包含组织细胞的半流体和活性成分的药物组合物以及该组合物的制备方法与流程

[0001]
本申请涉及一种包含组织细胞的半流体的应用、包含活性成分以及所述包含组织细胞的半流体的药物组合物、该药物组合物的制备方法、以及治疗或抑制病原体疾病的方法。


背景技术：

[0002]
病原体疾病、尤其是顽固性病原体疾病(例如实体肿瘤、顽固性微生物感染、顽固性皮肤病等)的治疗，一直是一个艰难的科学问题。由于有大量研究工作支持，实体肿瘤常被用作病原体疾病、犹其是难治性病原体疾病的研究模型。
[0003]
多种类的物质曾经被用以制作肿瘤疫苗。微生物类物质最早被应用于开发实体肿瘤疫苗。化脓性链球菌、黏质沙雷菌、卡介苗等先后被发现对某些肿瘤有疗效。活的、减毒或基因修饰的专性或兼性厌氧细菌可以选择性地在肿瘤内繁殖(可用作定植载体)，也可以释放某些抗原激活机体免疫系统。感染流感病毒或注射狂犬病疫苗后也出现肿瘤病情明显缓解的案例。此外，活的、减毒或基因修饰的溶瘤病毒可以通过两种方式(选择性肿瘤细胞杀伤和抗肿瘤免疫)抑瘤。另一方面，疟原虫、弓形虫等也被发现可抗肿瘤生长。可是，微生物类疫苗要么显示出一定的有效性却有较高安全性风险，要么显示出较高安全性却有效性不高。
[0004]
为了提高特异性，包含肿瘤抗原的疫苗更引入关注。首先出现的是全肿瘤细胞疫苗。全细胞疫苗表达较全面，但成分复杂、特异性仍然不强。研究人员于是寄望于在肿瘤细胞中筛选出个别有用无害的抗原部位(例如某些胞外体、表面蛋白质、核酸、多肽等)制成亚单位疫苗。所谓的肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的发现，曾经让人们欢欣鼓舞。然而，尽管其成分较单一、特异性较强、安全性较高，其免疫原性却较低下。随着当代基因技术的发展，肿瘤新抗原(neoantigen)再次让人们为之一振。肿瘤新抗原是指由癌细胞基因突变所导致的、正常细胞所没有的、且能被免疫细胞所识别的一类蛋白/表位多肽。然而，多肽序列一般由几个或数十个氨基酸组成，分子量较小，化学结构简单，安全性虽高免疫原性却较弱，仍然难以诱发足够强度的免疫反应。
[0005]
尽管微生物(抗原)药物、肿瘤细胞(抗原)药物、肿瘤细胞亚单位(抗原)药物、肿瘤新(抗原)药物、异基因淋巴细胞(抗原)药物繁花似锦，而从临床角度看实体肿瘤药物的开发，似乎进步不大。大问题还在老地方：要如何才能开发出这样一种实体肿瘤药物抗原，其具有临床有效的所需(抗肿瘤)抗原性、同时不需抗原性(例如gvhd)又在临床安全的允许范围内？若干其它严重病原体疾病、犹其是顽固性病原体疾病(例如乙肝)也有类似问题。
[0006]
因而，仍然需要开发新的药物，以满足现有技术尚不能满足的急需临床需求。


技术实现要素：

[0007]
本发明专利申请的目的，在于提供一种作用更全面(例如包括免疫-化疗综合作用
或/和免疫-免疫加強综合作用)因而更有效、而不需抗原性(例如gvhd)又最小化的药物组合物，包含该药物组合物的药物，该药物的制备方法，以及一种抗病原体疾病方法。具体而言，所提供的药物组合物包含抗病原体疾病活性成分和作为所述活性成分的协同成分的包含动物组织细胞的半流体。
[0008]
本申请公开的一个方面提供包含动物组织细胞的半流体作为抗病原体疾病活性成分的协同成分在制备用于治疗或抑制病原体疾病的局部药物中的应用。
[0009]
本申请公开的另一个方面提供一种用于治疗或抑制病原体疾病的局部药物组合物，其包含抗病原体疾病活性成分和包含动物组织细胞的半流体，其中所述活性成分分散在所述包含动物组织细胞的半流体中。
[0010]
本申请公开的又一个方面提供一种用于治疗或抑制病原体疾病的方法，其包括向有此需要的个体局部通过植入、优选通过注射施用包含抗病原体疾病活性成分和作为所述活性成分的协同成分的包含动物组织细胞的半流体的局部药物组合物。
[0011]
本申请公开的再一个方面提供一种用于抗病原体疾病的药物组合物的制备方法，该药物组合物包含动物组织细胞的半流体和活性成分，所述方法包括以下步骤：
[0012]
a.提供包含所述细胞的制备物，所述制备物可以是以下组之一种或多种：天然细胞制备物、工程细胞、包含天然细胞的结缔组织、包含天然细胞的器官组织、天然细胞的富集组分,
[0013]
b.提供所述活性成分,
[0014]
c.将所述包含所述细胞的制备物与所述活性成分进行混合，如有必要对该混合物进行半流体化和/或严重损伤处理，以得到包含所述动物组织细胞和活性成分的半流体；或
[0015]
c.将包含所述细胞的制备物进行半流体化和/或严重损伤处理以得到半流体，在其中加入活性成分并进行混合，得到包含所述动物组织细胞和活性成分的半流体。
[0016]
本申请公开的再一个方面提供根据上述方法制备的药物组合物。
[0017]
根据本发明的半流体与现有技术的病原体疾病药物相比具有以下优点：更全面的药理、更高的有效性，更高的安全性，更宽的适应症谱，更多更好的协同作用选择性。
[0018]
根据本发明的抗病原体疾病方案更容易和其它相关治疗方案联合进行。此外，该应用和该药物制备可控、成本便宜，而该治疗方案简便易行，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到安全、有效治疗。
具体实施方式
[0019]
根据本申请公开的一个方面，其提供包含动物组织细胞的半流体作为抗病原体疾病活性成分的协同成分在制备用于治疗或抑制病原体疾病的局部药物中的应用。
[0020]
根据本申请公开的一个方面，其提供一种用于治疗或抑制病原体疾病的局部药物组合物，其包含抗病原体疾病活性成分和包含动物组织细胞的半流体，其中所述活性成分分散在所述包含动物组织细胞的半流体中。
[0021]
根据本申请公开的一个方面，其提供一种用于治疗或抑制病原体疾病的方法，其包括向有此需要的个体局部通过植入、优选通过注射施用包含抗病原体疾病活性成分和作为所述活性成分的协同成分的包含动物组织细胞的半流体的局部药物组合物。
[0022]
在本申请公开中，术语“动物组织细胞”是指源自动物天然组织的细胞及其人工衍
生物。
[0023]
在本申请公开中，术语“半流体”是指在限时内(例如20秒)无外压则无肉眼可见的流动、而在临床(施用时)可接受的外压(例如可施加在注射器推进装置上的外压)下可以流动并导致不可逆形变的物体，其区别于流体(流体无外压时亦有流动性)、固体(固体在临床可接受的外压下亦不可流动)、半固体(半固体在临床可接受的外压下仅发生可逆形变)。例如，某些动物器官(例如肌肉块、肝、胃、肠、心、肺、胰腺、软骨、关节等)的组织、以及某些压力下不流动的凝胶(例如纤维蛋白胶)是半固体，而不是半流体。
[0024]
在本申请公开中，术语“活性成分”是指在相同条件下单独局部使用能够产生一定预防或治疗效果的物质。
[0025]
在本申请公开中，术语“病原体”是指可致病生物体或其他生物媒介，可致病生物体包括例如寄生虫(例如原虫、蠕虫等)、细菌、真菌、病毒、立克次氐体、衣原体、支原体、螺旋体，其他生物媒介包括例如微生物重组体、病变细胞(例如实体肿瘤细胞)。术语“病原体疾病”是指与病原体有关的疾病。
[0026]
在一个实施方案中，所述组合物的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节，且所述包含动物组织细胞的半流体为所述活性成分提供缓释载体的作用，并能够与之产生以下协同作用：免疫协同和/或组织破坏协同
[0027]
在本发明的范围内，所述组合物的协同的必要条件(或者基本技术方案)为：例如通过应用条件，它在用药处形成半流体结节，其在组成(例如量比)、性质(例如柔软性)、形态/结构上引起免疫协同和/或组织破坏协同，并能够缓释所述活性成分。
[0028]
在一个实施方案中，所述活性成分选自抗病原体疾病的生物制品之一种或多种；所述半流体作为所述活性成分的免疫协同成分，并起到缓释载体的作用。
[0029]
在一个实施方案中，所述活性成分选自抗病原体疾病化疗药物之一种或多种；所述半流体作为所述化疗药物的化疗协同成分，并起到缓释载体的作用。
[0030]
在一个实施方案中，所述活性成分选自抗病原体疾病的生物制品和化疗药物；所述组织细胞半流体作为所述活性成分的免疫协同成分和组织破坏协同成分，并起到缓释载体的作用。
[0031]
在本发明的范围内，所述包含有效量的活性成分和有效量的作为活性成分的协同成分的包含组织细胞的半流体的药物组合物作为免疫活性成分和/或组织破坏成分用于病原体疾病药物制备。
[0032]
在一个实施方案中，所述包含有效量的活性成分和有效量的作为活性成分的协同成分的包含组织细胞的半流体的药物组合物作为免疫活性成分用于病原体疾病药物制备。
[0033]
在一个实施方案中，所述包含有效量的活性成分和有效量的作为活性成分的协同成分的包含组织细胞的半流体的药物组合物作为组织破坏成分用于病原体疾病药物制备。
[0034]
在一个实施方案中，所述包含活性成分和组织细胞组合物的半流体作为免疫活性成分和组织破坏成分用于病原体疾病药物制备。
[0035]
在一个实施方案中，所述包含活性成分和组织细胞组合物的半流体作为原位抗原的释放剂用于病原体疾病药物制备。
[0036]
在本申请公开中，术语“原位抗原”是指活体内病原体所致病变体中包含的有可能诱发机体的特异性免疫应答的物质(例如含有实体肿瘤抗原信息的瘤内实体肿瘤细胞材
料、胞外体、多肽及核酸序列等)，其实际上包含大量的有别于正常机体的抗原信息，只是这些信息被某些病理因素(例如肿瘤微环境)所屏蔽，从而不能被常规免疫系统识别并反应。
[0037]
在本发明的范围内，所述包含组织细胞的半流体作为抗病原体疾病活性成分的协同作用载体的必要条件(或者基本技术方案)为：它在给药区形成在组成(例如包含细胞)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似于凝胶半固体、但可分散性更高的半流体结节，以能够可控地释放出活性成分，从而产生超过载体和所述活性成分的加和作用的治疗效应。
[0038]
在本发明的范围内，所述包含组织细胞的半流体作为抗病原体疾病免疫成分的免疫协同成分的必要条件(或者基本技术方案)为：使得它在给药区形成有效抗原、激活病原体原位抗原、或/和作为所述免疫成分的载体，以产生超过半流体抗原和所述免疫成分的加和作用的免疫治疗效应。
[0039]
在本发明的范围内，所述包含组织细胞的半流体作为抗病原体疾病化疗药物的化疗协同作用的必要条件(或者基本技术方案)为：使得它在给药区形成更有效抗原、形成瘤体组织的破坏效应、或/和作为所述化疗药物的载体，以产生超过半流体抗原和所述化疗药物的加和作用的治疗效应。例如，本发明的半流体瘤内用药可作为组织破坏成分参与释放瘤内原位抗原。
[0040]
在本发明范围内，所述组织细胞优选为选自源自结缔组织和/或结缔组织之外的半固体组织所包含的细胞。
[0041]
在一个实施方案中，所述组织细胞为选自源自动物结缔组织的细胞之一种或多种。
[0042]
在一个实施方案中，所述组织细胞为选自源自动物结缔组织之外的半固体组织的细胞之一种或多种。
[0043]
在一个实施方案中，所述半流体所包含的动物组织细胞选自以下组及其衍生物之一种或多种：肌细胞，血细胞、免疫细胞，干细胞例如间充质干细胞、造血干细胞。
[0044]
在一个实施方案中，所述免疫细胞选自以下组及其衍生物之一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞、白细胞，其中所述白细胞选自以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自以下一种或多种：t细胞、b细胞、裸细胞。
[0045]
在一个实施方案中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为>22％、优选为33％-86％、45％-86％、或55％-86％。
[0046]
在一个实施方案中，所述组织细胞的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)、45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)、或55％-86％(或细胞浓度为14.0
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0047]
在一个实施方案中，所述组合物所包含的细胞比容为55％-86％(或细胞浓度为14.0
×
109个/ml-22
×
109个/ml)。
[0048]
在一个实施方案中，所述活性成分选自抗病原体疾病的生物制品或/和化疗药物之一种或多种，且所述活性成分在组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。在一个实施方案中，所述化疗药物在所述组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。在一个实施方案中，所述生物制品在所述组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
[0049]
在一个实施方案中，所述组合物协同的必要应用条件包括其包含在所述药物的局
部用药中，其中所述局部用药为病变区内用药和/或病变区外局部用药。在一个实施方案中，所述组合物包含在所述药物的病变区内用药(例如瘤内用药)中。在一个实施方案中，所述组合物包含在所述药物的病变区外局部用药(例如瘤外局部用药)中。在一个实施方案中，所述组合物包含在所述药物的病变区内用药和病变区外局部用药中。在一个实施方案中，所述病变区外局部用药包括以下之一种或多种：皮下给药、肌肉给药、粘膜给药。
[0050]
在一个实施方案中，所述组合物协同的必要形态/结构包括：其为半流体组合物，且其在用药处形成包含活性成分和组织细胞的半流体结节。
[0051]
在一个实施方案中，所述包含组织细胞的半流体作为免疫协同成分的优选形态/结构条件包括：所述半流体为高度偏离天然状态、优选为严重损伤的状态，其中所述高度偏离天然状态包括粘稠化；所述严重损伤选自包括以下之一种或多种损伤：凝固化、机械破碎、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。在该技术方案下，所述包含组织细胞的半流体为作为高度偏离天然状态细胞群、优选为作为严重损伤细胞群诱导免疫应答的免疫成分(例如抗原或佐剂)。
[0052]
在一个实施方案中，所述组合物所包含组织细胞为严重损伤的细胞，其中所述严重损伤选自包括以下之一种或多种损伤：机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。
[0053]
在本发明的范围中，所述粘稠化是指包含组织细胞的流体加入组织细胞或/和添加剂的量达到如此之高，以至于体系不再是流体而成为非流体粘稠物。从流体变为半流体，明显远离其天然状态。
[0054]
在本申请公开中，术语“严重损伤”是指不仅丧失生理功能且能被机体免疫系统识别和应对作重大创伤加以消除的损伤状态。
[0055]
在本发明的范围内，所述凝固化损伤、机械破碎、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤可分别通过以下处理来获得：凝固化处理、机械破碎、超声处理、热处理、冻融处理、照射处理、化学处理。众所周知，这些处理可以改变细胞包容物(例如组织)的结构、形态，导致严重损伤。这些处理不仅导致细胞包容物损伤，往往也可以改变细胞结构、形态，从而使得细胞损伤(例如细胞的机械损伤、超声波损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤)。经这些损伤后，细胞包容物(例如组织)甚至细胞均丧失生理功能(例如不能再被用于器官移植或组织移植，以及细胞增殖弱化)，而且更易被机体免疫系统作为重大创伤(例如其优势抗原性不再是异基因抗原性)识别和应对。
[0056]
在本发明的范围中，所述凝固化是使液体转化为固体或半固体的处理，其包括选自本领域公知的任何液体组织的凝固化处理，例如：自凝固化(例如自凝固血液)、热凝固化(例如热凝固血液)、凝固剂凝固化(例如凝固剂凝固血液)。其中，热凝固化可以通过热处理来进行，凝固剂凝固化是通过在液体中加入凝固剂(例如血液中加入凝血酶和氯化钙)来进行。
[0057]
在本发明的范围中，所述机械破碎包括机械分割(例如组织取样)和剪切破碎。所述剪切破碎是指将待处理物体(例如凝固物)施以转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机来进行。凝固物经机械破碎后可以变为颗粒。
[0058]
在本发明的范围中，所述超声处理是指将待处理物体(例如血液、细胞沉淀)放入
超声装置中进行超声(例如工作频率为2-60khz)以使其结构受到破坏。
[0059]
在本发明范围内，所述热处理选自包括以下之一种或多种：直接热处理、蒸汽热处理、冻干热处理、微波热处理、射频热处理、激光热处理，热处理温度为≥40℃、优选为60℃-115℃。例如血液的热处理。
[0060]
在本发明范围内，所述冻融处理包括冷冻处理和冷冻物的融化处理，其中所述冷冻处理选自机械制冷或/和液氮制冷，制冷温度为≤-60℃、优选为-60℃～-160℃。例如血液、细胞的冻融处理。
[0061]
在本发明范围内，所述照射处理(例如照射強度为20-100gy)选自包括以下之一种或多种：x射线照射处理、γ射线照射处理、光敏性药物+紫外线照射处理。例如血液、细胞的照射处理。
[0062]
在本发明范围内，所述化学处理是指将待处理物体加入化学破坏剂(例如酸、碱、乙醇等硬化剂)以使其结构受到破坏。例如血液、细胞的化学处理。
[0063]
在一个实施方案中，所述包含活性成分和组织细胞的半流体组合物包括所述活性成分和组织细胞的混合物的半流体化产物、或/和所述活性成分和包含组织细胞的半流体的混合物，其中所述包含组织细胞的半流体为组织细胞或其包容物(例如组织、组织组分、含组织细胞液体等)的半流体化产物。
[0064]
在一个实施方案中，所述半流体化包括以下组之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎化。
[0065]
在本申请公开中，术语“半流体粘稠化”是指非流体粘稠物为半流体粘稠物的粘稠化。例如：工程组织白细胞/血浆或红细胞/血浆中的细胞比容达70％以上时，体系从流体转变为半流体；术语“半流体凝固化”是指将液体转化为半流体的凝固化，例如血液或组织细胞/血漿混合物的自凝固化(例如不加热、不加凝固剂的凝固)、热凝固化(例如中低温加热凝固)等；术语“破碎化”是指将非液体或凝固物进行机械分割或剪切破碎在内的碎块化处理以致于形成半流体、优选可注射半流体，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机(例如转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切)来进行。
[0066]
在一个实施方案中，所述半流体组合物选自以下组之一种或多种：所述组合物为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和组织细胞的半流体粘稠物、包含所述活性成分和组织细胞的半流体凝固物、包含所述活性成分和包含组织细胞的半流体破碎物、包含所述活性成分和组织细胞的凝固物的破碎物，优选为以下形式：包含所述活性成分和组织细胞的半流体凝固物、包含所述活性成分和包含组织细胞的半流体破碎物、包含所述活性成分和组织细胞的凝固物的破碎物。在该技术方案下，所述半流体优选为作为体内非正常结节、犹其是严重损伤结节诱导免疫应答的抗原。
[0067]
在一个实施方案中，所述半流体组合物包括以下组之一种或多种：包含所述活性成分和组织细胞的半流体凝固物、包含所述活性成分和包含组织细胞的半流体破碎物、包含所述活性成分和组织细胞的凝固物的破碎物。
[0068]
在一个实施方案中，所述凝固物包括包含所述活性成分和细胞的液体体系的自凝固物、凝固剂致凝固物、热凝固物。在一个实施方案中，所述破碎物包括颗粒群。在一个实施方案中，所述颗粒优选为肉眼可辨的宏观颗粒。在一个实施方案中，所述颗粒的最长端的横切面的平均直径为≥100nm，优选为500nm-1mm或1μm-1mm。
[0069]
在一个实施方案中，所述半流体组合物的组成、性质、形态/结构和应用条件使得其在施用处形成体积>100mm3，优选为≥200mm3的半流体结节。在该技术方案下，所述半流体组合物优选为作为尺寸较大的半流体结节抗原或较大瘤体的严重损伤瘤体仿生抗原。
[0070]
在本申请公开中，术语“尺寸较大的半流体结节抗原”是指由尺寸较大的半流体结节本身的结构(形态)特点致其特异性免疫原的抗原，其区别于分子形态的抗原(例如微生物抗原、肿瘤抗原、异基因免疫细胞抗原等)、以及半固体形态的抗原(例如半固体移植物抗原等)。术语“微生物抗原”、“肿瘤抗原”、“异基因免疫细胞抗原”、“半固体移植物抗原”则是指分别以微生物的种属特异分子、肿瘤细胞的病原特异分子、异基因免疫细胞的异基因特异分子、半固体移植物的种属或异基因特异分子为其特异性免疫原的抗原。当这些抗原被用作疫苗抗原时，相应的疫苗分别被称作“半流体结节抗原疫苗”、“微生物疫苗”、“肿瘤抗原疫苗”、“异基因免疫细胞疫苗”等等。结构越复杂的物质，其携带的抗原决定要素(例如抗原决定基)通常也越多。例如，尽管微生物亚单位抗原更安全、更易制备，临床上应用的很多疫苗仍然主要还是活微生物疫苗。
[0071]
在本申请公开中，术语“严重损伤瘤体仿生抗原”是指具有多重仿瘤体特征(包括瘤体特征组分及形貌特点)、但却因严重损伤更易被免疫识别作异物的半流体结节状抗原。
[0072]
在一个实施方案中，所述半流体优选为可挤流半流体。在本发明的范围内，所述可挤流半流体是指可在临床接受的压力下流过针管的半流体。
[0073]
在一个实施方案中，所述半流体为植入剂、优选为注射剂，且其单个动物给药量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml。所述半流体作为抗原的必要条件提供了多重仿瘤体特征，而较大的注射量则使所形成的半流体结节更易被免疫识别作半流体结节抗原。
[0074]
在本发明的范围内，所述半流体注射剂为可以通过常规注射系统直接用药的半流体。而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如原位凝胶化)结节。
[0075]
在一个实施方案中，所述半流体组合物的皮下半消失期为≥0.1日、优选为0.1～30日。在一个实施方案中，所述半流体组合物的皮下半消失期为1～30日。
[0076]
在本发明的范围内，所述包含组织细胞的半流体(有时简称为半流体)既包括所述活性成分和组织细胞的混合物的半流体化产物、或/和所述活性成分和包含组织细胞的半流体的混合物中的半流体。
[0077]
在一个实施方案中，所述组织细胞为灭活组织细胞。
[0078]
在本发明范围内，所述灭活组织细胞为经受严重损伤且失去增殖活性的组织细胞。
[0079]
在本发明范围内，所述半流体中包含的组织细胞源自哺乳动物。所述哺乳动物选自以下之一种或多种：人、猪、马、羊、牛、兔、鼠。这些动物可以是完全自然进化的动物，也可以是经过生物技术(例如基因编辑技术)改造的动物(例如gal抗原敲除猪)。
[0080]
在一个实施方案中，所述组织细胞选自以下组之一种或多种：所述结缔组织和/或半固体组织中的天然细胞、所述结缔组织富集组分中的天然细胞、源自所述结缔组织和/或半固体组织的天然细胞制备物和/或工程细胞。
[0081]
在一个实施方案中，所述组合物包含以下组之一种或多种：包含所述细胞的所述结缔组织和/或半固体组织、包含所述细胞的所述结缔组织富集组分和/或半固体组织富集
组分、源自所述细胞的富集组织的细胞制备物和/或工程细胞、包含所述细胞的血漿混合物。
[0082]
在一个实施方案中，所述组合物选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和所述结缔组织的半流体凝固物、包含所述活性成分和所述结缔组织的半流体混合物、包含所述活性成分和所述结缔组织和/或半固体组织的半流体破碎物、包含所述活性成分和所述结缔组织富集组分和/或半固体组织富集组分的半流体凝固物、包含所述活性成分和所述结缔组织富集组分和/或半固体组织富集组分的半流体破碎物、包含所述天然细胞制备物和/或工程细胞的半流体粘稠物、包含所述天然细胞制备物和/或工程细胞的半流体凝固物、包含所述天然细胞制备物和/或工程细胞的半流体破碎物。
[0083]
在一个实施方案中，所述半固体组织优选为选自包括以下之一种或多种：肠、胃、肉、胰腺、脾脏、肝脏、肺、软骨、关节、皮、胎盘、脐带，优选为选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、脾脏、肝脏、胎盘、脐带。
[0084]
在一个实施方案中，所述结缔组织优选为选自包括以下之一种或多种：血液、骨髓、脊髓，更优选为血液。
[0085]
在一个实施方案中，所述血液选自以下组之一种或多种：天然血液、细胞富集的天然血液组分、包含血细胞制备物和血浆的工程血液。
[0086]
在一个实施方案中，所述半流体为选自以下组之一种或多种：包含所述天然血液的半流体凝固物、包含所述血液组分的半流体凝固物、包含所述工程血液的半流体凝固物、所述血液的凝固物的破碎物。
[0087]
在一个实施方案中，所述半流体为包含天然血液的半流体凝固物。在一个实施方案中，所述半流体为包含所述血液组分的半流体凝固物。在一个实施方案中，所述半流体为包含所述工程血液的半流体凝固物。在一个实施方案中，所述血液、血液组分或工程血液的半流体凝固物包括以下之一种或多种：自凝固物、热凝固物、凝固剂半流体凝固物。
[0088]
在本申请公开中，术语“自凝固物”是指血液、血液组分或工程血液自然凝固形成的凝固物。术语“热凝固物”是指血液、血液组分或工程血液经热处理形成的凝固物。术语“凝固剂半流体凝固物”是指血液、血液组分或工程血液加入凝固剂所形成的半流体凝固物(而非固体或半固体凝固物)。
[0089]
在一个实施方案中，所述凝固剂包括血液凝固剂，其中所述血液凝固剂选自包括以下之一种或多种：凝血酶例如牛凝血酶、猪凝血酶、重组人凝血酶、自体凝血酶，其它凝血蛋白例如凝血因子、凝血酶原复合物、及它们的活化形式，钙离子提供剂例如氯化钙、氢氧化钙、碳酸钙。
[0090]
在一个实施方案中，所述半流体为所述血液的凝固物的破碎物。在一个实施方案中，所述破碎物包括颗粒群。在一个实施方案中，所述颗粒优选为肉眼可辨的宏观颗粒。在一个实施方案中，所述颗粒的最长端的横切面的平均直径为≥100nm，优选为500nm-1mm或1μm-1mm。
[0091]
在一个实施方案中，所述包含血液的半流体的半消失期为≥1日、优选为2-20日。
[0092]
在一个实施方案中，所述半流体为包含所述细胞的半流体粘稠物，且其中所述细胞比容≥70％。在一个实施方案中，所述半流体粘稠物包含增粘剂。在一个实施方案中，所述增粘剂选自包括以下之一种或多种：聚乙二醇、淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚
乙烯毗咯烷酮。
[0093]
根据本发明的组合物所含半流体，其作为免疫协同成分在上述条件下应用时，优选为其优势抗原性为抗所述病原体疾病抗原性而非抗宿主抗原性的半流体。
[0094]
在一个实施方案中，所述半流体优选为抑瘤率为≥抗宿主率、优选为抑瘤率/抗宿主率≥150％的半流体。
[0095]
物质作为抗原所导致的免疫识别和免疫响应的复杂性，远远超过其作为化疗药物所导致的后果。在免疫系统的多层次、多元化的网络格局中，一个物质有可能导致多种免疫反应，显示多种抗原性。在本申请公开中，术语“优势免疫反应”是指所激活的主要免疫反应。术语“优势抗原性”是指在优势免疫反应中显示的抗原性。例如，异基因淋巴细胞可攻击受者正常细胞(移植物抗宿主反应)和癌细胞(移植物抗肿瘤反应)，也可激活受者淋巴细胞攻击癌细胞(宿主抗肿瘤反应)和异基因细胞(宿主抗移植物反应)。由于其优势免疫反应为移植物抗宿主反应，其次为移植物抗肿瘤反应，宿主抗肿瘤反应则较弱，故异基因淋巴细胞本身是一种抗宿主抗原，可以用作抗肿瘤细胞(例如白血病)抗原，却很难被用作实体肿瘤疫苗抗原。
[0096]
在一个实施方案中，所述半流体中包含的细胞可以是异种或异基因抗原性最小化的细胞。
[0097]
在本申请公开中，术语“异种抗原”是指源自受试者的不同物种且代表其种属特异性的抗原；术语“同种异基因抗原”是指源自受试者的同种异体等位基因差异的抗原，例如主要组织相容性抗原(mhc抗原，例如人类白细胞抗原(hla))、次要组织相容性抗原(mh抗原)和其它组织相容性抗原(例如人类血型抗原、组织特异性抗原等)。
[0098]
根据本发明的半流体，其作为免疫协同成分在上述条件下应用时，其中所含细胞可以通过以下技术方案进行优选。
[0099]
在一个实施方案中，所述细胞为选自以下组之一种或多种：源于abo血型相符或hla相近的同种异基因组织的细胞、源于同种同基因组织的细胞、源于自体组织的细胞。
[0100]
在一个实施方案中，所述血细胞包括源于abo血型相符或hla相近的同种异基因组织的细胞。
[0101]
在一个实施方案中，所述细胞包括源于自体组织的细胞。
[0102]
在一个实施方案中，所述细胞包括源于自体组织和同种异体组织的细胞。
[0103]
在一个实施方案中，所述生物制品选自以下组之一种或多种：病原体抗原、细胞制品、免疫调节类抗体、细胞因子。
[0104]
在本申请公开中，术语“病原体抗原”是指源于病原体的抗原，其包括例如病原体、病原体亚单位等；术语“病原体亚单位”是指病原体的免疫活性成分及其人造类似物，例如寄生物、细菌、病毒、肿瘤细胞、它们的免疫活性成分成分(dna、蛋白质、多肽片断等)(例如肿瘤亚单位抗原、非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(cpg odn)等)。
[0105]
在一个实施方案中，所述半流体作为病原体抗原的佐剂用于病原体疾病疫苗的制备，其中所述病原体抗原选自以下组之一种或多种：微生物抗原、肿瘤抗原。
[0106]
在一个实施方案中，所述微生物抗原选自源于以下微生物组之一种或多种的抗原：细菌例如以下之一种或多种：化脓性链球菌、豁质沙雷菌、卡介苗、破伤风梭菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌；病毒例如以下之一种或多种：乙肝病毒、腺病毒、单纯疤疹病毒、
牛痘病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、西尼卡谷病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒；寄生虫例如疟原虫。
[0107]
在一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自包括以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
[0108]
在本申请公开中，术语“细胞制品”是指经工程制备方法(例如细胞纯化、细胞培养等)所获得的细胞集合，例如由脾之细胞混合物经溶解红细胞后纯化所获得的淋巴细胞集合。
[0109]
在一个实施方案中，所述细胞制品为选自包含以下之一种或多种天然细胞或工程化细胞的制品：组织富含的细胞例如肌细胞、血细胞；免疫细胞例如外周血单核细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、淋巴细胞；干细胞例如间充质干细胞、造血干细胞。
[0110]
在一个实施方案中，所述细胞的含量为大于105个/mm3、优选为105～109个/mm3。在一个实施方案中，所述半流体包含自体血液和细胞。在一个实施方案中，所述细胞与血细胞的量比(v/v)为10％～90％。在一个实施方案中，所述细胞优选为选自同种异基因细胞、同基因细胞和自体细胞，更优选为自体细胞。
[0111]
在一个实施方案中，所述免疫调节类抗体选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂，例如针对ctla-4分子和pd-1分子的阻断性抗；针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子的激活性抗体，例如抗ox40抗体、抗cd137抗体、抗4-1bb抗体；针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子的中和抗体，例如抗tgf-p1抗体。在一个实施方案中，所述免疫调节类抗体药物在所述药物组合物中的含量为>0.1％、优选为0.25-10％。
[0112]
在一个实施方案中，所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。在一个实施方案中，所述细胞因子在所述药物组合物中的含量为>0.1％、优选为0.25-3％。
[0113]
在一个实施方案中，所述化疗药物选自细胞毒药物和/或常规无效但局部有效化合物之一种或多种。在一个实施方案中，所述细胞毒药物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-15)/100。在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.5-30)/100。
[0114]
在本申请公开中，术语“细胞毒药物”是指在安全剂量下可以通过吸收作用有效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自药学上可接受的任何细胞毒药物，优选为选自本领域公知的细胞毒药物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方主管行政部门(例如fda或中国药监局)己批准或将批准、或经中国、美国或欧洲官方药典己载入或将载入的抗肿瘤化疗药物。
[0115]
在一个实施方案中，所述细胞毒药物可以为选自以下组之一种或多种：尿嘧啶衍生物类、环磷酰胺类、吉西他滨类、表柔比星类、抗肿瘤抗生素类、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉烷类；优选为选自以下药物及其类似衍生物一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗实体肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
[0116]
在一个实施方案中，所述抗肿瘤化疗药物在所述半固体中的浓度大于其饱和浓度
的50％、优选为其饱和浓度的50-500％，其中所述饱和浓度是指所述抗实体肿瘤化疗药物在其药用溶媒中的饱和浓度。
[0117]
在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、植物活性成分。
[0118]
在本申请公开中，术语“常规无效但局部有效化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用临床无效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自例如中国、美国或欧洲官方药典己载入的抗肿瘤化疗药物之外的药物。
[0119]
在本发明的范围内，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸盐、寡肽优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(gaba)、茶氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素在所述药物组合物中的浓度(w/w)为大于≥5％、优选为10-35％或18-35％，更优选为15％-35％或20％-35％。
[0120]
在本申请公开中，术语“无效芳香化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用不能有效抑制肿瘤的芳香化合物。所述无效芳香化合物包括药学上可接受的任何无效芳香化合物。在本发明的范围内，所述无效芳香化合物为选自以下组之一种或多种：色素芳香化合物、水杨酸类化合物、喹啉类化合物。在一个实施方案中，所述无效芳香化合物在所述药物组合物中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.35-20％。
[0121]
在本申请公开中，术语“色素芳香化合物”是指药学上可以接受的能够使靶区有选择性的将特定波长的光吸收或反射的芳香化合物，其可以例如包括活体染料、光敏剂和有色化疗药物。在一个实施方案中，所述色素芳香化合物可以为选自以下化合物及其衍生物之一种或多种：亚甲蓝(包括其水合物)、专利蓝、异硫蓝、孟加拉红、混合卟啉类光敏剂、卟啉类化合物(例如卟啉、卟吩、红紫素、内源性卟啉)、硝基酚化合物。在一个实施方案中，所述色素芳香化合物在所述药物组合物中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.5-10％。
[0122]
在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物为选自水杨酸和以下化合物及其衍生物之一种或多种：乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素、赖氨匹林。在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物在所述药物组合物中的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.5-2.0％。
[0123]
在一个实施方案中，所述喹啉类化合物选自水溶性喹啉类化合物，优选为选自以下之一种或多种：奎宁、盐酸奎宁、二盐酸奎宁、氯喹。在一个实施方案中，所述喹啉类化合物在所述药物组合物中的浓度(w/v)≥3％、优选为3-6％。
[0124]
在本申请公开中，术语“非动物生物活性成分”是指具有药学活性的植物和菌类的提取物及其类似物。术语“提取物”是指原料通过分离过程及其它加工过程获取的特定组分(例如基于特定结构的纯化物)。术语“类似物”是指虽不相同、但结构或/和性质上相似的天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。
[0125]
在本发明的范围内，所述植物活性成分选自具有以下之一种或多种结构的生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。
[0126]
在一个实施方案中，所述化疗药物选自以下组之一种或多种：抗病原体疾病化疗药物例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇，氨基酸类营养素例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽，无效芳香化合物例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁，非动物生物活性成分例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
[0127]
在一个实施方案中，所述组合物还还任选地包含选自常规佐剂的佐剂。在本申请公开中，术语“佐剂”是指与疫苗抗原混合后能增强机体针对疫苗抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的本发明公开的添加剂。根据这一定义，疫苗佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者起作用往往不必与疫苗抗原混合。
[0128]
在本申请公开中，术语“常规佐剂”是指本领域技术人员已知的任意合适佐剂，例如可以是油/乳佐剂。在本申请公开中，术语“油/乳佐剂”是指基于油或/和乳化物的佐剂(例如弗式佐剂、mf59)。
[0129]
根据本申请公开的半流体中的所述添加剂还可进一步任选地包括赋形剂。所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可包括例如以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂等。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述防腐剂例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)。
[0130]
在一个实施方案中，所述病原体疾病包括以下组之一种或多种：肿瘤、微生物感染。在一个实施方案中，所述病原体疾病选自肿瘤、优选为选自实体肿瘤。
[0131]
在本申请公开中，所用术语“实体肿瘤”是指有瘤体的任何恶性肿瘤。例如白血病、恶性淋巴瘤、等则是非实体肿瘤。
[0132]
在一个实施方案中，所述实体肿瘤优选为选自瘤体体积>85mm3、优选为≥200mm3、更优选为≥300mm3的实体肿瘤。
[0133]
在一个实施方案中，所述实体肿瘤包括：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
[0134]
在一个实施方案中，所述病原体疾病选自微生物感染。在一个实施方案中，所述微生物感染包括病毒感染和细菌感染。在一个实施方案中，所述病毒感染包括例如乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、爱滋病毒感染；所述细菌感染包括例如麻风、慢性粘膜皮肤念珠菌病。
[0135]
本发明还包括所述半流体药物组合物在制备用于所述局部病变的疫苗或免疫-化疗组合药物中的应用。
[0136]
根据本申请公开的药物组合物是用于治疗或抑制病原体疾病，还可与其它疗法相组合施用，例如介入疗法、全身化疗、其它免疫疗法(例如去免疫耐受的免疫疗法)、光动力疗法、声动力疗法、手术干预或此类疗法的组合，以进一步提高疗效。
[0137]
根据本申请公开的又一个方面，其提供一种用于治疗或抑制病原体疾病的药物组合物的制备方法，该药物组合物包含动物组织细胞的半流体和活性成分，所述方法包括以下步骤：
[0138]
a.提供包含所述细胞的制备物，所述制备物可以是以下组之一种或多种：天然细胞制备物、工程细胞、包含天然细胞的结缔组织、包含天然细胞的器官组织、天然细胞的富集组分,
[0139]
b.提供所述活性成分,
[0140]
c.将所述包含所述细胞的制备物与所述活性成分进行混合，如有必要对该混合物进行半流体化和/或严重损伤处理，以得到包含所述动物组织细胞和活性成分的半流体；或
[0141]
c.将包含所述细胞的制备物进行半流体化和/或严重损伤处理以得到半流体，在其中加入活性成分并进行混合，得到包含所述动物组织细胞和活性成分的半流体。
[0142]
根据本申请公开的再一个方面，其提供一种根据上述方法制备的药物组合物。
[0143]
如有涉及，本申请公开之前述方面中各相关术语的定义和描述也适用于此方面。
[0144]
在本发明的范围内，术语“液体组织”是指无容器限制时具有流动性的组织，其包括例如：血液、精液、唾液、液体工程组织等。
[0145]
根据本申请公开的严重损伤的半流体可以例如如下制备：将所提供组织进行严重损伤处理并获得半流体，或将上述组织制备为半流体后再进行严重损伤处理，其中所述严重损伤处理选自本申请公开的以下处理之一种或多种：粘稠化处理、机械破碎、凝固化处理、热处理、冻融处理、照射处理、化学处理，且在对该组织严重损伤处理前、或/和处理中加入本申请公开的活性成分(例如化疗药物、生物制品等)。
[0146]
在一个实施方案中，所述粘稠化包括浓缩和/或加入添加剂，其中所述添加剂选自包括细胞制品和/或增粘剂之一种或多种，其中所述增粘剂选自包括以下之一种或多种：聚乙二醇、淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮。
[0147]
在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括机械破碎。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、固体工程组织等经机械破碎严重损伤。
[0148]
在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括热处理。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、固体工程组织等经加热灭活，或血液或血液/工程细胞组合物经加热凝固且严重损伤。
[0149]
在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括冻融处理。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、血液、工程细胞等经冻融严重损伤。
[0150]
在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括照射处理。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、血液、工程细胞等经照射严重损伤。
[0151]
在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括化学处理。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心等的机械破碎物，或血液等液体组织加入适量酸、碱或乙醇严重损伤。
[0152]
在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括凝固化处理。例如，血液或血液/工程细胞组合物经自凝固、热凝固或加入凝固剂凝固严重损伤。
[0153]
在根据本申请公开的制备药物组合物的方法中，如上制备的半流体状的药物组合物可进一步进行分装，该分装物可作为制剂(优选为植入剂、更优选为注射剂)备临床使用、或进一步制备为冻干制剂(例如注射用粉针剂)备临床使用。
[0154]
在本申请公开中，术语“注射剂”是指合乎药政当局注射剂标准的可通过针管给药的药物。注射剂包括全身用药注射剂(例如静脉注射剂)和局部用药注射剂(例如皮下给药注射剂、肌内给药注射剂、组织内给药注射剂等)。
[0155]
在本发明的范围中，所述针管包括例如：常规注射器针管、常规穿刺针、常规植入针、常规灌注针。
[0156]
所述冷冻干燥处理的工艺条件例如包括：预冻条件为在预冻温度-45℃保持4小时；升华干燥条件为升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时；解吸附干燥
条件为30℃保持6小时。该冻干制备物可与液体介质(例如水或含增粘剂的水溶液)混合后直接局部给药。
[0157]
基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的药物显示出快速治疗和后续治疗、短效与长效的有机统一，且对患者正常组织几无损害，从而达到安全、有效治疗疾病的药学效果。
[0158]
实施例
[0159]
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的试验动物均依照相关法规及行业自律进行。如无特殊说明，所有试验均按常规方法进行。
[0160]
以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分添加剂列于表1中。
[0161]
表1
[0162][0163]
在本发明中，l-氨基酸均简写为氨基酸(例如l-精氨酸均简写为精氨酸)。
[0164]
以下实施例中所用的实验动物均为通过专业实验动物公司购入，均为spf(specific pathogen free，无特定病原体)级动物。以小鼠为例，共有5种：balb/c小鼠、c57bl/6小鼠、cb6f1小鼠、cc3hf1小鼠、裸小鼠，其中：cb6f1小鼠为balb/c
×
c57bl/6杂交f1代雌性小鼠(表型为h-2
b/d
)，cc3hf1小鼠为balb/c
×
c3h杂交f1代雌性小鼠(表型为h-2
d/k
)、裸小鼠为裸基因(nu)导入balb/c小鼠获得的突变系(balb/c
–
nu)小鼠。小鼠均为6-8周龄健康雌性、体重17.5-20.5g。除非另有说明，在以下实施例中，balb/c小鼠被简写为b鼠，c57bl/6小鼠被简写为c鼠。实验动物器官和组织均为通过实验动物公司购入或用实验动物依规作常规制备，包括：血液、骨髓、脊髓、皮、肠、胃、肉、胰腺、脾、肝、肺、软骨。人胎盘、人脐
带从法规规定的处置机构合法获得。
[0165]
在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验均依据药管当局颁发的试验指南、按常规的实体瘤细胞皮下接种方法进行。除非另有说明，实体瘤长至所需体积(例如小鼠荷瘤30-500mm3)则为建模成功，然后采用pems 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机分为若干个实验组，每组6只动物。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、动物移植物抗宿主病、实体瘤体积、瘤重、生存时间等。
[0166]
实体瘤体积计算公式如下：
[0167]
实体瘤体积(v)＝l/2
×
a
×
b2，其中a表示实体瘤长，b表示实体瘤宽。
[0168]
实体瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：
[0169]
抑瘤率y(％)＝(cw-tw)/cw
×
100％，其中tw为研究组的平均瘤重；cw为阴性对照组的平均瘤重。
[0170]
动物移植物抗宿主病的观察项目及评分如下表2所示。
[0171]
表2移植物抗宿主病评分
[0172]
观察指标0分1分2分体质量减轻<10％10％～25％>25％活动能力正常减弱静止不动皮毛正常轻度混乱色度差，混乱皮肤完整度正常脚趾、尾部轻度蜕皮严重脱毛姿势正常轻度弓背严重弓背向上
[0173]
每只动物评分为5项得分之和，最高10分，最低0分。
[0174]
移植物抗宿主率计算公式如下：
[0175]
抗宿主率z(％)＝(tp-cp)/10
×
100％，其中tp为研究组移植物抗宿主病评分的平均值；cp为阴性对照组移植物抗宿主病评分的平均值；10为每只动物移植物抗宿主病评分的可能最高值。
[0176]
在以下实施例中，实验结果(例如瘤重)采用均数
±
标准差(x
±
s)表示，两个实验动物组与组均数之间的差别采用统计学软件spss 19.0软件进行显著性检验来比较，检验选用统计量t来进行，检验水准α＝0.05，p<0.05表示差异有统计学意义，否则无统计学意义。
[0177]
在本发明的范围內，a药和b药的组合物记为b/a。以下实施例中，除非另有说明，a药和b药分别为包含动物组织细胞的半流体和活性组分。除非另有说明，a、b、a/b的药效均为抑瘤率。改善抗肿瘤药物的药效一直是世界最大的医药难题。哪怕百分之几的药效提高也难之又难，以致于联合用药的理论预期通常不高，而一旦实现就意义重大。药物联合使用产生的药效，理论上可依据于q判断进行：
[0178]
q＝实际合用效应/理论单纯相加预期效应。
[0179]
当q＝1时，实际合用效应符合理论预期，显示为相加作用；当q<1时，实际合用效应弱于理论预期，显示为拮抗作用；当q>1时，实际合用效应超理论预期，显示为协同作用。
[0180]
本发明中使用的q计算基于burgi法(burgi y.pharmacology；drug actions and reactions.cancer res.1978，38(2)，284-285)的金正均改进法(金正均，合并用药中的相
加，中国药理学报1980；1(2)，70-76)：
[0181]
q＝e
a+b
/(e
a
+e
b-e
a
·
e
b
)，
[0182]
其中e
a+b
为a药和b药实际合用效应，e
a
为a药单用效应，e
b
为b药单用效应，(e
a
+e
b-e
a
·
e
b
)为a药和b药理论单纯相加预期效应。为了更符合动物实验中的实际误差范围，他进一步用q＝1
±
15％代替q＝1作为相加作用的判定式。
[0183]
文献中常见的另一种抗肿瘤联合用药药效判断方法，基于显著性检验(例如p判断)。在以下抗肿瘤动物实验中，将既合乎q判断又合乎p判断的组合物的药学效应(抑瘤率)判断为实际合用效应与理论预期之间的明显关系：
[0184]
1)当0.85≤q≤1.15、以及e
a+b
与e
a
之间或e
a+b
与e
b
之间的差异无统计学意义(p≥0.05)，则判断为相加作用或未超预期的作用；
[0185]
2)当q<0.85、以及e
a+b
与e
a
之间和e
a+b
与e
b
之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显拮抗作用；
[0186]
3)当q>1.15、以及e
a+b
与e
a
之间和e
a+b
与e
b
之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显协同作用。
[0187]
实施例1：药物组合物的制备
[0188]
以下实施例中，所用动物组织细胞选自以下组之一种或多种：
[0189]
1)结缔组织和/或半固体组织中的天然细胞。例如，使用包含所需动物组织细胞的器官和/或组织(例如肌肉、脊髄、骨髓、血液等)；
[0190]
2)结缔组织组分和/或半固体组织组分中富集的所需细胞。例如，使用富含所需动物组织细胞的血液组分(例如细胞浓缩血液)；
[0191]
3)源自结缔组织和/或半固体组织的天然细胞制备物和/或工程细胞。天然细胞制备物包括纯化的天然细胞及其衍生物。例如，按照现有技术从天然血液分离获得的细胞沉淀、白细胞沉淀、红细胞沉淀、血小板沉淀。又例如，按照现有技术从骨髓等组织提取和制备的造血干细胞等。又例如，通过体外诱导、激活、扩增自体或异体的血细胞，例如dc细胞、lak细胞、til细胞、cik细胞、dc-cik、ctl细胞，tcr-t细胞、car-t细胞、nk细胞，γδ干细胞等。又例如，按照现有技术从动物脾经红细胞裂解去除处理后获得淋巴细胞：将动物处死后取脾并温和破碎，再分别加入无血清dmem培养液、红细胞裂解液(0.0075％氯化铵/0.0026％tris除菌水溶液解并稀释至500ml)，温和搅拌后静止5钟，进行离心洗涤3次(离心条件为1 000rpm/min，沉淀重悬液为无血清dmem)，最后获得淋巴细胞沉淀。
[0192]
1、包含动物组织细胞的半流体的制备
[0193]
通过本发明公开的方法，可以制备包含动物组织细胞的半流体。下表3列举了本实施例制备的部分包含动物组织细胞的半流体(制备物编号)、用以制备它的优选组织、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
[0194]
表3
[0195][0196][0197]
细胞比容：半固体组织的细胞比容由相关动物实验公司的兽医提供，血液的细胞比容按血常规测定方法测定(例如使用全自动血液细胞分析仪bc 5000)。例如，43％细胞比
容的小鼠血液中的细胞浓度为11
×
109个/ml。
[0198]
作用：a表示半流体化的有无(+为有)，b表示严重损伤的有无(+为有)。
[0199]
结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100ul上表中的制备物注射至balb/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。当细胞悬浮液的细胞比容≥77％时，其转化为半流体粘稠物。除半流体粘稠物(x25)为0.1-0.5日外，其它半流体结节的皮下半消失期为1-30日。当细胞悬浮液的细胞比容≥70％时，其转化为半流体粘稠物。
[0200]
小鼠：表中的小鼠均为balb/c小鼠。
[0201]
以下列出本发明的半流体的制备试验的几个例子。
[0202]
实施例1a：从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织20g，即为上表中可注射半流体制备物x1。如将x1置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸30分钟，便获得上表中制备物x2。
[0203]
实施例1b：将20g取自小鼠的瘦肉块经组织提取(剥离除去脂肪、膜、筋、血管)，所获小鼠肌肉组织为半固体组织，然后将其置于搅拌机中破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)，便获得横截面平均尺寸小于1mm
×
1mm的、肉眼可辨的肌肉组织颗粒(上表中制备物x5)。剪切破碎转速和时间可如此没置，以致于所获颗粒的横截面平均尺寸为≥100nm，优选为500nm-0.8mm或1μm-0.8mm。制备物x5可在压力下产生不可逆变形，是为半流体。如进一步将x5置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物x6。
[0204]
如进一步将x5置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物x7。如进一步将x5置于塑料袋中密封好，放入超声仪(温度5-25℃、工作频率10-30khz、)中处理5-10分钟，便获得上表中制备物x8。
[0205]
使用与x5制备相同的方法，可分别进行上表中制备物x3、x9、x10、x11、x20和x21的制备。使用与x6制备相同的方法，可进行上表中制备物x4的制备。
[0206]
实施例1c：将20g取自猪背的皮块经组织提取(剥离除去脂肪)，所获皮组织为半固体组织，然后置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸120分钟，再趁热置于搅拌机中剪切破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)，便获得上表中制备物x12。x12加热(例如60-100℃)为半流体，可分装至注射器，在加热(例如60℃)时即可作为可注射疫苗使用。
[0207]
实施例1d：处死一只新西兰免并取15ml免血，在室温下静置30分钟，便获得自凝固血液(上表中x13)。
[0208]
实施例1e：处死一只新西兰免并取15ml免血于预置抗凝剂枸橼酸钠的杯中，慢搅拌均匀后将杯加可透气盖，再放在蒸汽(约100℃)中蒸20-50分钟，便获得热凝固血液(上表中x14)。使用与x14制备相同的方法，可分别进行上表中制备物x15和x16的制备。
[0209]
实施例1f：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，混合在杯中获得约6ml血液，将杯放入超声仪(温度5-25℃、工作频率10-30khz、)中处理1-30分钟，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物x17。
[0210]
实施例1g：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，加入预置凝血剂(例如终浓
度10-100u/1ml的凝血酶和5-25mmol/l的氯化钙)的杯中混合均匀，静置30分钟后获得半固体凝固物，再经搅拌破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)便获得上表中制备物x18。
[0211]
实施例1h：从多只小鼠眼眶分别取血，离心去除40％血清后加入杯中，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物x19。
[0212]
使用人血液通过相同制备便获得上表中制备物x20。
[0213]
实施例1i：利用穿刺针在猪后腿上进行肌肉组织取样，然后将高度破坏的肌肉组织抽入注射器针筒，便获得上表中制备物x23。
[0214]
实施例1j：利用抽血针在马耳上抽出约10ml血液，然后取小针头将盛有血液的针筒竖立在微波炉中加热1分钟，便获得上表中制备物x24。
[0215]
实施例1k：从多只小鼠眼眶分别取血，离心去除45％血清后便获得上表中制备物x25。
[0216]
实施例1l：从生产除白红细胞(血液离心+白细胞分选富集)时被滤除的人白细胞沉淀，便获得上表中制备物x26。
[0217]
实施例1m：将0.6g小鼠淋巴细胞沉淀和0.4g小鼠血液加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物x27。
[0218]
实施例1n：将4g人血浆与6g取自脱白细胞滤器中的人白细胞沉淀混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物x28。
[0219]
这些制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可使用。
[0220]
2、本发明组合物以及药物的制备
[0221]
本发明的包含动物组织细胞的半流体作为活性成分的协同成分用于药物制备。其中所述活性成分包括生物制品和/或化疗药物。
[0222]
化疗药物和绝大多数生物制品通过商业途径获得(例如表1)。
[0223]
本实施例所用肿瘤抗原按如下方法制备：将肿瘤细胞液(10
8-109个细胞/ml)进行常规的冻融灭活处理(放入低于-80℃液氮中30分钟，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化进行3次)后，经常规的肿瘤细胞移植瘤实验验证为不致瘤，即可用作肿瘤抗原，包括自各自肿瘤细胞液获得的肿瘤抗原包括自各自肿瘤细胞液获得的以下肿瘤抗原：肉瘤抗原(s180细胞)、肝癌抗原(h22细胞)、结肠癌抗原(ct26细胞)、乳腺癌抗原(4t1细胞)、黑色素瘤抗原(b16细胞)、肺癌抗原(llc细胞)。
[0224]
通过本发明公开的制备方法，在动物组织细胞半流体化或/和严重损伤处理前、中、后加入活性成分并适当混合，便制备出本发明的包含动物组织细胞的半流体和活性成分的组合物。下表列举了本实施例制备的部分半流体组合物(制备物编号)、用以制备它的优选组织和优选活性成分、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
[0225]
表4
[0226][0227][0228]
作用：a表示半流体化的有无(+为有)，b表示严重损伤的有无(+为有)。
[0229]
结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100ul上表中的制备物注射至balb/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。上述半流体结节的皮下半消失期为1-30日。
[0230]
小鼠：表中的小鼠均为balb/c小鼠。
[0231]
混合搅拌：在本实施例中，除非另有说明，混合搅拌为机械搅拌(转速10-10000转/分、总时间1-3分钟)，其可造成组织的机械破碎和机械损伤。
[0232]
以下列出本发明的包含动物组织细胞和活性成分的半流体的制备试验的几个例子。
[0233]
实施例1o：将4.9g从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织与0.1g多西紫杉置于搅拌机中搅拌(转速1000-2000转/分、总时间1-3分钟)，便获得上表中y1(2％多西紫杉/98％猪脊髄半流体组合物)。如进一步将该y1置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20-50分钟，便获得上表中的y2。
[0234]
使用与y1制备相同的方法，可进行上表中制备物y3的制备。
[0235]
使用与y2制备相同的方法，可分别进行上表中制备物y4、y5的制备。
[0236]
实施例1p：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.9g该血液与0.1g5-fu在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物y6。
[0237]
使用与y6制备相同的方法，可分别进行上表中制备物y7、y8、y9的制备。
[0238]
实施例1q：将4.95g从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织与0.05g cpg odn置于搅拌机中搅拌(转速1000-2000转/分、总时间1-3分钟)，便获得1％cpg odn/99％猪脊髄半流体组合物(制备物y10)。如进一步将该y10置于杯中并加可透气盖，放在水浴(约60℃)中加热5-50分钟，便获得热处理1％cpg odn/99％猪脊髄半流体组合物(制备物y11)。
[0239]
使用小鼠肌肉组织和与y10制备相同的方法，可制备1％cpg odn/99％小鼠肌肉半流体组合物(制备物y12)。
[0240]
使用小鼠肌肉组织组织和与y11制备相同的方法，可制备热处理1％cpg odn/99％小鼠肌肉半流体组合物(制备物y13)。
[0241]
实施例1r：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将5g该血液与500万单位α干扰素在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸20-15分钟，便获得500万单位α干扰素/5g小鼠血液半流体组合物(制备物y14)。
[0242]
当使用其它动物的血液、或使用其它细胞因子时使用相同的方法，可分别制备细胞因子/血液半流体组合物(例如y15)。
[0243]
实施例1s：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.95g该血液与0.05g抗pd-1抗体在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸20-15分钟，便获得1％抗pd-1抗体/99％小鼠血液半流体组合物(制备物y16)。
[0244]
当使用其它动物的血液、或使用其它免疫调节类抗体时使用相同的方法，可分别制备免疫调节类抗体/血液半流体组合物。
[0245]
实施例1t：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽
(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物y17。
[0246]
当使用其它癌细胞冻融灭活液时使用相同的方法，可制备y19。
[0247]
实施例1u：1.5ml人血液与1ml乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物y18。
[0248]
实施例1v：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肺癌细胞液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物y20。
[0249]
实施例1w：将0.2ml小鼠淋巴细胞沉淀(细胞比容72％)、0.2ml肝癌细胞液(109个细胞/ml)、0.6ml小鼠血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物y21。
[0250]
实施例1x：将0.6ml小鼠淋巴细胞沉淀(细胞比容72％)、10mg亚甲蓝肝、0.39ml小鼠血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物y22。
[0251]
实施例1y：将0.3g人白细胞沉淀(细胞比容77％)、0.2ml肝癌细胞液(109个细胞/ml)、0.5ml人血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物y23。
[0252]
实施例1z：将0.6g人白细胞沉淀、10mg亚甲蓝、0.39ml人血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物y24。
[0253]
这些制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为疫苗使用。
[0254]
实施例2：生物制品/包含动物组织细胞的半流体组合物协同作用方案
[0255]
在本发明的组合物中，包含动物组织细胞的半流体可以提供免疫协同所需的免疫原性。以下实验研究了该免疫原性的技术方案之中的必要条件。
[0256]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积206mm3)随机分为6个试验组(如下表所示)。试验组分为1个阴性对照组(0组)和5个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0257]
人白细胞沉淀、人血浆为按照现有技术抽取并获得正常血液后通过离心分离获得。人白细胞液为人白细胞沉淀(血细胞比容70.5％)加入等体积生理盐水获得的血细胞比容为35％的稀释液体。血细胞比容按常规方法测定。50％人血浆为50％人血浆和等体积50％生理盐水的混合物。人白细胞/人血漿为人白细胞沉淀加入等体积人血浆(血细胞比容为35％)的混合物经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物y9的制备方法制备)。人白细胞/人血漿半固体为上述人白细胞/人血漿中加入猪凝血酶(终浓度100u/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/l)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm3的小块使用。
[0258]
各实验组均在左腋皮下注射用药一次，每次用药200μl/只。研究组5通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表5。
[0259]
表5
[0260]
组号研究药物形态结节瘤重(x
±
s)抑瘤率0生理盐水液体-0.92
±
0.18g-150％人血漿液体-0.89
±
0.11g3％2人白细胞液/人血漿液体-0.84
±
0.19g8％3人白细胞液液体-0.87
±
0.10g5％4人白细胞/人血漿半流体半流体+0.61
±
0.10g43％5人白细胞/人血漿半固体半固体+0.75
±
0.26g19％
[0261]
注：+为形成结节，-为不形成结节；x为瘤重平均值(g,以下表皆相同)。
[0262]
在上表中,研究组1、2、3的抑瘤率均低。在研究组1、2、3之间,研究组2的q判断(q＝1.13)显示出相加作用,然而研究组2与1之间、和2与3之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为p＝0.0931>0.05、p＝0.3762>0.05),于是组2显示的相加作用并不明显。该结果说明,白细胞(甚至超高浓度异种白细胞)液体、人血浆液体、以及白细胞/人血浆组合物液体均未显示出明显的肿瘤负荷减小效应。
[0263]
然而，研究组2、4、5的抑瘤率相差较大。研究组4的药效不仅超过研究组2和研究组5的药效，甚于显示出超过这两组加和作用的药效(q＝1.69>1.15),且研究组4与2之间、4与5之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0271<0.05、p＝0.0472<0.05)。该结果说明,既使组成相同、浓度相同、用药方式相同，只须形态结构不同(液体、半流体、半固体)，包含细胞的物质便有可能显示出明显不同的肿瘤负荷减小效应。这显示出半流体可能与液体和半固体具有完全不同的免疫作用机理。
[0264]
以上结果及更多类似研究说明,包含动物组织细胞的半流体显示出明显超过同组成液体、半固体、甚至液体和半固体效应之和的理论预期药效,有可能为具有免疫作用的生物制品提供免疫协同。以下实验对此进行了进一步验证。
[0265]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肉瘤s180细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积342mm3)随机分为13个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和2个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和10个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0266]
c小鼠为c57bl/6小鼠，b小鼠为balb/c小鼠。动物组织细胞分别包含在血液和肌肉中。小鼠肌肉半流体为以小鼠肉为原料按实施例1中的制备物x5的制备方法制备的半流体。4种小鼠血液制备如下：天然血液(血细胞比容42％、4341％)为取自小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液。分出6ml天然血液离心，取出3ml血清，把离心管中剩下部分混匀为小鼠浓缩血液(血细胞比容68％)。将2ml血清与2ml天然血液混匀为小鼠稀释血液(1)(血细胞比容22％)。再将剩下的1ml血清与2ml天然小鼠血液混匀为小鼠稀释血液(2)(血细胞比容33％)。各血液的血细胞比容按常规方法测定。各小鼠血液半流体为相应的小鼠血液经加热凝固形成的半流体(分别按实施例1中的制备物x16、x19的制备方法制备)。小鼠血液半固体为小鼠血液中加入猪凝血酶(终浓度100u/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/l)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm3的小块使用。
[0267]
各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射为在左腋皮下注射)用药1次，每次用
药400μl/只。研究组10通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。在该实验中，对研究组1、3、5和7-11的给药可被视作同种异基因给药模型(可以代表99％以上的同种异体给药)，对其它研究组的给药可被视作全相合给药模型和自体给药模型。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表6。
[0268]
表6
[0269][0270]
*：+为形成结节，-为不形成结节
[0271]
在上表中，研究组1、2、3、4的抑瘤率均低，它们与各自的阴性对照组之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为p＝0.9332>0.05、p＝0.5340>0.05、p＝0.3788>0.05、p＝0.5458>0.05)。该结果说明，无论是包含同基因细胞还是异基因细胞的血液、是静脉给药还是皮下给药，细胞的液体包容物均未显示出明显的肿瘤负荷减小效应。更一般地，细胞的液体包容物可能难以优选作为能够明显减小瘤体的抗原。
[0272]
实际上，通常认为对肿瘤患者行同种异基因输血会引起白细胞介素-2、白细胞介素-10和白细胞介素-24分泌增加，抑制辅助t淋巴细胞分泌白细胞介素-2，使b淋巴细胞的刺激应答和抗体生成减少，产生细胞免疫的负向调节。于是，异基因血液被看作是免疫效应细胞的潜在抑制剂，也是免疫抑制细胞的刺激剂，这些免疫抑制作用可使有益的抑瘤免疫功能下调。可是，在上表中，研究组5和6均显示出较高的抑瘤率。它们各自与阴性对照组之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0004<0.05、p＝0.0002<0.05)。更进一步，研究组5和3之间(p＝0.0005)、5和1之间(p＝0.0004)、6和4之间(p＝0.0001)、6和2之间(p＝0.0002)的瘤重差异也都有统计学意义(p<0.05)。而研究组5和6之间的瘤重差异无统计学
意义(p＝0.1375>0.05)。以上结果说明，细胞包容物(例如血液)能否作为明显减小瘤体的抗原与其状态(是液体还是半流体)的相关性明显高于其基因异同。
[0273]
在上表中，研究组10的抑瘤率小于研究组9，而研究组10和9之间的瘤重差异有统计学意义(p＝0.0147<0.05)。该结果进一步说明，作为明显减小瘤体的抗原的包含细胞的物质的优选状态为半流体，而非半固体。此外，半流体相较半固体还具有临床应用的较高操作便利性和较高患者顺应性。
[0274]
此外，在c小鼠血液半流体研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组5、研究组9、研究组8、研究组7。其中，研究组7和3之间(p＝0.2139)的瘤重差异无统计学意义(p>0.05)，而研究组8、9、5分别和7的瘤重差异有统计学意义(分别为p＝0.0107<0.05、p＝0.0227<0.05、p＝0.0008<0.05)。此外，研究组11(小鼠肌肉组织细胞比容高于60％)的抑瘤率分别与研究组和6相当，它们之间的瘤重差异无统计学意义(p＝0.5241>0.05)。该结果说明，血液半流体(更一般地，包含细胞的半流体)能否作为明显减小瘤体的抗原与其所含细胞的浓度(>22％、优选为≥33％)的相关性高于其细胞异同。
[0275]
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的组合物中的免疫协同组分包含动物组织细胞的半流体提供免疫协同的必要条件为：其组成和形态使得其在用药处形成激活有效免疫应答的半流体结节。所述包含动物组织细胞的半流体的组成和形态使得其在用药处形成激活有效免疫应答的半流体结节。该必要条件似乎就是要在体内局部形成在生理组成和形态上类似于病变(例如瘤体)组织、又更容易被机体有效识别(例如高度偏离天然状态或高度损伤的半流体)并激发针对它以及与它类似病变(例如瘤体)的有效特异性免疫响应。于是，本发明的组合物中包含动物组织细胞的半流体提供免疫协同的基本技术方案为：
[0276]
包含动物组织细胞的半流体作为组合物的免疫协同组分应用；
[0277]
上述半流体中所含动物组织细胞远离其天然环境、优选为处于易被免疫系统辨识为严重损伤组织的环境。此外，本发明的半流体组合物所含动物组织细胞优选为严重损伤细胞(例如失去增殖活性的细胞)。严重损伤细胞通常可暴露细胞内容物(例如细胞膜破坏释放出的细胞内容物)；
[0278]
上述包含动物组织细胞的半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含所述细胞的半流体粘稠物、包含所述细胞的凝固物、包含所述细胞的非液组织的破碎物、包含所述细胞的凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含所述细胞的凝固物、包含所述细胞的非液组织的破碎物、包含所述细胞的凝固物的破碎物。与包含细胞的天然组织相比较，这些包含细胞的半流体显现出高度偏离天然状态或高度损伤的状态；
[0279]
上述包含细胞的半流体包含在局部用药中(例如所述药物的瘤区用药和/或瘤外局部用药中)；
[0280]
上述包含细胞的半流体为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶化)结节。
[0281]
此外，所述半流体所包含的细胞的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)、45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)、或55％-86％(或细胞浓度为14.0
×
10
9-22
×
109个细
胞/ml)。在其中所述半流体粘稠物组合物中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为≥70％(或细胞浓度为≥17.9
×
109个细胞/ml)、优选为70％-86％(或细胞浓度为17.9
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0282]
以下实验在上述半流体技术方案基础上研究了组合技术方案。
[0283]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积236mm3)随机分为16个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和3个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和11个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0284]
所用乳腺癌抗原为从按上述相同建模方法获得的荷乳腺癌小鼠的瘤体再经实施例1所述方法制备获得的乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)。所用细胞包含在血液中。4种小鼠血液制备如下：天然血液(血细胞比容42％、4143％)为取自小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液。分出6ml天然血液离心，取出3ml血清，把离心管中剩下部分混匀为小鼠浓缩血液(血细胞比容68％)。将2ml血清与2ml天然血液混匀为小鼠稀释血液(1)(血细胞比容22％)。再将剩下的1ml血清与2ml天然小鼠血液混匀为小鼠稀释血液(2)(血细胞比容33％)。各血液的血细胞比容按常规方法测定。各乳腺癌抗原/小鼠血液为40％乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)和60％各小鼠血液的混合物。各乳腺癌抗原/小鼠血浆半流体为各乳腺癌抗原/小鼠血液经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物y19的制备方法制备)。小鼠天然血液半流体为小鼠血液经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物x16的制备方法制备)。
[0285]
在该实验中，对研究组的给药可被视作同种异基因给药模型(可以代表99％以上的同种异体给药)。各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射均在左腋皮下注射)用药一次，每次用药400μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表7。
[0286]
表7
[0287][0288]
结节：+为形成结节，-为不形成结节
[0289]
*：小鼠血液半流体抑瘤率：根据相关实验，稀释小鼠血液的半流体的抑瘤效应小于100％小鼠血液的半流体
[0290]
在上表中，在行静脉注射的研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝0.83<0.85)显示出拮抗作用，然而研究组3与1之间、3与2之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为p＝0.7662>0.05、p＝0.9317>0.05)，于是组合物组未显示出明显拮抗作用。在行皮下注射的研究组6、5、4之间，组合物组的q判断(q＝0.79<0.85)显示出拮抗作用，然而研究组6与4之间、
6与5之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为p＝0.3274>0.05、p＝0.7771>0.05)，于是组合物组未显示出明显拮抗作用。该结果说明，液体组合物无论行静脉注射还是皮下注射，均未显示出协同作用、甚至未显示出明显加和作用。
[0291]
然而，在行皮下注射的研究组8、7、5之间，组合物组的q判断(q>1.77>1.15)显示出协同作用，且研究组8与5之间、8与7之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0006<0.05、p＝0.0327<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。该结果说明，包含动物组织细胞的液体和半流体与活性组分之间具有完全不同的相互作用。
[0292]
在上表中，行皮下注射的组合物研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组14、研究组8、研究组12、研究组10。在研究组10、9、5之间，组合物组的q判断(q＝0.95)显示出相加作用，但研究组10与5之间的瘤重差异有统计学意义(p＝0.0288<0.05)、10与9之间的瘤重差异却无统计学意义(p＝0.2850>0.05)，于是组合物组未显示出明显相加作用、更无协同作用。随着血细胞比容增加，在研究组12、11、5之间，组合物组的q判断(q＝1.29>1.15)显示出协同作用，且研究组12与5之间、12与11之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0012<0.05、p＝0.0274<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。更进一步，在研究组14、13、5之间，组合物组的q判断(q＝1.25>1.15)显示出协同作用，且研究组14与5之间、14与13之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0001<0.05、p＝0.0283<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。该结果说明，包含细胞的半流体对生物制品的协同作用依赖于细胞比容。细胞比容也许参与决定了半流体在体内形成的结节的诸多性质(例如柔软度)，从而参与决定了其协同效应。
[0293]
使用实施例1中的其它制备物(例如y14-y18、等)，也可获得类似结果。
[0294]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积215mm3)随机分为8个试验组，包括1个阴性对照组和7个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0295]
所用pd-(l)1抗体为商业渠道获得，所用细胞包含在血液中。pd-(l)1抗体药物均为所示浓度的水溶液，小鼠血液均取自balb/c小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液，小鼠血液半流体为实施例1中的制备物x16，不同重量比的pd-(l)1抗体/小鼠血液半流体按实施例1中的制备物y16的制备方法制备。
[0296]
在该实验中，对研究组的给药可被视作同基因给药模型(可以代表异体同基因给药和自体给药)。各实验组均在左腋皮下注射用药一次均如下表所示用药方式(皮下注射为均在左腋皮下注射)用药一次，每次用药250μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表8。
[0297]
表8
[0298][0299]
在上表中，在pd-(l)1抗体/血液半流体组合物研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组7、研究组6、研究组5。在研究组5、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.11)显示出相加作用，但研究组5与2之间的瘤重差异有统计学意义(p＝0.0019<0.05)而研究组5与1之间的瘤重差异无统计学意义(p＝0.2980>0.05)，于是组合物组显示出不明显的相加作用。然而，在研究组6、3、1之间，组合物组的q判断(q＝1.30>1.15)显示出协同作用，且研究组6与3之间、6与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0003<0.05、p＝0.0060<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。进一步，在研究组7、4、1之间，组合物组的q判断(q＝1.54>1.15)显示出协同作用，且研究组7与4之间、7与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0003<0.05、p＝0.0038<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。根据该结果及更多结果，pd-(l)1抗体与半流体组合物(更一般地，与它们同类的免疫调节类抗体与半流体组合物)的协同量比(w：w)为>0.05/100，优选为≥0.1/100。
[0300]
以下更多的实验证实了上述协同量比的范围。
[0301]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肉瘤s180，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积251mm3)随机分为8个试验组(1个阴性对照组和7个研究组)，并在动物瘤内给药。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0302]
0.1％卡介苗、人重组干扰素50万iu/ml分别为以注射用水配制的液体。所用细胞包含在血液中。小鼠血液半流体为实施例1的x16，0.1％卡介苗/99.9小鼠血液半流体、人重组干扰素/小鼠血液(50万iu/ml)半流体分别为所示量的生物制品与小鼠血液的混合物的热凝固物(按实施例1的y14或y18的制备方法制备。
[0303]
各实验组均瘤内用药一次，每次用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表9。
[0304]
表9
[0305]
组号研究药物量比瘤重(x
±
s)抑瘤率0生理盐水-1.73
±
0.26g-1小鼠血液半流体-1.28
±
0.33g26％
20.1％卡介苗-1.45
±
0.31g16％30.1％卡介苗/99.9％小鼠血液半流体0.1/1000.81
±
0.22g53％4人重组干扰素50万iu/ml-1.51
±
0.35g13％5人重组干扰素/小鼠血液(50万iu/ml)半流体1/1000.90
±
0.20g48％
[0306]
在上表中，在研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.20>1.15)显示出协同作用，且研究组3与2之间、3与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0022<0.05、p＝0.0166<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组5、4、1之间，组合物组的q判断(q＝1.33>1.15)显示出协同作用，且研究组5与4之间、5与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.004<0.05、p＝0.0379<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。
[0307]
上述结果及更多类似研究说明，包含本发明的动物组织细胞和抗病原体疾病生物制品的半流体组合物对病原体致病变组织有协同破坏作用。该协同作用的形成，有可能是因为本发明的包含动物组织细胞的半流体作为免疫成分(抗原)协同、或/和作为缓释载体协同。病原体致病变组织的加大破坏有利于內源疫苗的生成。
[0308]
实施例3：包含动物组织细胞的半流体的特异性免疫原研究及优选
[0309]
包含动物组织细胞的半流体的特异性免疫原是其在本发明的组合物中作为免疫协同组分的基础。以下实验对此进行了研究，并在此基础上对所述动物组织细胞进行了优选。
[0310]
在一个试验中，试验动物为cb6f1小鼠，建模细胞为肝肿瘤h22细胞，以2
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物中，一部分用于制备瘤体颗粒半流体，另一部分(瘤体平均体积213mm3)随机分为10个试验组(如下表所示，包括1个阴性对照组(0组)和9个研究组)。阴性对照物为生理盐水，8个研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0311]
所用细胞包含在血液或肉中。cb6f1小鼠浓缩血液和cb6f1小鼠浓缩血液半流体的制备与实施例2中的制备相同。cb6f1小鼠肌肉块为一体积约400mm3的块状小鼠肉。4种小鼠肌肉颗粒半流体和cb6f1小鼠瘤组织颗粒半流体的制备如下：分别剥取4种小鼠的肉块和荷肝癌cb6f1小鼠的瘤体，再分别将它们置于搅拌机中破碎(转速1000-10000转/分、总时间1-3分钟)，各自获得横截面平均尺寸小于1mm
×
1mm的、肉眼可辨的组织颗粒(按实施例1中的制备物x5的制备方法制备)。猪肌肉颗粒半流体为实施例1中的制备物x4。马血液半流体为实施例1中的制备物x24。
[0312]
各实验组均在左腋皮下用药1次，用药400μl/只。研究组3通过手术将小鼠肌肉块移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射至cb6f1小鼠左肋皮下。在该实验中，对研究组1-4和8的给药可被视作全相合给药移植模型或自体给药模型，对研究组5的给药可被视作同种半相合给药模型，对研究组6的给药可被视作同种异基因给药模型，对研究组7的给药可被视作异种给药模型。给药后第14日对动物进行移植物抗宿主病评分测量，然后处以安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表10。
[0313]
表10
[0314][0315]
通常认为，分子形态的抗原(例如全肿瘤细胞抗原、异源糖蛋白抗原、异基因细胞抗原、亚单位抗原)有着与正常机体明显不同的独特结构成分(例如病原体相关分子模式，pathogen-associated molecular patterns，pamps)，而机体内的天然免疫系统细胞上存在可识别这些结构成分(例如pamp)的模式识别受体(pattern-recognition receptors，prrs)，prrs被刺激并启动适应性免疫应答去攻击相同或类似的结构成分(例如肿瘤细胞中的交叉抗原成分)。于是，异源或异基因移植物通过其抗原分子(例如异源糖蛋白、异基因细胞等)介导的较高的移植物抗宿主反应可以导致较高的移植物抗肿瘤反应性。
[0316]
在上表中，研究组2和1之间比较，其抗宿主病评分无统计学意义(p＝0.3016>0.05)，说明其移植排斥免疫原性(针对宿主正常细胞和肿瘤细胞)相当，然而其瘤重差异(针对宿主瘤体)却有统计学意义(p＝0.0023<0.05)。研究组4和3之间比较，其抗宿主病评分有统计学意义(p＝0.0034<0.05)，说明其移植排斥的免疫原性(针对宿主细胞)明显不同，然而瘤重差异(针对宿主瘤体)却无统计学意义(p＝0.8408>0.05)。根椐这些结果，包含细胞的半流体作为实体瘤疫苗抗原的表现与其抗宿主反应没有明显的正相关性。于是，在本发明公开的必要条件下，本发明的包含细胞的半流体的抗原性显示出明显不同于现有技术中的移植物(通常为液体或半固体)，后者的抗肿瘤免疫原性往往与其移植排斥免疫原性正相关。
[0317]
在上表中，小鼠肌肉颗粒半流体的移植物抗宿主病评分(抗宿主率)由大至小依次为研究组7、研究组6、研究组5和研究组4，大致反应了移植物抗宿主病与异分子抗原(异源抗原和异基因抗原)的相关性。例如，研究组7和4之间的抗宿主病评分有统计学意义(p＝0.0040<0.05)。然而，研究组7和4之间的瘤重差异却无统计学意义(p＝0.6085>0.05)。通常认为，在常规移植物的免疫反应中，异种抗原性远高于同基因抗原性。在上表中，在本发明公开的必要条件下，尽管研究组9(含马血液)和2(含鼠血液)之间的移植物抗宿主病评分的差异确有统计学意义(p＝0.0005<0.05)，但它们之间的瘤重差异却无统计学意义(p＝0.7295>0.05)。
[0318]
此外，本实验的一个初衷，是将cb6f1小鼠肌肉颗粒半流体作为cb6f1小鼠瘤体颗
粒半流体的阴性对照物来研究的。然而在上表中，研究组8(药物组织富含瘤细胞)和研究组4(药物组织不含瘤细胞)的瘤重差异无统计学意义(p＝0.8375>0.05)。
[0319]
使用实施例1中的其它制备物，也可获得类似结果。例如，在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。建模后14日，成功建模的荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为306mm3)随机分为8个试验组(如下表所示，包括1个阴性对照组和7个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示，均选自实施例1的制备物。各实验组均在左腋皮下用药1次，用药400μl/只，用药后10天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表11。
[0320]
表11
[0321]
组号研究药物所包含的组织抑瘤率0生理盐水-01x10猪肺23％2x11猪肝25％3x12猪皮21％4x20人胎盘36％5x21人脐带37％6x22猪肌肉组织33％7x23猪血液38％
[0322]
本实施例的以上结果，进一步证实了本发明组合物中的包含动物组织细胞的半流体具有不同于常规移植物(通常为流体、半固体或固体)的针对病原体致病变组织(例如瘤体)的免疫原性，后者的抗原性通常与其异分子(例如异基因抗原分子、异源抗原分子等)的抗宿主抗原性相关。而本发明的包含动物组织细胞的半流体似乎具有与高度损伤的病原体致病变组织(例如瘤体组织)相当的抗实体肿瘤免疫原性。
[0323]
根据上述研究及更多的类似研究，在本发明公开的必要条件和优选条件下，包含动物组织细胞的半流体显示出针对病原体及其所致局部病变的免疫活性，从而可以应用为本发明的组合物中的协同免疫组分。本发明的组合物中的包含动物组织细胞的半流体应用的技术方案进一步优选如下：本发明的半流体优选为其优势抗原性为抗所述病原体致病变组织(例如瘤体)而非抗宿主抗原性的半流体，例如抑瘤率为≥抗宿主率、优选为≥150％抗宿主率的半流体。于是：
[0324]
本发明的半流体所包含的必要动物组织细胞的来源不包括肿瘤细胞体组织、优选为选自非瘤体组织；
[0325]
本发明的半流体所包含的必要动物组织细胞在半流体中优选为处于远离自然状态、或处于远离自然状态或严重损伤的组织中。
[0326]
本发明的半流体所包含的必要动物组织细胞不包含移植物抗宿主反应强烈的细胞本发明的半流体所包含的必要动物组织细胞不包括移植物抗宿主反应强烈的细胞(例如富含异种糖蛋白抗原)，优选为选自移植物抗宿主反应不大的细胞，例如以下组之一种或多种：并不富含异种糖蛋白抗原的异种细胞、并不富含异基因抗原的同种细胞，更优选为选自
5小鼠血液半流体皮下注射1.87
±
0.15g5％
[0335]
在上表中，研究组5与02之间的瘤重差异无统计学意义(p＝0.437>0.05)。该结果及更多类似研究说明，本发明组合物中的包含细胞的半流体主要是作为胸腺依赖抗原在先前的荷瘤小鼠皮下注射中显示出免疫抑瘤效应。
[0336]
然而在上表中，研究组2与3之间、研究组2与01之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0043<0.05和p＝0.0014<0.05)。而研究组2与4之间、研究组1与4之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为p＝0.2096>0.05、p＝0.2783>0.05)。该结果及更多类似研究说明，本发明的半流体除了可以作为胸腺依赖抗原应用于免疫协同，还可以作为非胸腺依赖的组织破坏成分应用于化疗协同。众所周知，瘤体组织的破坏可能次生地释放出肿瘤抗原(原位)并产生疫苗效应。
[0337]
在一个试验中，试验动物为裸小鼠，建模细胞为肉瘤s180，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积209mm3)随机分为10个试验组(1个阴性对照组和9个研究组)，并在动物瘤内给药。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0338]
细胞包含在血液中。血液半流体为取自其它裸小鼠的血液按实施例1中x16的制备方法制备，0.5％5-fu、0.5％亚甲蓝、10％精氨酸/10％甘氨酸分别为化疗药物的水溶液，其它药物为取自其它裸小鼠的血液分别按实施例1中y6、y8、y9的制备方法制备的化疗药物/自体血液半流体组合物。各实验组均瘤内用药一次，每次用药200μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表13。
[0339]
表13
[0340]
组号研究药物瘤重(x
±
s)抑瘤率0生理盐水1.87
±
0.17g-1裸小鼠血液半流体*1.35
±
0.21g28％20.5％5-fu1.27
±
0.18g32％30.5％5-fu/99.5％裸小鼠血液半流体0.71
±
0.25g62％41％5-fu/99％裸小鼠血液半流体0.49
±
0.08g74％50.5％亚甲蓝1.63
±
0.28g13％60.5％亚甲蓝/99.5％裸小鼠血液半流体0.92
±
0.21g51％71％亚甲蓝/99％裸小鼠血液半流体0.65
±
0.07g65％810％精氨酸/10％甘氨酸1.40
±
0.29g25％910％精氨酸/10％甘氨酸/80％裸小鼠血液半流体0.92
±
0.12g51％
[0341]
小鼠血液半流体抑瘤率：根据相关实验，稀释小鼠血液的半流体的抑瘤效应小于100％小鼠血液的半流体
[0342]
在上表中，研究组4的抑瘤率高于研究组3，研究组7的抑瘤率高于研究组6。在研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.22>1.15)显示出协同作用，且研究组3与2之间、3与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0012<0.05、p＝0.0007<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组6、5、1之间，组合物组的q判断(q＝1.38>1.15)显示出协同作用，且研究组6与5之间、6与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0006<
0.05、p＝0.0054<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组9、8、1之间，组合物组的q判断(q>1.17>1.15)显示出协同作用，且研究组9与8之间、9与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0041<0.05、p＝0.0015<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。
[0343]
上述结果及更多类似研究说明，包含本发明的动物组织细胞和抗病原体疾病化疗药物的半流体组合物对病原体致病变组织有协同破坏作用。该协同作用的形成，有可能是因为本发明的包含动物组织细胞的半流体作为免疫成分(抗原)协同、组织破坏协同、或/和作为缓释载体协同。病原体致病变组织的加大破坏有利于內源疫苗的生成。
[0344]
根据上述多个实施例的研究及更多的类似研究，包含动物组织细胞的半流体可以作为协同组分应用于抗病原体疾病药物的制备。具体而言，其可以作为疫苗抗原、疫苗佐剂或/和载体疫苗佐剂与其它免疫药物(例如免疫生物制品)形成组合物用于抗病原体疾病免疫药物(例如抗病原体疾病疫苗)的制备，也可以在作为免疫药物的同时作为组织破坏成分或/和载体与其它生物制品的协同成分用于抗病原体疾病药物的制备，还可以作为化疗药物形成组合物用于抗病原体疾病免疫药物(例如抗病原体疾病的免疫-化疗复合药物)的制备的协同成分用于抗病原体疾病药物的制备。
[0345]
本发明的组合物的必要条件为：其组成和形态使得其可激发比活性成分单用更有效的免疫应答、和/或更有效的化疗效果的半流体结节。于是，本发明的组合物的基本技术方案为：
[0346]
包含动物组织细胞的半流体作为抗病原体疾病活性成分的增效组分应用；
[0347]
上述包含动物组织细胞和活性成分的半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和动物组织细胞的半流体粘稠物、包含所述活性成分和动物组织细胞的凝固物、包含所述活性成分和包含所述细胞的非液动物组织的破碎物、包含所述活性成分和动物组织细胞的凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和动物组织细胞的凝固物、包含所述活性成分和包含所述细胞的非液动物组织的破碎物、包含所述活性成分和动物组织细胞的凝固物的破碎物；
[0348]
上述包含动物组织细胞和活性成分的半流体包含在所述疫苗的瘤区用药和/或瘤外局部用药中；
[0349]
上述包含动物组织细胞和活性成分的半流体为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶化)结节。
[0350]
在更优选的条件下，本发明的包含动物组织细胞和抗病原体疾病活性成分的半流体组合物显示出免疫协同作用、化疗协同作用和/或载体协同作用。该半流体组合物的协同条件为：所述活性成分和组合物的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100，所述细胞和组合物的量比(v/v)为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
109个/ml-22
×
109个/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
109个/ml-22
×
109个/ml)。在其中所述半流体粘稠物组合物中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为≥70％(或细胞浓度为≥17.9
×
109个/ml)、优选为70％-86％(或细胞浓度为17.9
×
109个/ml-22
×
109个/ml)。
[0351]
更优选地，所述活性成分的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓
度，其中：
[0352]
所述生物制品的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述肿瘤抗原的含量为大于105个/mlmm3、优选为105～109个/mlmm3个肿瘤细胞所包含的肿瘤抗原，所述微生物抗原的浓度为>0.1％，所述免疫调节类抗体药物的含量为≥0.1％、优选为0.25-5％，等等；或/和
[0353]
所述化疗药物的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述细胞毒药物的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50％-500％；所述常规无效化合物的浓度为>0.25％、优选为0.35-30％(例如：所述氨基酸营养素的局部给药浓度为大于5％，优选为5％-30％；所述无效芳香化合物的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.35％-10％；所述植物或菌类活性成分的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.75％-15％)。
[0354]
实施例6：组合物的更多应用
[0355]
按照上述研究结果，本发明的包含动物组织细胞的半流体作为活性成分的协同成分用于抗病原体疾病药物的更多的应用被研究。
[0356]
1、荷瘤裸鼠实验
[0357]
在以下一个包括9个实验的实验系列中，试验动物为裸小鼠，建模细胞分别为如下所示的9个人实体瘤细胞，分别在动物右侧腋部皮下进行常规的移植瘤建模。每个系列实验中成功建模的试验动物随机分为5个试验组，其中1个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。阴性对照物为生理盐水，a、b、c、d研究药物分别为实施例1中的制备物y1、y4、y6、y9。各实验组均瘤内用药1次，每次用药200μl/只。用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各系列的阴性对照组计算抑瘤率，9个系列实验的结果示于以下。
[0358]
1)、在乳腺肿瘤治疗中的应用
[0359]
成功建模的荷人乳腺癌细胞(mda-mb231)裸鼠(瘤体平均体积203mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为85％、72％、68％、83％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0360]
2)、在肺癌治疗中的应用
[0361]
成功建模的荷人肺癌细胞(a549)裸鼠(瘤体平均体积207mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为75％、63％、61％、79％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0362]
3)、在甲状腺癌治疗中的应用
[0363]
成功建模的荷人甲状腺癌细胞(sw579)裸鼠(瘤体平均体积204mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为79％、71％、66％、82％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0364]
4)、在前列腺癌治疗中的应用
[0365]
成功建模的荷人前列腺癌细胞(lncap/ar)裸鼠(瘤体平均体积208mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为85％、76％、71％、83％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0366]
5)、在肝癌治疗中的应用
[0367]
成功建模的荷人肝癌细胞(hepg2)裸鼠(瘤体平均体积213mm3)随机分为一个阴性
对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为83％、71％、65％、81％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0368]
6)、在头颈癌治疗中的应用
[0369]
成功建模的荷人头颈癌细胞(fμda)裸鼠(瘤体平均体积213mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为86％、73％、70％、87％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0370]
7)、在鼻咽癌治疗中的应用
[0371]
成功建模的荷人鼻咽癌细胞(cne1)裸鼠(瘤体平均体积206mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为91％、81％、79％、82％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0372]
8)、在胃癌治疗中的应用
[0373]
成功建模的荷人胃癌细胞(bgc823)裸鼠(瘤体平均体积204mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为71％、66％、62％、73％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0374]
9)、在卵巢癌治疗中的应用
[0375]
成功建模的荷人卵巢癌细胞(pa1)裸鼠(瘤体平均体积201mm3)随机分为一个阴性对照组和4个研究组(a、b、c、d组)。a、b、c、d组的抑瘤率均值分别为86％、72％、71％、85％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
[0376]
使用实施例1中的其它包含化疗药物的组合物的制备物，也可获得类似结果。
[0377]
2、荷瘤小鼠实验
[0378]
在以下一个包括5个实验的实验系列中，试验动物和建模细胞分别如下所示。建模细胞分别在动物右侧腋部皮下进行常规的移植瘤建模。每个系列实验中成功建模的试验动物随机分为4个试验组，其中1个阴性对照组和3个研究组(a、b、c组)。阴性对照物为生理盐水，a、b、c组研究药物分别为实施例1中的制备物y10、y22、y24。各实验组均瘤内用药1次，每次用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各系列的阴性对照组计算抑瘤率，实验结果示于以下。
[0379]
1)、在肝癌治疗中的应用
[0380]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肝癌h22细胞(2
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积215mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为43％、47％、51％。
[0381]
2)、在肠癌治疗中的应用
[0382]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为结肠癌ct26细胞(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积206mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为41％、46％、43％。
[0383]
3)、在乳腺癌治疗中的应用
[0384]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积
216mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为44％、49％、47％。
[0385]
4)、在恶性黑色素瘤治疗中的应用
[0386]
在一个试验中，试验动物为c57bl/6小鼠，建模细胞为黑色素瘤b16细胞(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积218mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为41％、49％、51％。
[0387]
5)、在肺癌治疗中的应用
[0388]
在一个试验中，试验动物为c57bl/6小鼠，建模细胞为肺癌(llc细胞)(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积202mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为38％、42％、45％。
[0389]
使用实施例1中的其它的组合物制备物，也可获得以上类似结果。
[0390]
根据以上结果以及对导致这些结果的免疫协同、组织破坏协同、和/或缓释协同策略的初步分析，在本发明公开的技术方案下，本发明的组合物中的包含动物组织细胞的半流体作为协同成分显示出靶向病原体致病变组织(例如瘤体)的特性。例如，本发明的组合物中的包含动物组织细胞的半流体作为提供免疫协同的抗原应用有别于现有技术中的分子形态的抗原(例如病原体抗原、常规移植物抗原、和单一细胞抗原)，显示出具有与高度损伤的病原体致病变组织(例如瘤体)相似从而针对它的特异性免疫原。众所周知，化疗药物的主要特征在其组成，而抗原的主要特征在其特异性免疫原。该免疫原很可能是因为其形成了一种类病原体致病变组织(例如瘤体)组织结节，但其半流体性和高损伤性(半流体中的细胞远离其在天然器官或组织中的状态)却又比病原体致病变组织(例如瘤体)更易被免疫系统识别，从而激发出针对其所仿生的病原体致病变组织(例如瘤体)的有效免疫应答。
[0391]
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的组合物可以应用于广谱的病原体疾病，例如肿瘤、微生物感染。其中所述肿瘤优选为实体肿瘤，其中所述实体肿瘤为选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。其中所述微生物感染选自以下组之一种或多种：hiv、乙型肝炎、丙型肝炎、麻风、慢性粘膜皮肤念珠菌病。
[0392]
本申请公开包括以下项目：
[0393]
项目1、包含动物组织细胞的半流体作为抗病原体疾病活性成分的协同成分在制备用于治疗或抑制病原体疾病的局部药物中的应用。
[0394]
项目2、一种用于治疗或抑制病原体疾病的局部药物组合物，其包含抗病原体疾病活性成分和包含动物组织细胞的半流体，其中所述活性成分分散在所述半流体中。
[0395]
项目3、一种治疗或抑制病原体疾病的方法，其包括向有此需要的个体局部通过植入、优选通过注射施用包含抗病原体疾病活性成分以及包含动物组织细胞的半流体的局部药物组合物。
[0396]
项目4、根据项目1-3之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。
[0397]
项目5、根据项目1-4之一的应用、药物组合物或方法，其中所述半流体所包含的组织细胞为选自源自动物结缔组织和/或结缔组织之外的半固体组织所含细胞之一种或多种。
[0398]
项目6、根据项目1-5之一的应用、药物组合物或方法，其中所述半流体所包含的组织细胞为选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：肌细胞，血细胞，免疫细胞，干细胞例如间充质干细胞、造血干细胞，其中所述免疫细胞选自以下以下细胞及其衍生物之一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞、白细胞及其衍生物，其中所述白细胞选自以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自以下一种或多种：t细胞、b细胞、裸细胞。
[0399]
项目7、根据项目1-6之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物所包含的所述组织细胞的量比(v/v)为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)或55％-86％(或细胞浓度为14.0
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0400]
项目8、根据项目1-7之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物所包含的所述活性成分的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100，且其中所述活性成分选自抗病原体疾病的生物制品或/和化疗药物之一种或多种。
[0401]
项目9、根据项目1-8之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物所包含的组织细胞为高度偏离天然状态、优选为严重损伤的状态，其中所述高度偏离天然状态包括粘稠化；所述严重损伤选自包括以下之一种或多种损伤：凝固化、机械破碎、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。
[0402]
项目10、根据项目1-9之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和组织细胞的半流体粘稠物、包含所述活性成分和组织细胞的半流体凝固物、包含所述活性成分和包含组织细胞的半流体破碎物、包含所述活性成分和组织细胞的凝固物的破碎物，优选为以下形式：包含所述活性成分和组织细胞的半流体凝固物、包含所述活性成分和包含组织细胞的半流体破碎物、包含所述活性成分和组织细胞的凝固物的破碎物。
[0403]
项目11、根据项目1-10之一的应用、药物组合物或方法，其中所述动物组织细胞选自以下组之一种或多种：所述结缔组织和/或半固体组织中的天然细胞、所述结缔组织富集组分中的天然细胞、源自所述结缔组织和/或半固体组织的天然细胞制备物和/或工程细胞。
[0404]
项目12、根据项目8-11之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和所述结缔组织的半流体凝固物、包含所述活性成分和所述结缔组织的半流体混合物、包含所述活性成分和所述结缔组织和/或半固体组织的半流体破碎物、包含所述活性成分和所述结缔组织富集组分和/或半固体组织富集组分的半流体凝固物、包含所述活性成分和所述结缔组织富集组分和/或半固体组织富集组分的半流体破碎物、包含所述天然细胞制备物和/或工程细胞的半流体粘稠物、包含所述天然细胞制备物和/或工程细胞的半流体凝固物、包含所述天然细胞制备物和/或工程细胞的半流体破碎物。
[0405]
项目13、根据项目9-12之一的应用、药物组合物或方法，其中所述结缔组织为选自包括以下之一种或多种：血液、骨髓、脊髓，优选为血液。
[0406]
项目14、根据项目9-12之一的应用、药物组合物或方法，其中所述半固体组织为选自包括以下之一种或多种器官所包含的组织：肠、胃、肉、胰腺、脾脏、肝脏、肺、软骨、关节、皮、胎盘、脐带，优选为选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、脾脏、肝脏、胎盘、脐带。
[0407]
项目15、根据项目1-14之一的应用、药物组合物或方法，其中所述动物组织细胞为选自移植物抗宿主反应温和的细胞，优选为选自以下之一种或多种：并不富含异种糖蛋白抗原的异种细胞、abo血型相符或hla相近的同种异体异基因细胞、同种异体同基因细胞、自体细胞。
[0408]
项目16、根据项目1-15之一的应用、药物组合物或方法，其中所述动物组织细胞为选自以下组之一种或多种：同种异体细胞、自体细胞。
[0409]
项目17、根据项目1-16之一的应用、药物组合物或方法，其中所述动物组织细胞为自体细胞。
[0410]
项目18、根据项目5-17之一应用、的药物组合物或方法，其中所述生物制品选自以下组之一种或多种：病原体抗原、免疫调节类抗体、细胞因子，且所述生物制品在所述组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
[0411]
项目19、根据项目18的应用、药物组合物或方法，其中所述病原体抗原选自以下组之一种或多种：微生物抗原、肿瘤抗原。
[0412]
项目20、根据项目19应用、的药物组合物或方法，其中所述微生物抗原为选自源于以下微生物组之一种或多种的抗原：细菌，例如化脓性链球菌、豁质沙雷菌、卡介苗、破伤风梭菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌；病毒，例如乙肝病毒、腺病毒、单纯疤疹病毒、牛痘病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、西尼卡谷病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒；寄生虫，例如疟原虫。
[0413]
项目21、根据项目19应用、的药物组合物或方法，其中所述肿瘤抗原为选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
[0414]
项目22、根据项目18的应用、药物组合物或方法，其中所述免疫调节类抗体选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂，例如针对ctla-4分子和pd-1分子的阻断性抗；针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子的激活性抗体，例如抗ox40抗体、抗cd137抗体、抗4-1bb抗体；针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子的中和抗体，例如抗tgf-p1抗体。
[0415]
项目23、根据项目18的应用、药物组合物或方法，其中所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。
[0416]
项目24、根据项目5-23之一的应用、药物组合物或方法，其中所述化疗药物选自细胞毒药物和/或常规无效但局部有效化合物，且其中所述化疗药物和所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
[0417]
项目25、根据项目24的应用、药物组合物或方法，其中所述细胞毒药物选自以下之一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗病原体疾病抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
[0418]
项目26、根据项目24的应用、药物组合物或方法，其中所述常规无效但局部有效化合物选自包括以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、常规无效局部有效芳香化合物、非动物生物活性成分。
[0419]
项目27、根据项目26的应用、药物组合物或方法，其中所述常规无效但局部有效化合物选自包括以下组之一种或多种：氨基酸类营养素，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽；常规无效局部有效芳香化合物，例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁；非动物生物活性成分，例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
[0420]
项目28、根据项目1-27之一的应用、药物组合物或方法，其中所述病原体疾病选自以下组之一种或多种：肿瘤、微生物感染。
[0421]
项目29、根据项目28的应用、药物组合物或方法，其中所述肿瘤优选为实体肿瘤，并且其中所述实体肿瘤为瘤体体积>85mm3、优选≥200mm3、更优选≥300mm3的实体肿瘤。
[0422]
项目30、根据项目28或29的应用、药物组合物或方法，其中所述实体肿瘤为选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
[0423]
项目31、根据项目28的应用、药物组合物或方法，其中所述微生物感染选自以下组之一种或多种：hiv、乙型肝炎、丙型肝炎、麻风、慢性粘膜皮肤念珠菌病。
[0424]
项目32、根据项目3-31之一的方法，其中所述方法还包括与以下之一种或多种治疗合用：介入疗法、化疗、其它免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预。
[0425]
项目33、一种用于治疗或抑制病原体疾病的药物组合物的制备方法，该药物组合物包含动物组织细胞的半流体和活性成分，所述方法包括以下步骤：
[0426]
a.提供包含所述细胞的制备物，所述制备物可以是以下组之一种或多种：天然细胞制备物、工程细胞、包含天然细胞的结缔组织、包含天然细胞的器官组织、天然细胞的富集组分；
[0427]
b.提供所述活性成分；
[0428]
c.将所述包含所述细胞的制备物与所述活性成分进行混合，如有必要对该混合物进行半流体化和/或严重损伤处理，以得到包含所述动物组织细胞和活性成分的半流体；或
[0429]
c.将包含所述细胞的制备物进行半流体化和/或严重损伤处理以得到半流体，在其中加入活性成分并进行混合，得到包含所述动物组织细胞和活性成分的半流体。
[0430]
项目34、根据项目33的方法，其中所述半流体化选自以下之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎化。
[0431]
项目35、根据项目33的方法，其中所述严重损伤处理选自以下之一种或多种：粘稠化处理、机械破碎、凝固化处理、热处理、冻融处理、照射处理、化学处理。
[0432]
项目36、一种根据项目33-35之一的方法制备的药物组合物。
[0433]
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。