左旋延胡索乙素在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是左旋延胡索乙素在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用。

背景技术：

左旋延胡索乙素是中草药延胡索中提取的生物碱，具有抗炎、镇痛、镇静等多种药理作用。近年来，左旋延胡索乙素(l-tetrahydropalmatine,l-thp)因其在研究与临床中表现出显著的抗炎活性，受到研究者的极大关注。研究证实，左旋延胡索乙素主要通过抑制nf-κb激活来发挥抗炎作用。quz等(quz,zhangj,yangh,etal.protectiveeffectoftetrahydropalmatineagainstd-galactoseinducedmemoryimpairmentinrat.physiology&behavior.2016；154:114-25)报道在左旋延胡索乙素能通过抑制nf-κb通路的激活，保护d-半乳糖诱导的记忆力减退。然而左旋延胡索乙素抑制的nf-κb通路对破骨细胞生成的作用及其对骨质流失的影响仍不清楚。

骨质疏松症(osteoporosis,op)是以骨量降低、骨组织显微结构发生改变，以骨脆性增加、骨强度下降、易骨折为特征的一种慢性炎症性疾病。骨吸收与骨形成的失衡是骨质疏松的病理生理学基础，由促骨形成的成骨细胞和促骨吸收的破骨细胞调控(delpuente,esposito,physiopathologyofosteoporosis:fromriskfactorsanalysistotreatment,journal/jbiolregulhomeostagents,2015,29:527-531)。研究表明，在慢性炎症过程中转录因子nf-κb(nuclearfactor-kappab，nf-κb)大量激活，骨质疏松的发生与细胞核因子κb的持续激活关系密切(abu-amer,nf-kappabsignalingandboneresorption,journal/osteoporosint,2013,24:2377-2386)。nf-κb激活能够显著促进破骨细胞的分化、功能与存活。炎症因子激活破骨细胞中的nf-κb转录因子，激活下游信号通路，引起破骨生成相关基因转录翻译，最终导致破骨细胞分化、成熟与活化，引起骨吸收，造成骨质疏松。研究证实，抑制nf-κb表达和转录活性后能够显著改善骨质疏松情况(yuan,xu,leonurinehydrochlorideinhibitsosteoclastogenesisandpreventsosteoporosisassociatedwithestrogendeficiencybyinhibitingthenf-kappabandpi3k/aktsignalingpathways,journal/bone,2015,75:128-137,zhang,liu,histoneacetyltransferasegcn5regulatesosteogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsbyinhibitingnf-kappab,journal/jboneminerres,2016,31:391-402,yang,blair,theproteasomeinhibitorcarfilzomibsuppressesparathyroidhormone-inducedosteoclastogenesisthrougharankl-mediatedsignalingpathway,journal/jbiolchem,2015,290:16918-16928,guan,zhao,epoxyeicosanoidssuppressosteoclastogenesisandpreventovariectomy-inducedboneloss,journal/fasebj,2015,29:1092-1101)。

已有的文献和诊疗指南报道，用于治疗绝经后骨质疏松症的药物主要有：骨吸收抑制剂(包括双膦酸盐、雌激素疗法和选择性雌激素受体调节剂)和骨形成促进剂(甲状旁腺激素)。目前治疗绝经后骨质疏松症的治疗药物之间没有存在相互通用的文献报道和临床实践。

目前尚未有任何文献报道左旋延胡索乙素具有治疗绝经后骨质疏松症的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于左旋延胡索乙素的新用途，特别是在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用。

本发明通过he染色和microct结果证明左旋延胡索乙素可明显减轻小鼠去卵巢后的骨质丢失。

本发明的第一方面，提供左旋延胡索乙素、其药学上可接受的盐类在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用，所述的左旋延胡索乙素的结构如式i所示：

进一步的，所述的药学上可接受的盐类，选自盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢溴酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐等。

进一步的，所述的左旋延胡索乙素抑制骨量丢失，增加骨小梁数量。

体内动物实验表明左旋延胡索乙素对小鼠绝经后骨质疏松症具有显著的保护作用，实验结果显示左旋延胡索乙素能够显著抑制去卵巢小鼠骨量丢失，增加骨小梁数量，可用于制备抗骨质疏松药物。

进一步的，所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物为注射剂，给药方式包括：静脉、局部给药等。

进一步的，所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中左旋延胡索乙素的给药剂量为4mg/kg/天。

进一步的，所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物包含治疗有效量的左旋延胡索乙素或其药学上可接受的盐类，和常规药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明的第二方面，提供左旋延胡索乙素在制备抑制骨量丢失，增加骨小梁数量的药物中的应用。

本发明的第三方面，提供左旋延胡索乙素在制备抑制破骨细胞，减轻骨量降低的药物中的应用。

进一步的，所述的左旋延胡索乙素在制备抑制破骨细胞生成和分化，抑制nf-κb和mapk通路的激活，抑制胞内p65，p50，iκb，erk，p38和jnk的磷酸化的药物中的应用。

进一步的，所述的左旋延胡索乙素通过抑制rank和traf6的结合，从而抑制nf-κb通路和mapk通路，从而最终抑制破骨关键转录因子nfatc1的表达，从而发挥抑制破骨细胞生成，减少骨质流失的作用。

本发明的第四方面，提供一种预防或治疗绝经后骨质疏松症的药物，包括有效量的左旋延胡索乙素或其药学上可接受的盐类，和常规药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明优点在于：

本发明为左旋延胡索乙素提供了一种新用途，也为绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供了新的思路。

附图说明

图1a为左旋延胡索乙素(l-thp)的化学结构。图1b为mtt实验的结果。图1c和1d为bmmcs细胞和raw264.7细胞破骨诱导7天后的trap染色结果。*p<0.05，**p<0.01。

图2a为破骨细胞肌动蛋白环的荧光染色。与对照组相比，高剂量药物处理组肌动蛋白环形成明显受抑制。图2b为破骨细胞骨吸收实验，与对照组相比，药物处理组的破骨细胞骨吸收功能受抑制。图2c为破骨细胞生成指标进行检测的结果，具体测量指标为trap,cathepsink,mmp-9，ctr，nfatc1。与诱导组比较，高剂量药物处理组各组蛋白指标均明显降低，数据具有统计学差异(p＜0.05)。

图3a为p65的免疫荧光结果和p65入核百分比。图3b为各组细胞内p65，p50和iκba磷酸化水平。图3c显示，与对照组相比，左旋延胡索乙素能够显著抑制nf-κb的dna结合活性。

图4a为mapk通路关键因子erk，jnk，p38的磷酸化水平。与对照组相比较，诱导组细胞内erk，p38和jnk和均明显升高，组间差异显著(p＜0.05)，左旋延胡索乙素处理能够明显抑制胞内erk，p38和jnk磷酸化，与诱导组比较，数据均有统计学差异(p＜0.05)。图4b为rank和traf6的co-ip实验结果。

图5a在不同浓度左旋延胡索乙素干预下的nfatc1的表达量，结果表明左旋延胡索乙素能够抑制nfatc1的表达，且具有计量依赖性。图5b结果表明在过表达的nfatc1能够逆转左旋延胡索乙素抑制nfatc1表达的作用。

图6a为6周后小鼠股骨远端micro-ct二维和三维结构，及对股骨远端micro-ct测量参数使用计算机软件分析。图6b为6周后小鼠股骨远端干骺端切片he染色。图6c显示左旋延胡索乙素能够抑制体内破骨细胞生成。图6d为血清学检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1.左旋延胡索乙素对c57小鼠去卵巢后骨质丢失具有抑制作用

一、实验材料：

采用生理盐水将左旋延胡索乙素稀释成不同浓度的药物溶液。

二、实验方法：

(一)动物实验

1.8周龄雌性c57小鼠，购自上海史莱克公司，饲养于长海医院spf级动物房。分组情况：将30只c57小鼠随机分为3组，每组为10只，分别为假手术组、去卵巢组、药物干预组。

去卵巢组：采用外科手术摘除小鼠双侧卵巢。

假手术组：除不切除小鼠卵巢外其余操作与去卵巢组相同。

药物干预组：切除小鼠双侧卵巢后每日一次腹腔注射给予小鼠4mg/kg的左旋延胡索乙素。

2.饲养6周后处死小鼠，取小鼠的双侧股骨及血清。

(1)小鼠股骨使用多聚甲醛溶液进行固定、edta脱钙后，石蜡包埋切片(4μg/ml)，进行苏木精-伊红(hestaining)染色，显微镜下观察小鼠股骨远端干骺端并拍照。

(2)将固定的小鼠股骨行micro-ct检查，采用skyscan1176微型ct机对小鼠股骨远端行micro-ct扫描，构建小鼠股骨远端干骺端二维及三维图像，并使用ct机自带软件对股骨骨小梁数量，骨表面积和组织体积之比进行分析，相对骨体积，骨矿物质密度，骨小梁连接数进行分析，获得定量结果。

(3)取得的血清在4℃条件下冷藏1小时后3000转15min进行离心，取得上清液。对血清中il-6，tnf-α，ctx-1和trap进行检测。

(二)细胞实验

1.首先进行左旋延胡索乙素的细胞毒性试验，采用mtt试验方法。mtt浓度为5mg/ml，将bmmcs细胞以10×10⁴/ml的密度接种于96孔板，每个孔100μl。经过在37℃，5％二氧化碳的条件下24小时的培养之后，加入左旋延胡索乙素，浓度梯度分别为2.36，4.73，9.47，18.95，37.92，75.83μg/ml。经过48小时的培养后，加入mtt溶液等待2小时。在490nm吸光度下使用elisa板读数器计数细胞数目。

2.从c57小鼠骨髓中获得骨髓干细胞，进行培养。培养液使用dmem高糖培养基，双抗，胎牛血清混合培养液。使用edta酶进行消化传代。实验分为两组。在进行成骨细胞诱导的同时，一组不做干预，另一组给予左旋延胡索乙素，分别在7，14，21天观察矿化结节形成情况，并拍照。

3.实验分为5组。第一组为raw264.7细胞对照组；第二组为raw264.7细胞且使用rankl诱导组；第三组为4.75μg/ml左旋延胡索乙素处理且使用rankl诱导组；第四组为9.5μg/ml左旋延胡索乙素处理且使用rankl诱导组；第五组为19μg/ml左旋延胡索乙素处理且使用rankl诱导组。处理时间为细胞诱导后第三天，细胞再经4天诱导。细胞完成总计7天的诱导后，进行trap染色，观察破骨细胞诱导的数量并计数进行统计学分析。相同方法，培养bmmcs细胞进行m-csf和rankl诱导和左旋延胡索乙素干预。

4.对3中得到的细胞进行westernblot检测，对trap,cathepsink,mmp9，ctr，nfatc1等破骨细胞生成指标进行分析，同时以β-actin蛋白为标准，对上述指标进行半定量，得出统计学分析结果。

5.对3中得到的细胞使用免疫荧光对p65入核数目进行观察，并计算的核位置的荧光强度与整个细胞荧光强度的比值。视野选择随机视野，每个视野中选取10个细胞，最终得出平均值进行分析。

6.实验分为三组，分别为raw264.7(对照组)，raw264.7+rankl(诱导组)和raw264.7+左旋延胡索乙素+rankl(左旋延胡索乙素处理且诱导组)，左旋延胡索乙素使用19μg/ml，处理时间为细胞诱导后第三天，细胞再经4天诱导。细胞完成总计7天的诱导后，收集细胞，提取细胞总蛋白，免疫印迹法分别检测nf-κb通路和mapk通路。

三、实验结果

图1a为左旋延胡索乙素的化学结构。图1b为mtt实验的结果。结果显示，当左旋延胡索乙素的浓度为18.95μg/ml时，对细胞基本无毒性，所以后续实验最高选择19μg/ml为最高干预剂量。图1c和1d为bmmcs细胞和raw264.7细胞培养7天后的trap染色结果。结果中显示，当使用m-csf和rankl诱导后破骨细胞数量明显增加(p<0.01)，而当使用左旋延胡索乙素进行干预后破骨细胞数量明显减少，并且有计量依赖性，左旋延胡索乙素的浓度为19μg/ml时破骨细胞数量最少(p<0.05)。结果说明，左旋延胡索乙素能抑制破骨细胞生成，*p<0.05，**p<0.01。

图2a为破骨细胞肌动蛋白环形成实验的检测结果，可以观察到，左旋延胡索乙素(4.75，9.5和19μg/ml)加入后，各组的肌动蛋白环形成受到明显抑制，数据具有统计学差异(p＜0.05)，且药物的浓度和肌动蛋白环形成呈梯度依赖性。图2b为破骨细胞的骨吸收实验。结果表明，破骨细胞诱导过程中，加入左旋延胡索乙素(4.75，9.5和19μg/ml)后，破骨细胞骨吸收功能受到明显抑制，数据具有统计学差异(p＜0.05)。图2c为破骨细胞生成指标进行检测的结果，具体测量指标为trap,cathepsink,mmp-9，ctr，nfatc1。raw264.7细胞经7天rankl(50ng/ml)诱导，细胞中trap,cathepsink,mmp-9，ctr，nfatc1各组蛋白表达均明显增强，与对照组比较，差异显著(p＜0.01)。细胞诱导的过程中加入左旋延胡索乙素(4.75，9.5和19μg/ml)，可以明显抑制各组蛋白上升趋势，且药物使用终浓度与蛋白表达的抑制程度呈梯度依赖，与诱导组比较，高剂量药物处理组各组蛋白指标均明显降低，数据具有统计学差异(p＜0.05)，这说明左旋延胡索乙素可以明显抑制rankl诱导的raw264.7细胞破骨分化。

图3a为p65的免疫荧光结果和p65入核百分比。图中显示，当使用m-csf和rankl进行诱导后p65的入核比例明显增多(p<0.01)，而同时使用左旋延胡索乙素进行干预时，结果显示p65的激活显著减少(p<0.01)。说明左旋延胡索乙素能够抑制p65的激活。图3b显示，与对照组相比较，诱导组细胞内p65，p50和iκba的磷酸化均明显升高，组间差异显著(p＜0.05)，左旋延胡索乙素处理，能够明显抑制胞内p65，p50和iκba的磷酸化，与诱导组比较，数据均有统计学差异(p＜0.05)。图3c显示，与对照组相比，左旋延胡索乙素能够显著抑制nf-κb的dna结合活性。

图4a显示mapk通路erk，p38，jnk的磷酸化。与对照组相比较，诱导组细胞内erk，p38和jnk均明显升高，组间差异显著(p＜0.05)，左旋延胡索乙素处理，能够明显抑制胞内erk，p38和jnk磷酸化，与诱导组比较，数据均有统计学差异(p＜0.05)。图4b为rank和traf6的co-ip实验结果，结果表明左旋延胡索乙素能够抑制rank和traf6的结合，说明左旋延胡索乙素通过抑制rank和traf6的结合而发挥抑制破骨细胞分化的作用。

图5a在不同浓度左旋延胡索乙素干预下的nfatc1的表达量，结果表明左旋延胡索乙素能够抑制nfatc1的表达，且具有剂量依赖性。图5b结果表明，过表达的nfatc1能够逆转左旋延胡索乙素抑制破骨细胞生成的作用。

图6a为左旋延胡索乙素干预6周后的小鼠股骨远端microct扫描结果。图片显示去卵巢组小鼠骨小梁数目较正常组明显减少，给予左旋延胡索乙素后小鼠股骨远端干骺端骨小梁数目明显多于卵巢切除组。对股骨远端使用计算机软件分析，统计骨小梁数量(tb.n)、骨表面积和组织体积之比(bs/tv)、相对骨体积或骨体积分数(bv/tv)和骨密度(bmd)后发现左旋延胡索乙素组小鼠显著优于去卵巢组小鼠，但不及假手术组，且差异具有统计学意义(p<0.05)。图6b为6周后小鼠股骨远端干骺端切片he染色。图片显示去卵巢组小鼠骨小梁数目较正常组明显减少，骨小梁间距增大，表现为骨质疏松；给予左旋延胡索乙素后小鼠股骨远端干骺端骨小梁数目明显多于卵巢切除组。骨小梁面积统计结果也显示去卵巢后骨质流失，给予左旋延胡索乙素后骨质流失缓解。图6c显示左旋延胡索乙素能够抑制体内破骨细胞生成。图6d为血清elisa检测结果。图片中显示，il-6，tnf-α，ctx-1和trap等破骨指标在去卵巢组中明显多于假手术组，给予左旋延胡索乙素干预后，其水平降低，说明左旋延胡索乙素干预的小鼠体内破骨活性低于去卵巢组，表示左旋延胡索乙素干预后其骨质流失减少。

四、结果讨论

女性绝经后骨质疏松症属于原发性骨质疏松症，与雌激素水平降低后破骨细胞分化增多、成骨减少有关。去卵巢小鼠模拟人类绝经，在去卵巢6周后表现出显著的骨质疏松表现，主要表现为骨小梁数量明显减少、骨皮质变薄等。目前研究表明，骨质疏松症的发生与骨骼的慢性炎症有关。慢性炎症使得破骨细胞过度激活，造成骨质显著丢失。

其中nf-κb和mapk通路与破骨细胞的过度激活有密切关联。作为一种nf-κb和mapk通路激活的抑制剂，左旋延胡索乙素显著减少了去卵巢后小鼠骨量的丢失，表现为骨小梁数目、骨表面积和组织体积之比、相对骨体积或骨体积分数和骨小梁连接数的增加。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。