富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物及其制备和分析方法与流程

本发明属于食品化学和生物医药领域，具体涉及富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物及其制备和分析方法。

背景技术：

缩醛磷脂是一类特殊的磷脂代表，约占细胞总磷脂的10％，它是一种含有烯醚键的甘油磷脂，如缩醛磷脂酰乙醇胺、缩醛磷脂酰胆碱、缩醛磷脂酰丝氨酸等。主要特征是在sn-1位置含有烯醚键，及在哺乳动物中通常连接着c16:0；18:0或18:1的脂肪醇，在sn-2上多是n-3和n-6的多不饱和脂肪酸。在大脑、心脏等器官中含量丰富。缩醛磷脂其大多数集中分布在生物膜“脂筏”结构中，参与细胞融合、离子转运及胆固醇的运输，同时也可以作为质膜上重要抗氧化剂，避免神经细胞的损伤。

目前很多研究的结果都显示缩醛磷脂含量的下降与许多疾病有关如：阿尔兹海默症，帕金森病，zellweger综合症等。其中阿尔茨海默病(ad)是一种进行性神经退行性疾病，是最常见的痴呆症。进一步发现阿尔兹海默症的严重程度和缩醛磷脂的减少程度存在正相关的关系。因此开展了很多动物实验和临床实验也证实了缩醛磷脂可以提高轻度认知障碍、轻度阿尔兹海默症患者和小鼠模型的学习能力和记忆力。

海鞘(ascidians)，属于脊索动物门(chordates)，尾索动物亚门(urochordata)的海鞘纲(ascidiacea)，在天然海区附着珍珠贝笼上生长，全世界大约有1600种，主要分布在热带及亚热带海域，海鞘在我国也广泛分布，资源丰富，已记录的中国沿海海鞘种类有100余种，且有很多为我国所特有海鞘是营固着生活的动物。与陆地微生物相比，海鞘共附生真菌能够耐受海洋特有的高盐、高压、低氧、低光照等多种极端条件，因此形成了独特的代谢和生理特性，产生了不同化学结构的代谢产物，为人类提供了陆地微生物所不能提供的活性代谢产物，是动物界独一无二的。因此被称为生物学研究的后起之秀，具有良好的应用前景。

目前，其他的一些海洋生物也具有缩醛磷脂类，公开号为cn108276438a的中国发明专利中公开了海参中提取制备epa缩醛磷脂。该发明通过磷脂酶d制备了epa缩醛磷脂，进一步的在进行组分分离得到了缩醛磷脂酰胆碱(ppc)，缩醛磷脂酰乙醇胺(ppe)。但该发明只是单一的提取了epa类的缩醛磷脂，并没有阐述其海参中epa类缩醛磷脂的含量，同时也没有说明其他种类的缩醛磷脂以及分离和含量的测定。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的缺点，本发明的目的是提供一种富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物及其制备和分析方法。本发明利用海鞘来制备富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物，海鞘的脂类代谢产物种类不同于陆地生物，含有更加丰富的磷脂类化合物，可以更高效地获得缩醛磷脂类化合物。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)准备新鲜海鞘，进行预处理；预处理新鲜的真海鞘(halocynthiaroretzi)，挤出水分、清洗海泥、去掉内脏等不可食用组织，并剪碎为均匀小块，放在-80度以下低温冷冻之后，进行研磨获得匀浆，在冷冻干燥机上制备冻干粉。为防止后续提取步骤中缩醛磷脂成分氧化失活，将海鞘冻干粉与抗氧化剂ve干粉(比例是1:1％-2％)进行均匀混合。

(2)有机溶剂提取，真空浓缩得到富含缩醛磷脂的海鞘提取物：

(a)称取一定量步骤(1)制得的海鞘冻干粉，加入少量的水进行稀释，并加入氯仿-甲醇(2:1,v/v),摇匀震荡，室温下静置1-2小时使溶剂分层；然后离心(6000rpm，15min)，转移并收集上清液，得到残留物；

(b)在残留物中加氯仿-甲醇-水(2:1:0.8，v/v/v),摇匀，离心(6000rpm，15min)，转移并收集上清液；

(c)合并(a)和(b)的上清液，加入体积比为1:1的氯仿和水，震荡，离心；取底部的氯仿相到带盖的玻璃管中，在氮气下进行吹干，进行真空浓缩，即可得到海鞘缩醛磷脂提取物，保存在-20℃下。

上述技术方案中，进一步地，所述的富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物采用上述方法制备得到。

更进一步地，所述的富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物包括9种磷脂酰乙醇胺缩醛磷脂和1种磷脂酰丝氨酸缩醛磷脂以及多不饱和脂肪酸dha和epa的缩醛磷脂成分。

本发明还提供了一种富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物的分析方法，所述的海鞘提取物的组成和含量的分析方法如下：

样品采用盐酸处理前后(质量分数为36％-38％的盐酸处理5min)，利用hplc分析含量；海鞘提取物的组成采用质谱分析。缩醛磷脂类化合物在相对应的磷脂化合物中占比较高，含量约为1.70mg/g干粉重；在海鞘提取物中检测到了9种不同分子量的磷脂酰乙醇胺缩醛磷脂(ppe)，其正离子质核比[m+h]⁺分别为：776.5(p18:0/22:6)；752.5(p18:0/20:4)；750.5(p18:0/20:5)；716.5(p18:0/17:1)；748.5(p16:0/22:6)；722.5(p16:0/20:5)；746.5(p18:2/20:5)；784.5(p18:0/22:2)；798.5(p20:1/22:6)。括号内数值表示ppe的侧链组成，22:6表明含有dha(二十二碳六烯酸)，20:5表明含有epa(二十碳五烯酸)。此外，检测到了1个磷脂酰丝氨酸缩醛磷脂(pps)，其正离子质核比[m+h]⁺为826.5(p18:0/22:2)。

更进一步地，所述的富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物可作为原料用于营养食品、老龄化疾病防治相关的保健品和药物开发等领域。

本发明的有益效果在于：

本发明与海参和其他的海洋生物相比，海鞘的价格便宜，养殖成本比较低廉，海鞘提取物中包括多种缩醛磷脂成分，将海鞘作为缩醛磷脂类化合物制备来源具有很大的优势；本发明采用一定比例水混合有机溶剂进行提取，并回收上清液中残留的缩醛磷脂类，显著增大提取效率，提高了缩醛磷脂的提取量；高效液相分析前盐酸酸化(质量分数为36％-38％)5min时间来分析提取物中缩醛磷脂的含量，采用质谱分析缩醛磷脂的种类，得出本发明制备的提取物中包括多种缩醛磷脂成分以及多不饱和脂肪酸dha和epa。本发明方法制备的富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物可作为原料用于营养食品、老龄化疾病防治相关的保健品和药物开发等领域。

附图说明

图1为标准品pe的液相色谱图。

图2为标准品pe、ps混合液的色谱图。

图3为海鞘磷脂分析的色谱图。

图4为海鞘磷脂在盐酸烟雾中酸化3分钟后分析的色谱图。

图5为海鞘磷脂在盐酸烟雾中酸化5分钟后分析的色谱图。

图6为海鞘缩醛磷脂组成质谱分析。

具体实施方法：

一种富含多种缩醛磷脂的海鞘提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：海鞘样品来自真海鞘。取经预处理过的10g新鲜样品，预处理过程包括挤出水分、清洗海泥、去掉内脏等不可食用组织；用剪刀剪成均匀小块，放在-80℃以下低温冷冻之后，放在研钵中进行研磨获得匀浆，进一步在-80℃下冻存，用冷冻干燥机冻干，获得了大约200mg的冻干粉。

(2)富含缩醛磷脂的海鞘提取物的制备:

(a)取冻干粉大约100mg，将其用水稀释到2ml；

(b)将此悬浮液装入25ml玻璃离心管(离心管1)中，并加入7.5ml的氯仿-甲醇(2:1，v/v)，摇匀震荡，室温下放置1小时左右使溶剂分层；

(c)在6000rpm条件下进行离心15min。离心后，上清液转至到另一个25ml的玻璃离心管(离心管2)中；

(d)在离心管1中加9.5ml的氯仿-甲醇-水(2:1:0.8，v/v/v)，摇匀，6000rpm离心15min；

(e)将两次的上清液进行合并，加入5ml的氯仿和5ml的水，震荡，离心；

(f)取底部的氯仿相到有盖的玻璃小管中，在氮气下进行吹干，再真空浓缩保存在-20度冰箱。

(a-f)制备过程的体积可以放大。

(3)缩醛磷脂提取物的高效液相色谱分析

(a)高效液相色谱条件

色谱柱：tnaturec18column(5um4.6×250mm)；流动相为正己烷:异丙醇:1.7％的磷酸水溶液＝45:48:7(v/v/v)的溶液,其中磷酸水溶液是用水和85％磷酸的配比50:1(v/v)，流速1ml/min，检测波长在205nm。

(b)标准和样品溶液的配置

准确称取磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)标准品(sigma公司)各5mg,用正己烷稀释并定容到5ml，配置浓度为1mg/ml的标准品溶液。称取一定量的样品三份，一份是正常的海鞘磷脂提取物，第二份是在浓盐酸的烟雾下酸化3分钟的海鞘磷脂提取物，第三份是在浓盐酸的烟雾下5分钟海鞘磷脂提取物，并用正己烷稀释到一定的浓度。盐酸酸化的目的是酸解缩醛磷脂形成可以检测的溶血性磷脂等产物，具体方法是滴5滴盐酸放在试管盖中，把盛有样品的试管倒置在盐酸烟雾中处理并计时；

(c)高效液相色谱图分析

图1为标准品在流动相为正己烷/异丙醇/水体系下的色谱结果图。可以看出pe出峰比较早，大约在两分钟左右出峰。

图2为标准品在流动相正己烷/异丙醇/磷酸水溶液体系的色谱结果，标准品混合液的出峰很明显，pe保留时间为2.2min,早于ps(3min)。

图3中是样品在正己烷的溶解下进行液相色谱图，可以检测到pe峰，ps也在保留时间(3.7min)出峰(含量较低)。由于没有用别的标准品作为对照，海鞘提取物中其他两个峰的磷脂成分没有定性。

图4的实验中，我们进行了样品在浓盐酸的烟雾下酸解3分钟下的色谱图，观察到和原样品的区别不明显，说明对于海鞘提取物缩醛磷脂在有限的酸解时间内很稳定。

图5是样品酸解5分钟后观察到结果，磷脂酰乙醇胺缩醛磷脂(ppe)被盐酸酸化成相应的溶血性磷脂(lyso-pe),经过计算色谱峰面积的比值，可以得出pe:ppe＝5:1左右,缩醛磷脂类化合物在相对应的磷脂化合物中占比较高，缩醛磷脂的含量约为1.70mg/g干粉重。

(4)海鞘提取物缩醛磷脂组成的质谱分析

(a)质谱分析条件：

仪器采用maxisqtof质谱仪(brukerdaltonics,billerica,mausa)；acquityuplc液相色谱仪(美国waters公司)。质谱条件：正离子ms扫描，m/z300-1000,喷雾电压4500v，喷雾气0.8bar,干燥气0.6l/min。色谱条件：behc18column(2.1mm×100mm,1.7μm)(waterscorp.,milford,usa)；流动相：a相为水，b相为甲醇。梯度洗脱程序为：3％b(0.0-0.5min)；3-80％b(0.5-8.0min)；80-100％b(8.0-14.0min)；100％b(14.0-19.0min)；100-3％b(19.0-19.1min)；3％b(19.1-22.0min)。柱温：30℃；流速0.3ml/min,进样量1μl。(b)质谱图分析结果

图为6缩醛磷脂组成的质谱分析结果。在海鞘提取物中检测到了9种不同分子量的磷脂酰乙醇胺缩醛磷脂(ppe),其正离子[m+h]⁺分别为：776.5(p18:0/22:6)；752.5(p18:0/20:4)；750.5(p18:0/20:5)；716.5(p18:0/17:1)；748.5(p16:0/22:6)；722.5(p16:0/20:5)；746.5(p18:2/20:5)；784.5(p18:0/22:2)；798.5(p20:1/22:6)。括号内数值表示ppe的侧链组成，22:6表明含有dha(二十二碳六烯酸)，20:5表明含有epa(二十碳五烯酸)。此外，检测到了磷脂酰丝氨酸缩醛磷脂(pps)，其正离子[m+h]⁺为826.5(p18:0/22:2)。ppe各组分对应的图为：图6.1，图6.2，图6.3，图6.4，图6.5，图6.6，图6.7，图6.8，图6.9。图6.10为pps。