蛹虫草菌粉在电离辐射所致损伤防治中的应用的制作方法

本发明涉及一种蛹虫草菌粉药物的应用，即关于蛹虫草菌粉在防治电离辐射致骨髓、小肠、脾脏和睾丸损伤方面的应用。

背景技术：

随着核能源日益成为各国科技和军事力量的重要组成部分，战时核爆炸、核恐怖袭击、核反应堆事故等所致机体电离辐射损伤均威胁着公众的安全和健康。此外，放射治疗作为临床上恶性肿瘤的主要治疗手段之一，其在杀伤肿瘤细胞的同时，不可避免的会对肿瘤周围的正常组织器官造成电离辐射损伤，从而引起机体血液系统、胃肠道系统、免疫系统、生殖系统等的损伤和后遗症。

电离辐射致机体损伤的主要机制是射线通过直接和间接作用导致dna的断裂，并且体内的水分子在射线作用下激发并分解成自由基，进而攻击生物大分子并造成各器官的继发性损伤。电离辐射引发的机体急性损伤主要表现为：辐射后骨髓造血功能严重损伤，造血干细胞和造血祖细胞功能受损，全血细胞减少；肠道在辐射后会发生肠绒毛破碎、断裂，肠道隐窝数量明显减少，更为严重的是肠道机械屏障作用减弱，肠道免疫屏障遭到破坏，从而引起严重的胃肠道出血、呕吐、腹泻、菌血症、败血症和电解质紊乱等；脾脏内白髓和红髓间界限变得模糊，白髓面积减少，脾小体萎缩，免疫系统发生紊乱，进一步加剧了电离辐射对机体的损伤；睾丸内精母细胞、精原细胞、精子接受电离辐射后会出现精子减少和（或）缺失、精子畸形率增加及生精细胞变性、坏死和脱落等。因此，无论是对核事故抑或是临床放射治疗所致急性放射病的损伤防治研究急切而重要。

辐射防治药物的研发是减轻辐射损伤最有效的手段之一。氨磷汀是世界上唯一一个被美国食品药品监督管理局批准用于临床的辐射防护药物，然而其高昂的售价、较短的半衰期、严重依赖于药物使用剂量的毒性制约了其临床应用。此外，现有报道的包括氨磷汀在内的辐射防治物质仅在辐射前给药有效，而在辐射损伤发生后减轻辐射损伤的药物鲜有报道。因此，开发高效低毒的辐射防治药物对于减轻辐射损伤患者的痛苦至关重要。

蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草等，分类学上属于麦角菌科、虫草属，有着调节免疫系统、抑制肿瘤增殖、诱导癌细胞凋亡、抗炎、舒张血管、抗疲劳和抗应激等作用，现已广泛用于制药、保健食品、饮料、制酒等多种行业。蛹虫草菌粉中含有多种化学成分，其提取物具有多种功能，例如，虫草多糖具有抗肿瘤、降糖、抗肝纤维化及提高免疫功能，虫草素具有抗菌，消炎、抗氧化、调节人体内分泌和增强人体免疫功能等显著作用。但现有技术中未见有蛹虫草菌粉及其提取物对急性全身辐射致骨髓、小肠、脾脏和睾丸损伤防治作用的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供蛹虫草菌粉及其提取物的新用途，即在电离辐射所致损伤防治中的应用。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：蛹虫草在电离辐射致骨髓、小肠、脾脏和睾丸损伤防治中的应用，所述蛹虫草为购自吉林省中晟制药有限公司的蛹虫草菌粉胶囊。

发明人将从上海吉辉实验动物饲养有限公司订购的c57bl/6j雄性8周龄小鼠用于动物实验。在有12h明暗周期，20~25℃且自由食用灭菌水和鼠粮的环境中饲养小鼠。小鼠随机分为4组：第1组，照射+生理盐水对照组；第2组，照射+蛹虫草菌粉低剂量组；第3组，照射+蛹虫草菌粉中剂量组；第4组，照射+蛹虫草菌粉高剂量组。小鼠接受9gy的60coγ射线全身照射，蛹虫草菌粉用无菌生理盐水混悬，在照射后0.5h经灌胃给药，此后每天给药一次，连续给药7天，并在照射后30天内每天记录小鼠存活情况。结果发现，辐射后给予蛹虫草菌粉可以显著提高小鼠生存率，尤其以高剂量组最为显著。

同时，发明人还选择照射+生理盐水对照组以及照射+蛹虫草菌粉高剂量组，在照射后的3天分别取2组小鼠的骨髓、小肠、脾脏和睾丸，经固定、蜡块包埋、切片后进行he染色。结果显示，与对照组相比，照后3天，照射+生理盐水对照组骨髓内有核细胞的数量明显减少，骨髓腔内空虚，提示骨髓造血功能遭受严重的破坏。与对照组相比，照射后给予蛹虫草菌粉，能较显著的延缓骨髓损伤，骨髓腔内细胞数目明显比对照组多。小肠的he切片显示，未照射组的小肠绒毛结构完整，而照射后则出现绒毛缩短甚至断裂，免疫组化结果显示小肠隐窝中干细胞数目明显减少，给予蛹虫草菌粉能修复照射后小肠损伤，小肠隐窝干细胞数目、小肠绒毛长度等均有显著的修复。脾脏组织的he切片结果显示，照射后第3天白髓和红髓之间界限变得模糊，白髓面积明显缩小，而照射后给予蛹虫草菌粉的小鼠脾脏红白髓界限相对清晰且白髓面积缩小不明显，即蛹虫草能有效的减轻辐射导致脾脏的损伤。睾丸病理切片的结果显示，未照射组小鼠睾丸结构完整，精曲小管饱满，轮廓清晰，辐照后小鼠睾丸内细胞数量明显减少，精曲小管内空腔变大、萎缩、坏死较为严重，而蛹虫草菌粉能显著修复辐射导致的睾丸损伤。

因此，本发明要求保护蛹虫草在电离辐射致骨髓、小肠、脾脏和睾丸损伤防治中的应用。在对动物和细胞无任何明显副作用的药物浓度下，在接受电离辐射后服用蛹虫草菌粉，可以减轻电离辐射损伤，从而发挥电离辐射损伤的防治作用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：(1)毒副作用小，蛹虫草菌粉作为一种已经上市的药物，有着丰富的临床研究资料，其安全性和有效性均已得到临床研究的证实；(2)疗效显著，现有的辐射防治药物绝大多数仅在辐射前给药有效，而辐射事件发生后减轻辐射损伤的药物鲜有报道，接受电离辐射后给予蛹虫草菌粉，能显著的提高小鼠生存率，减轻辐射造成的骨髓、肠道、脾脏和睾丸损伤。上述性能均显示出蛹虫草在电离辐射致机体损伤防治中的卓越效果，有着广阔的临床应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合说明书附图详细说明。

附图说明

图1为本发明9gy60coγ射线全身照射后照射组和照射后给予不同浓度蛹虫草菌粉小鼠存活曲线对比图。

图2为本发明9gy60coγ射线全身照射后第一、三、五、七天照射组和照射后给予蛹虫草菌粉（1.25g）小鼠骨髓he切片对比图。

图3a为本发明9gy60coγ射线全身照射后第三天照射组的小鼠小肠he切片及免疫组化染色对比图。

图3b为本发明9gy60coγ射线全身照射后给予蛹虫草菌粉（1.25g）小鼠小肠he切片及免疫组化染色对比图。

图4a为本发明9gy60coγ射线全身照射后第三天照射组和照射后给予蛹虫草菌粉（1.25g）小鼠脾脏he切片对比图。

图4b为本发明9gy60coγ射线全身照射后第三天照射组和照射后给予蛹虫草菌粉（1.25g）小鼠脾脏he切片白髓面积对比图。

图5为本发明9gy60coγ射线全身照射后第三天照射组和照射后给予蛹虫草菌粉（1.25g）小鼠睾丸he切片对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于实施例。

实施例1：蛹虫草对辐照后小鼠生存率的影响

材料和方法

1.试药：

蛹虫草菌粉胶囊：吉林省中晟制药有限公司（下同）。

蛹虫草菌粉用无菌生理盐水混悬，给药方式为灌胃给药，每只小鼠灌100微升。

2.小鼠:

购自上海吉辉实验动物饲养有限公司的c57bl/6j雄性8周龄小鼠用于动物实验。在有12h明暗周期，20~25℃且自由食用灭菌水和鼠粮的环境中饲养小鼠（下同）。

3.辐射损伤及防治实验

小鼠随机分为4组：第1组，照射+生理盐水对照组；第2组，照射+蛹虫草菌粉低剂量组（0.5g/kg）；第3组，照射+蛹虫草菌粉中剂量组（1g/kg）；第4组，照射+蛹虫草菌粉高剂量组（1.25g/kg）。使用⁶⁰co进行全身照射，照射剂量为9gy，剂量率为1gy/min。辐照后灌胃给予生理盐水或不同浓度的蛹虫草菌粉，每只小鼠灌胃量为100微升。此后连续给药7天，并记录小鼠生存情况。实验结果见图1。

如图1所示，照射+生理盐水组小鼠在照射后出现体型消瘦、食欲下降等，并在10天内全部死亡，而照射后给予蛹虫草菌粉能显著提高小鼠生存率，延长其生存时间。

实施例2：蛹虫草对辐照后小鼠骨髓的修复作用

材料和方法

1.试药：

蛹虫草菌粉胶囊：吉林省中晟制药有限公司（下同）。通用组织固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司，伊红购自美国arcosorganics公司；苏木素、无水乙醇、二甲苯、包埋石蜡、中性树胶均购自中国医药集团；树胶购自日本武藤化学株式会社；石蜡购自德国徕卡公司。

2.小鼠:

购自上海吉辉实验动物饲养有限公司的c57bl/6j雄性8周龄小鼠用于动物实验。在有12h明暗周期，20~25℃且自由食用灭菌水和鼠粮的环境中饲养小鼠（下同）。

3.辐射损伤及防治实验

小鼠随机分为2组：第1组，照射+生理盐水对照组；第2组，照射+蛹虫草菌粉低剂量组（1.25g/kg）。使用⁶⁰co进行全身照射，照射剂量为9gy，剂量率为1gy/min。辐照后灌胃给予生理盐水或蛹虫草菌粉（1.25g/kg），每只小鼠灌胃量为100微升。此后连续给药，分别于第1、3、5、7天处死小鼠并取股骨组织置于组织固定液中固定。股骨经脱钙处理、脱脂脱水、石蜡包埋后，切最大纵切面，切片厚度为3μm，最后经苏木精-伊红染色（he染色）后对比不同处理组小鼠骨髓的情况。实验结果见图2。

如图2所示，照射+生理盐水组小鼠在照射后骨髓中的有核细胞不断减少，而给予蛹虫草菌粉的小鼠，其骨髓损伤情况得到显著的缓解，在第3天骨髓内有核细胞减少至最低点后逐渐增加，于第7天时能见到较多的有核细胞，这提示骨髓的功能逐渐恢复。

实施例3：蛹虫草对辐照后小鼠小肠的修复作用

材料和方法

1.试药：

蛹虫草菌粉胶囊：吉林省中晟制药有限公司（下同）。通用组织固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司及he染色试剂同实施例2。小肠干细胞标志蛋白抗体olfm4购自美国cst公司，dakoreal™envision™detectionsystem.peroxidase/dab+.rabbit/mouse等。

2.小鼠:

购自上海吉辉实验动物饲养有限公司的c57bl/6j雄性8周龄小鼠用于动物实验。在有12h明暗周期，20~25℃且自由食用灭菌水和鼠粮的环境中饲养小鼠（下同）。

3.辐射损伤及防治实验

小鼠随机分为2组：第1组，照射+生理盐水对照组；第2组，照射+蛹虫草菌粉低剂量组（1.25g/kg）。使用⁶⁰co进行全身照射，照射剂量为9gy，剂量率为1gy/min。辐照后灌胃给予生理盐水或蛹虫草菌粉（1.25g/kg），每只小鼠灌胃量为100微升。此后连续给药3天，于第3天处死小鼠并取胃下3cm处的小肠组织置于组织固定液中固定。小肠经脱脂脱水、石蜡包埋后，切横切面，切片厚度为3μm，最后经苏木精-伊红染色（he染色）、免疫组化染色（olfm4）后对比不同处理组小鼠小肠的情况。实验结果见图3a和图3b。

如图3a和图3b所示，与对照组相比，照射+生理盐水组小鼠在照射后小肠绒毛明显缩短，绒毛细胞死亡，小肠隐窝干细胞数量急剧减少，而给予蛹虫草菌粉能缓解小鼠的小肠损伤，维持小肠隐窝干细胞数目以及绒毛的长度。

实施例4：蛹虫草对辐照后小鼠脾脏的修复作用

材料和方法

1.试药：

蛹虫草菌粉胶囊：吉林省中晟制药有限公司（下同）。通用组织固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司及he染色试剂同实施例2。

2.小鼠:

购自上海吉辉实验动物饲养有限公司的c57bl/6j雄性8周龄小鼠用于动物实验。在有12h明暗周期，20~25℃且自由食用灭菌水和鼠粮的环境中饲养小鼠（下同）。

3.辐射损伤及防治实验

小鼠随机分为2组：第1组，照射+生理盐水对照组；第2组，照射+蛹虫草菌粉低剂量组（1.25g/kg）。使用⁶⁰co进行全身照射，照射剂量为9gy，剂量率为1gy/min。辐照后灌胃给予生理盐水或蛹虫草菌粉（1.25g/kg），每只小鼠灌胃量为100微升。此后连续给药3天，于第3天处死小鼠并取脾脏组织置于组织固定液中固定。脾脏经脱脂脱水、石蜡包埋后，切最大纵切面，切片厚度为3μm，最后经苏木精-伊红染色（he染色）后对比不同处理组小鼠脾脏的情况。实验结果见图4a和图4b。

如图4a所示，与对照组相比，照射+生理盐水组小鼠在照射后的脾脏白髓和红髓交界模糊，白髓的面积明显缩小，提示免疫功能受损，而给予蛹虫草菌粉后，脾脏白髓和红髓的界限依然清晰。如图4b所示，给予蛹虫草菌粉后，脾脏白髓面积缩小的趋势被显著抑制。

实施例5：蛹虫草对辐照后小鼠睾丸的修复作用

材料和方法

1.试药：

蛹虫草菌粉胶囊：吉林省中晟制药有限公司（下同）。通用组织固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司及he染色试剂同实施例2。

2.小鼠:

购自上海吉辉实验动物饲养有限公司的c57bl/6j雄性8周龄小鼠用于动物实验。在有12h明暗周期，20~25℃且自由食用灭菌水和鼠粮的环境中饲养小鼠（下同）。

3.辐射损伤及防治实验

小鼠随机分为2组：第1组，照射+生理盐水对照组；第2组，照射+蛹虫草菌粉低剂量组（1.25g/kg）。使用⁶⁰co进行全身照射，照射剂量为9gy，剂量率为1gy/min。辐照后灌胃给予生理盐水或蛹虫草菌粉（1.25g/kg），每只小鼠灌胃量为100微升。此后连续给药3天，于第3天处死小鼠并取睾丸组织置于组织固定液中固定。睾丸经脱脂脱水、石蜡包埋后，切最大纵切面，切片厚度为3μm，最后经苏木精-伊红染色（he染色）后对比不同处理组小鼠睾丸的情况。实验结果见图5。

如图5所示，与对照组相比，照射+生理盐水组小鼠在照射后的睾丸内细胞数量减少，精曲小管内空腔变大，并伴有萎缩，坏死，而小鼠给予蛹虫草菌粉后，睾丸细胞数量相对较多，精曲小管结构相对完整，总体损伤程度明显减轻。

统计学处理：上述实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用mean±sd表示。采用graphpadprism5统计软件对相关数据进行t检验，生存率使用log-rank(mantel-cox)检验，以p<0.05为有显著性差异。