细胞对纳米颗粒的吞噬效率，提高化疗药物的利用效率，降低化疗药物的给药量并实现一次给药，实现对肿瘤细胞的高效杀伤，减弱对正常细胞及组织的毒性。

(2)由于带正电的聚合物和带负电的透明质酸酶在中空介孔二氧化硅纳米颗粒表面的交替吸附，使中空介孔二氧化硅纳米颗粒的介孔被封装，降低了装载的药物从中空介孔二氧化硅介孔中溶出速率，从而实现纳米颗粒在肿瘤酸性微环境对化疗药物的缓慢释放及控制释放。

(3)本发明提供的用于实体瘤治疗的纳米颗粒，诱导产生的肿瘤细胞免疫原性死亡，上调某些特征性的蛋白分子在细胞表面表达如：钙网蛋白、三磷酸腺苷、高迁移率族蛋白b1等。促进了树突状细胞的熟化，并提高了树突状细胞对肿瘤抗原的识别能力及其对抗原的提呈能力。成熟的树突状细胞进一步激活细胞毒性t淋巴细胞对肿瘤的攻击，从而进一步杀伤肿瘤细胞。

(4)本发明提供的用于实体瘤治疗的纳米颗粒，具有较强的免疫佐剂效应，从而实现化疗转换为有效的化疗和免疫联合治疗，可有效地抑制肿瘤的生长，在抗肿瘤及肿瘤免疫治疗等纳米生物医药领域具有良好的应用前景。

(5)本发明提供的用于实体瘤治疗的纳米颗粒，与肿瘤细胞孵育后，可作为肿瘤疫苗，预防肿瘤的发生和发展。

(6)本发明提供的用于实体瘤治疗的纳米颗粒的制备方法，制备时间短、操作简单、可重复性强，便于大规模制备。

附图说明

图1是实施例1制得的中空介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图。

图2是实施例1制得的修饰透明质酸酶的中空介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图。

图3是用于实体瘤治疗的纳米颗粒的药物释放曲线。

图4是不同纳米粒子的肿瘤细胞杀伤力结果图。

图5是不同纳米粒子的抑制肿瘤的实验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒，其组成包括介孔二氧化硅纳米颗粒、透明质酸酶和抗肿瘤药物，所述介孔二氧化硅纳米颗粒表面修饰阳离子聚合物，或者所述介孔二氧化硅表面通过共价作用连接了带正电荷的官能团；所述透明质酸酶吸附在阳离子聚合物修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒的表面或者通过共价作用连接了带正电荷的官能团的二氧化硅纳米颗粒的表面；所述抗肿瘤药物包载于介孔二氧化硅的介孔部分或中空介孔二氧化硅纳米颗粒的介孔和中空部分。

在本发明中，以介孔二氧化硅纳米颗粒为载体，其本身带负电，用阳离子聚合物或带正电的官能团修饰后带正电，随后可有效地吸附带负电的透明质酸酶，瘤内注射后，可降解实体瘤中的透明质酸，促进抗肿瘤药物在肿瘤组织的渗透。

在本发明中，所述中空介孔二氧化硅纳米颗粒的直径优选为10nm-1μm；所述中空空腔直径优选为0nm-0.9μm；所述中空介孔二氧化硅纳米颗粒的壁厚优选为2nm-480nm；所述介孔的孔径优选为0.5nm-50nm。

在本发明中，所述阳离子聚合物优选为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚(β-氨基酯)、聚乙烯吡啶、聚二烯丙基二甲基氯化铵、二乙氨乙基葡聚糖。

在本发明中，所述带正电荷的官能团优选为氨基、酰胺基、胍基、季铵根离子或重氮根离子。

在本发明中，所述透明质酸酶的重量百分比优选为0.1wt％-50wt％。

在本发明中，所述抗肿瘤药物的载药量优选为1wt％-30wt％。

在本发明中，所述抗肿瘤药物优选为阿霉素、喜树碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、达卡巴嗪、博来霉素或硼替佐米。

在本发明中，所述肿瘤优选为高表达透明质酸的实体瘤。

在本发明中，所述修饰透明质酸酶的二氧化硅纳米颗粒与肿瘤细胞孵育后，作为制备肿瘤疫苗的应用。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的用于实体瘤治疗的纳米颗粒的制备方法，包含以下步骤：

(1)将抗肿瘤药物在溶剂中溶解，得到药物溶液，将上述药物溶液和介孔二氧化硅纳米颗粒混合，超声10～60min，在负压条件下除去溶剂，用水分散后再经离心，除去游离的药物，即得到装载了抗肿瘤药物的介孔二氧化硅纳米颗粒。

(2)将步骤(1)得到的装载了抗肿瘤药物的介孔二氧化硅纳米颗粒与阳离子聚合物混合，在25～80℃孵育0.5～12h后离心，除去游离的阳离子聚合物，然后与透明质酸酶混合在2～37℃的条件下孵育2～24h，洗去游离的透明质酸酶后即得到用于实体瘤治疗的纳米颗粒。

在本发明中，所述溶解抗肿瘤药物的溶剂优选为二甲亚砜、甲醇、乙醇、水，药物浓度优选为1～20mg/ml。

在本发明中，所述抗肿瘤药物和介孔二氧化硅纳米颗粒的质量比优选为1:2～1:20。

在本发明中，所述负压操作优选为旋转蒸发、冷冻干燥、真空干燥。

在本发明中，所述介孔二氧化硅纳米颗粒与阳离子聚合物的质量比优选为1:5～1:20。

本发明对所述介孔二氧化硅纳米颗粒的来源没有特殊限定，可根据现有技术所需的介孔二氧化硅纳米颗粒即可。

在本发明实施例中，优选采用如下步骤的制备方法制备介孔二氧化硅纳米颗粒：

(1)混合80～220ml去离子水、2～10ml乙醇、1～5ml氨水和200～1200mg十二烷基三甲基溴化铵(ctab)，搅拌20～60min后，加入0.1～3mlteos，在20～80℃水浴条件下过夜反应。

(2)结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到介孔二氧化硅纳米颗粒。

在本发明实施例中，优选采用如下步骤的制备方法制备中空介孔二氧化硅纳米颗粒：

(1)实心二氧化硅(ssio2)纳米颗粒的制备：20～100ml乙醇、2～10ml去离子水和1～5ml浓氨水混合后加入0.3～5ml正硅酸四乙酯(teos)，在20～50℃水浴的条件下反应3～12h，即可得到ssio2纳米颗粒。

(2)具有核壳结构的二氧化硅(ssio2@msio2)纳米颗粒的制备：混合80～220ml去离子水、2～10ml乙醇和200～1200mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌20～60min后，加入0.1～3mlteos，在20～55℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2纳米颗粒。

(3)中空介孔二氧化硅纳米颗粒(hmsns)的制备：将上述溶液离心，分散到50～200ml浓度为0.2～0.8m的碳酸钠(na2co3)溶液中，在40～80℃条件下刻蚀0.1～6h，结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到hmsns。

实施例1

(1)ssio2纳米颗粒的制备：50ml乙醇、5ml去离子水和2ml浓氨水混合后加入1.5mlteos，在30℃水浴的条件下反应6h，即可得到ssio2纳米颗粒。

(2)ssio2@msio2纳米颗粒的制备：混合110ml去离子水、5ml乙醇和600mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌40min后，加入1.0mlteos，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2纳米颗粒。

(3)hmsns的制备：将上述溶液离心，分散到75ml浓度为0.4m的na2co3溶液中，在50℃条件下搅拌2h，结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到hmsns。

(4)透明质酸酶修饰的中空介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将25mg的hmsns与5ml浓度为2mg/ml的聚乙烯亚胺溶液混合，在30℃的条件下孵育0.5h，然后离心，洗去游离的聚乙烯亚胺，即得到聚乙烯亚胺修饰的纳米颗粒(简写为hmsps)。然后与浓度为5mg/ml透明质酸酶混合在4℃的条件下孵育24h，离心后加水分散，洗去游离的透明质酸酶，即得到透明质酸酶修饰的中空介孔二氧化硅纳米颗粒(简写为hmsphs)。

(5)用于实体瘤治疗的载药纳米颗粒的制备：混合1ml浓度为5mg/ml的阿霉素水溶液和25mg的hmsns，搅拌24h，在真空干燥箱中负压干燥，即得到装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒；

将得到的装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒与5ml浓度为2mg/ml的聚乙烯亚胺溶液混合，在30℃的条件下孵育0.5h，然后离心，洗去游离的聚乙烯亚胺，即得到装载阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的纳米颗粒(简写为dox@hmsps)。然后与浓度为5mg/ml透明质酸酶混合在4℃的条件下孵育24h，离心后加水分散，洗去游离的透明质酸酶，即得到用于实体瘤治疗的纳米颗粒(简写为dox@hmsphs)。

收集上述离心过程中的上清液，采用紫外-可见分光光度计测定阿霉素的含量，通过计算得到载药量为12.3wt.％。采用热重分析仪测定透明质酸酶吸附量，通过计算得到透明质酸酶的吸附量为6.1wt.％。

采用透射电子显微镜分别对步骤(3)和步骤(4)所得的hmsns和hmsphs进行表征，结果如图1和图2所示。由图1可知，本实施例所得hmsns具有内部中空、表面多孔结构，其粒径为150～200nm，壁厚为30nm；由图2可知，透明质酸酶成功包覆于hmsns表面上。

实施例2

(1)ssio2纳米颗粒的制备：50ml乙醇、5ml去离子水和2ml浓氨水混合后加入1.5mlteos，在30℃水浴的条件下反应6h，即可得到ssio2纳米颗粒。

(2)氨基修饰的ssio2@msio2纳米颗粒的制备：混合110ml去离子水、5ml乙醇和600mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌40min后，加入0.7mlteos和0.3ml3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)的混合溶液，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到氨基修饰的ssio2@msio2纳米颗粒。

(3)氨基修饰的hmsns的制备：将上述溶液离心，分散到75ml浓度为0.4m的na2co3溶液中，在50℃条件下搅拌2h，结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到氨基修饰的hmsns。

(4)透明质酸酶修饰的中空介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将25mg氨基修饰的hmsns与浓度为5mg/ml透明质酸酶混合在4℃的条件下孵育24h，离心后加水分散，洗去游离的透明质酸酶，即得到透明质酸酶修饰的中空介孔二氧化硅纳米颗粒(简写为hmsphs)。

(5)用于实体瘤治疗的载药纳米颗粒的制备：混合1ml浓度为5mg/ml的阿霉素水溶液和25mg的hmsns，搅拌24h，在真空干燥箱中负压干燥，即得到装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒；

将得到的装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒与浓度为5mg/ml透明质酸酶混合在4℃的条件下孵育24h，离心后加水分散，洗去游离的透明质酸酶，即得到用于实体瘤治疗的纳米颗粒(简写为dox@hmsphs)。

收集上述离心过程中的上清液，采用紫外-可见分光光度计测定阿霉素的含量，通过计算得到载药量为10.6wt.％。采用热重分析仪测定透明质酸酶吸附量，通过计算得到透明质酸酶的吸附量为4.3wt.％。

实施例3

(1)ssio2纳米颗粒的制备：50ml乙醇、5ml去离子水和2ml浓氨水混合后加入1.5mlteos，在30℃水浴的条件下反应6h，即可得到ssio2纳米颗粒。

(2)ssio2@msio2纳米颗粒的制备：混合110ml去离子水、5ml乙醇和600mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌40min后，加入1.0mlteos，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2纳米颗粒。

(3)氨基修饰的hmsns的制备：将上述溶液离心，分散到75ml浓度为0.4m的na2co3溶液中，在50℃条件下搅拌2h，结束后离心，分散于含有aptes的碱性水溶液中，在30℃条件下反应24h。结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到氨基修饰的hmsns。

(4)透明质酸酶修饰的中空介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将25mg氨基修饰的hmsns与浓度为5mg/ml透明质酸酶混合在4℃的条件下孵育24h，离心后加水分散，洗去游离的透明质酸酶，即得到透明质酸酶修饰的中空介孔二氧化硅纳米颗粒(简写为hmsphs)。

(5)用于实体瘤治疗的载药纳米颗粒的制备：混合1ml浓度为5mg/ml的阿霉素水溶液和25mg的hmsns，搅拌24h，在真空干燥箱中负压干燥，即得到装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒；

将得到的装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒与浓度为5mg/ml透明质酸酶混合在4℃的条件下孵育24h，离心后加水分散，洗去游离的透明质酸酶，即得到用于实体瘤治疗的纳米颗粒(简写为dox@hmsphs)。

收集上述离心过程中的上清液，采用紫外-可见分光光度计测定阿霉素的含量，通过计算得到载药量为9.6wt.％。采用热重分析仪测定透明质酸酶吸附量，通过计算得到透明质酸酶的吸附量为3.5wt.％。

实施例4

(1)按照实施例1中步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)所述的方法制备中空介孔二氧化硅纳米颗粒；

(2)混合1ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液和25mg的hmsns，搅拌24h，在真空干燥箱中负压干燥，即得到装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒；

将得到的装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒与5ml浓度为1mg/ml的聚乙烯亚胺溶液混合，在30℃的条件下孵育0.5h，然后离心，洗去游离的聚乙烯亚胺，即得到dox@hmsps。然后与浓度为2mg/ml透明质酸酶混合，在4℃的条件下孵育24h，离心洗去游离的透明质酸酶，即得到用于实体瘤治疗的纳米颗粒dox@hmsphs。

收集上述离心过程中的上清液，采用紫外-可见分光光度计测定阿霉素的含量，通过计算得到载药量为18.2wt.％。采用热重分析仪测定透明质酸酶吸附量，通过计算得到透明质酸酶的吸附量为4.3wt.％。

实施例5

(1)按照实施例1中步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)所述的方法制备中空介孔二氧化硅纳米颗粒；

(2)混合1ml浓度为3mg/ml的阿霉素水溶液和25mg的hmsns，搅拌24h，在真空干燥箱中负压干燥，即得到装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒；

将得到的装载了抗肿瘤药物的纳米颗粒与5ml浓度为1mg/ml的聚乙烯亚胺溶液混合，在30℃的条件下孵育0.5h，然后离心洗去游离的聚乙烯亚胺，即得到dox@hmsps。然后与浓度为5mg/ml透明质酸酶混合在4℃的条件下孵育24h，离心洗去游离的透明质酸酶，即得到用于实体瘤治疗的纳米颗粒dox@hmsphs。

收集上述离心过程中的上清液，采用紫外-可见分光光度计测定阿霉素的含量，通过计算得到得到载药量为8.7wt.％。采用热重分析仪测定透明质酸酶吸附量，通过计算得到透明质酸酶的吸附量为6.3wt.％。

实施例6

用ph值为7.4的磷酸缓冲溶液(pbs)模拟体内环境，用ph值为5.5的pbs模拟肿瘤微环境，研究用于实体瘤治疗的纳米颗粒的药物释放行为。将实施例1所得的dox@hmsphs配制浓度为0.5mg/ml的pbs分散液，分别取2ml所述分散液于截留分子量为13000的透析袋中，然后将透析袋分别置于50ml的不同ph值的pbs中。随后，放置于37℃水浴摇床中以120rpm震荡。平行三组。每隔一定的时间间隔取出1ml溶液，采用紫外-可见分光光度计测定阿霉素的浓度，并计算。即得到阿霉素在不同ph条件下的释放曲线，如图3所示。

由图3可知，dox@hmsphs在ph为7.4的条件下仅释放～26.5％的dox，在ph为5.5的条件下，在最初的8小时内观察到～73.8％dox的爆发释放。在ph为7.4的条件下，在24h内观察到仅有33.2％的dox被完全释放，其释放量明显低于在ph为5.5的条件下24h内释放的dox。这说明dox@hmsphs能在酸性环境下快速释放而在中性环境下释放缓慢。

实施例7

将b16-f10鼠源黑素瘤细胞种植于12孔板中，在含有1mg/mlha的细胞培养基模拟肿瘤细胞基质的环境下培养24h。随后分别与带荧光标记的hmsps和hmsphs分别培养0.5、2、4、6h，随后用流式细胞仪检测其荧光强度。研究结果表明，随着培养时间的延长，肿瘤细胞分别对hmsps和hmsphs的吞噬量逐渐增加；培养相同的时间，肿瘤细胞对hmsphs的吞噬量明显高于肿瘤细胞对hmsps的吞噬量。

实施例8

将b16-f10鼠源黑素瘤细胞种植于96孔板中，分为六组，在二氧化碳培养箱中预培养24h后，分别加入pbs空白对照、hmsps、hmsphs、dox、dox@hmsps和dox@hmsphs的悬浮液。培养24h后，弃去旧培养基，用新鲜培养基洗三次后，每孔加入100μl新鲜培养基和10μlcck-8溶液。孵育4h后，用酶标仪检测上述六组黑素瘤细胞的存活率，结果如图4所示。

由图4可知，hmsps和hmsphs组的细胞存活率在98％以上，与pbs组没有统计学差异，这说明hmsps和hmsphs对黑素瘤细胞没有明显的细胞毒性。而dox、dox@hmsps和dox@hmsphs对肿瘤细胞有明显杀伤效果，细胞存活率分别为73％、71％和47％，dox@hmsps和dox@hmsphs组与dox组相比均有统计学差异，且dox@hmsphs对肿瘤细胞的杀伤效果最强。

实施例9

构建b16-f10黑素瘤模型。将5×10⁵个b16-f10细胞植于c57bl/6小鼠。成瘤后，将小鼠随机分为6组，瘤内分别注射100μl的pbs、hmsps、hmsphs、dox、dox@hmsps和dox@hmsphs的悬浮液。给药的剂量是1.5mg阿霉素/kg。每两天监测小鼠肿瘤体积，结果如图5所示。由图5可知，在第20天，pbs组小鼠的肿瘤体积为2125mm³，hmsps组小鼠的肿瘤体积为1400mm³，抑瘤率为34％；hmsphs组小鼠的肿瘤体积为1000mm³，抑瘤率为53％；dox组小鼠的肿瘤体积为565mm³，抑瘤率为73％；dox@hmsps组小鼠的肿瘤体积为310mm³，抑瘤率为85％；dox@hmsphs组小鼠的肿瘤体积为130mm³，抑瘤率为94％。

实施例10

抗肿瘤疫苗：构建肿瘤挑战模型，将5×10⁵个b16-f10细胞在体外分别与pbs、hmsps、hmsphs、dox、dox@hmsps和dox@hmsphs的悬浮液作用24h。在第0天，分别取其混合溶液皮下注射到小鼠左后背部，每组10只小鼠。在第7天，在小鼠右后背部植入5×10⁵个b16-f10细胞。观察并记录出瘤情况。在第8天，pbs组小鼠的出瘤率为30％，其他组的小鼠均未出瘤；在第9天，pbs组小鼠的出瘤率为40％，hmsps组小鼠的出瘤率为10％，其他组的小鼠均未出瘤；在第10天，pbs组小鼠的出瘤率为70％，hmsps组小鼠的出瘤率为30％，hmsphs组小鼠的出瘤率为20％，其他组的小鼠均未出瘤；在第11天，pbs组小鼠的出瘤率为90％，hmsps组小鼠的出瘤率为60％，hmsphs组小鼠的出瘤率为50％，dox组小鼠的出瘤率为20％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为20％，dox@hmsphs组的小鼠未出瘤；在第12天，pbs组小鼠的出瘤率为90％，hmsps组小鼠的出瘤率为60％，hmsphs组小鼠的出瘤率为50％，dox组小鼠的出瘤率为50％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为30％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为10％；在第13天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为80％，hmsphs组小鼠的出瘤率为60％，dox组小鼠的出瘤率为50％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为40％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为10％；在第14天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为90％，hmsphs组小鼠的出瘤率为70％，dox组小鼠的出瘤率为60％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为50％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为10％；在第15天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为90％，hmsphs组小鼠的出瘤率为70％，dox组小鼠的出瘤率为60％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为50％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为10％；在第16天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为100％，hmsphs组小鼠的出瘤率为90％，dox组小鼠的出瘤率为70％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为60％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为20％；在第17天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为100％，hmsphs组小鼠的出瘤率为100％，dox组小鼠的出瘤率为70％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为70％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为20％；在第18天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为100％，hmsphs组小鼠的出瘤率为100％，dox组小鼠的出瘤率为90％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为80％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为20％；在第19天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为100％，hmsphs组小鼠的出瘤率为100％，dox组小鼠的出瘤率为100％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为80％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为20％；在第22天，pbs组小鼠的出瘤率为100％，hmsps组小鼠的出瘤率为100％，hmsphs组小鼠的出瘤率为100％，dox组小鼠的出瘤率为100％，dox@hmsps组小鼠的出瘤率为80％，dox@hmsphs组的小鼠的出瘤率为20％。研究结果表明，与pbs与肿瘤细胞的混合物组相比，dox与肿瘤细胞的混合物组、dox@hmsps与肿瘤细胞的混合物组和dox@hmsphs与肿瘤细胞的混合物组的出瘤率较低，能有效地抑制肿瘤的发生和发展，其中dox@hmsphs与肿瘤细胞的混合物组出瘤率最低，最能有效地抑制肿瘤的发生和发展。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。