一种对eNOS/GRK2调节的丹参酮类与丹参酚酸类化合物配伍的组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物药物制备领域，特别是指一种对enos/grk2调节的丹参酮类与丹参酚酸类化合物配伍的组合物及其应用。

背景技术：

内皮一氧化氮合酶(dndothelialnosynthase，enos)可以催化体内一氧化氮(nitricoxide，no)产生。no是体内重要的舒张血管的因子，在由心血管狭窄所引起的疾病中占据重要位置。因此，enos的稳定性表达可以稳定no介导的舒张活性，减少梗死，维持心血管稳态；增加体内enos的水平可以有效保护心血管系统。g蛋白偶联受体2(gproteincoupledreceptorkinase2，grk2)是缺血后心肌细胞死亡的主要效应器，可以激活g蛋白偶联受体(gpcrs)造成缺血性损伤。抑制grk2的激活可以有效减少心肌损伤，保护心肌细胞。

现有研究表明：enos可以通过激活肾上腺素能受体抑制grk2，从而维持心肌功能，而akt会参与共同与enos抑制grk2；grk2可以通过akt导致enos的磷酸化降低，降低心肌no浓度。因此，enos/grk2失调会表现出肾上腺素能受体的脱敏和心肌细胞损伤，从而导致心脏衰竭。enos和grk2两者在体内的相对水平决定了心肌缺血性损伤的结果，其中任何一个指标的升高和降低并不能指示hr损伤结果，当enos/grk2相对升高表明心肌保护效果增加，反之则降低。

目前研究多注重药物对单靶点的作用，如复旦大学公开了以硫化氢作为靶点去研究抗心肌损伤的作用的相关研究、中山一院公开了mir499作为治疗心肌免受ir损伤的靶点，等等；有报导称：隐丹参酮可以激活enos、原儿茶酸和丹参酚酸类化合物可以抑制grk2的表达，对缺氧-复氧损伤的心肌细胞起到保护作用，但是enos/grk2二者平衡是否真正可以起到心肌保护作用，却未曾应用验证。因此，本申请发明人从靶点联合应用的协同增效角度作为切入点进行研究，探讨了隐丹参酮与丹参酚酸类化合物联用的心肌保护效果及对enos/grk2平衡的调节作用。

技术实现要素：

本发明提出一种对enos/grk2调节的丹参酮类与丹参酚酸类化合物配伍的组合物及其应用，解决了现有由enos/grk2失调引起的心脏衰竭的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种对enos/grk2调节的丹参酮类与丹参酚酸类化合物配伍的组合物，所述组合物为丹参酮类化合物中的一种和丹参酚酸类化合物(sas)中的至少一种组合，其中内皮一氧化氮合酶(enos)和g蛋白偶联受体2(grk2)为两个作用靶点。

所述丹参酮类化合物为丹参酮ⅱa和隐丹参酮，丹参酚酸类化合物为原儿茶酸或丹参素。

所述隐丹参酮和丹参酚酸类化合物联用的使用浓度为每3ml药物含有0.1-10μm隐丹参酮和1-30μm的丹参素或原儿茶酸。

所述丹参酮ⅱa和丹参酚酸类化合物的使用浓度为每3ml药物含有0.1-10μm丹参酮ⅱa和1-30μm的丹参素或原儿茶酸。

所述组合物，在制备调节双靶点enos/grk2作用的药物的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明首次提出联用药物对双靶点的平衡调节作用是重要的作用机制。

2、本发明首次发现丹参酮类化合物与丹参酚酸联用对enos/grk2具有明显调节作用，可以双靶点作用于enos和grk2，增加细胞活力，减少心肌梗死率，增加心肌能量利用效率，减少氧化性损伤，保护心肌，联用药物心肌保护作用强于单用的作用机制，显示出更好的心肌保护效果。

3、本发明明确了联用的比例，可作为心血管疾病防治新型药物的开发应用，相比于单用，丹参酮与pca和dss联用可以显著增加心肌细胞活力，显示出更好的心肌保护效果，可进一步开发为片剂、胶囊剂、注射剂等新型药物应用于心血管疾病的防治。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ct与sas对ir损伤大鼠心肌的enos和grk2表达的影响。(a)心肌hr损伤后p-enos、enos及grk2表达水平的westernblot检测结果；(b)药物对心肌细胞p-enos/enos的影响；(c)药物对心肌细胞grk2相对表达量的影响；(d)药物对p-enos/grk2的影响；注：与正常组相比，^#p<0.05，^##p<0.01，与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，n＝8。

图2为ta与sas对ir损伤大鼠心肌梗死率的影响。(a)心肌ir损伤后进行伊文思蓝+ttc染色后的各组心脏切片；(b)加药后对心肌缺血率的影响；注：与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，n＝8。

图3为ta与sas对离体hr损伤心肌细胞enos及grk2表达水平的影响图。其中(a)心肌hr损伤后p-enos、enos及grk2表达水平的westernblot检测结果；(b)药物对心肌细胞p-enos/enos的影响；(c)药物对心肌细胞grk2相对表达量的影响；(d)药物对p-enos/grk2的影响；注：与正常组相比，^#p<0.05，^##p<0.01，与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，n＝4。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种隐丹参酮(ct)与原儿茶酸(pca)联用的双靶点药物配伍组合物及其应用效果：

细胞实验

隐丹参酮和丹参素联用的使用浓度为每3ml药物含有5μm隐丹参酮和18μm的原儿茶酸，将单独含有5μm隐丹参酮或18μm原儿茶酸的药物作为阳性对照，并设置阴性对照，然后将药物作用于96孔板培养3-5d正常的心肌细胞(h9c2，武汉普诺赛生命科技有限公司)。药物作用24h后，用cck-8细胞活力检测试剂检测心肌细胞的活力，判断药物对正常细胞影响。

建立心肌缺氧复氧损伤(hri)模型，将ct，pca及两者联用药物(浓度0.1-100μm)作用于hri的心肌细胞。培养24h后，将培养液吸出用于ldh、mda和sod的检测。用cck-8细胞活力检测试剂检测心肌细胞的活力，判断药物对hri的心肌细胞的保护作用。

取药物作用24h后的hri的心肌细胞，提取细胞总蛋白，制备蛋白样本。配制聚丙烯酰胺凝胶(10％的分离胶)进行电泳(80v，30min后换成120v)。将电泳完毕的凝胶样本拿出，裁剪适应的硝酸纤维素(nitrocellulose，nc)膜，进行转膜(200ma，2h，冰浴)。转膜封闭后，根据enos(140kda)、grk2(80kda)和gapdh(37kda)分子量大小，按照marker的位置裁剪nc膜，加上不同一抗，4℃过夜，加上二抗，室温孵育1h。根据超敏ecl化学发光液试剂盒配制发光液，每个nc膜上加上发光液后放入化学发光成像系统中进行曝光，用imagej处理目的条带。

所有数据用spss15.0软件进行处理，以means±sd值来表示，进行单因素方差分析与组间多重比较，以p<0.05为界，标志结果具有显著性差异。

实验结果表明：由表1可以看出，单用ct和pca可以略微改善心肌细胞活力，联合使用ct与pca时，可以显著增加心肌细胞活力，改善心肌细胞氧化性损伤，保护心肌细胞。

由图1可以看出，ct可以显著增加enos的磷酸化，激活enos，并显著减少grk2的表达(与模型组，p<0.05)。pca虽然增加p-enos水平功能较小，但是其降低grk2表达的作用优于ct(p>0.05)，也有较好的p-enos/grk2水平。当ct和pca(即c+p)联用时，其可以在增加p-enos水平的基础上，能很好的抑制grk2的表达，显著增加了p-enos/grk2水平，联用的心肌保护效果更显著。

表1各组心肌细胞培养液中ldh、mda和sod的含量(n＝4)

注：与正常组相比，^##p<0.01。与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。

动物实验

建立大鼠(spf级sd大鼠雄性(150-200g)，购自河南省医学实验动物中心(合格证号：scxk(豫)2017-0001))心肌缺血再灌注损伤(hri)模型，将ct，pca及两者联用药物(剂量1-200mg/kg)灌胃给药7天后，后腔静脉取血2ml用于生化指标(ck-mb、ldh、sod和mda)的检测。原位结扎左前降支后，用伊文斯蓝和ttc染料染色，固定。

图像采集后，用imageproplus6.0测定心肌梗死面积。左心室面积(leftventriculararea，lva)为总面积。非危险区/正常区(normalmyocardiumarea，nma)的伊文斯蓝染色阳性，ttc染色阳性，为深红(蓝+红)色。梗死区(infarctsize，is)的伊文斯蓝染色阴性，ttc染色阴性，为灰白色。危险(缺血未死亡)区面积(areaatrisk，aar)的伊文斯蓝染色阴性、ttc染色阳性，aar区为红白色与白色区面积的和。心肌梗死率＝(is/aar)×100％。用每只大鼠的心脏切片，求出每只的平均心肌梗死率，再求出每组的平均心肌梗死率。

取心脏组织，提取总蛋白，制备蛋白样本。配制聚丙烯酰胺凝胶(10％的分离胶)进行电泳(80v，30min后换成120v)。将电泳完毕的凝胶样本拿出，裁剪适应的硝酸纤维素(nitrocellulose，nc)膜，进行转膜(200ma，2h，冰浴)。转膜封闭后，根据enos(140kda)、grk2(80kda)和gapdh(37kda)分子量大小，按照marker的位置裁剪nc膜，加上不同一抗，4℃过夜，加上二抗，室温孵育1h。根据超敏ecl化学发光液试剂盒配制发光液，每个nc膜上加上发光液后放入化学发光成像系统中进行曝光，用imagej处理目的条带。

所有数据用spss15.0软件进行处理，以means±sd值来表示，进行单因素方差分析与组间多重比较，以p<0.05为界，标志结果具有显著性差异。

根据表2可以看出，ct可以显著降低因ir增加的ck-mb、ldh和mda水平，并增加sod水平。pca在所测浓度范围内，组间没有显著性差异，且都有很好的改善效果。隐丹参酮与原儿茶酸和丹参素联用后，ck-mb、ldh、mda和sod体内水平趋近于正常，其心肌保护效果均大于两者单用。

表2ct与pca对ir损伤大鼠生化指标的影响。(n＝8)

注：与正常组相比，^#p<0.05，^##p<0.01。与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。

根据图2可以看出，相比于正常组，模型组的心肌梗死面积显著增加，加药后各组都有不同程度的降低。说明，隐丹参酮和原儿茶酸在所测浓度范围内都有心肌保护作用。隐丹参酮和原儿茶酸联用后都能有效降低心肌梗死面积。且优于两者单用(p<0.05)。

由图3可知，与正常组相比，模型组的enos表达水平显著增加，而grk2的表达水平也有所升高，p-enos/grk2水平与正常组没有显著性差异。相比于模型组，ct能明显增加enos的水平，但是对于grk2的表达影响较小，与模型组相比无显著性差异。pca可以使grk2的表达量显著降低，也可以使enos的水平略有增加，使p-enos/grk2水平显著增加。当ct与pca两者联用时其p-enos/grk2的比值显著高于单用，联用的心肌保护效果更显著。

因此，ct与pca可以协同调节enos/grk2的相对表达水平，从而发挥其心血管保护作用，减少心肌氧化损伤，保护心肌免受缺血再灌注损伤。

实施例2

一种丹参酮ⅱa(ta)与丹参素(dss)联用的双靶点药物配伍组合物及其应用效果：

细胞实验

丹参酮ⅱa和丹参素联用的使用浓度为每3ml药物含有0.5μm丹参酮ⅱa和30μm的丹参素，将单独含有1μm丹参酮ⅱa或30μm丹参素的药物作为阳性对照，并设置阴性对照，然后不将同药物作用于96孔板培养3-5d正常的心肌细胞(h9c2，武汉普诺赛生命科技有限公司)。药物作用24h后，用cck-8细胞活力检测试剂检测心肌细胞的活力，判断药物对正常细胞影响。

建立心肌缺氧复氧损伤(hri)模型，将ta，dss及两者联用药物(浓度0.1-100μm)作用于hri的心肌细胞。培养24h后，将培养液吸出用于ldh、mda和sod的检测。用cck-8细胞活力检测试剂检测心肌细胞的活力，判断药物对hri的心肌细胞的保护作用。

取药物作用24h后的hri的心肌细胞，提取细胞总蛋白，制备蛋白样本。配制聚丙烯酰胺凝胶(10％的分离胶)进行电泳(80v，30min后换成120v)。将电泳完毕的凝胶样本拿出，裁剪适应的硝酸纤维素(nitrocellulose，nc)膜，进行转膜(200ma，2h，冰浴)。转膜封闭后，根据enos(140kda)、grk2(80kda)和gapdh(37kda)分子量大小，按照marker的位置裁剪nc膜，加上不同一抗，4℃过夜，加上二抗，室温孵育1h。根据超敏ecl化学发光液试剂盒配制发光液，每个nc膜上加上发光液后放入化学发光成像系统中进行曝光，用imagej处理目的条带。

所有数据用spss15.0软件进行处理，以means±sd值来表示，进行单因素方差分析与组间多重比较，以p<0.05为界，标志结果具有显著性差异。

实验结果表明：由表3可以看出，单用ta和dss可以略微改善心肌细胞活力，联合使用ct与dss时，可以显著增加心肌细胞活力，改善心肌细胞氧化性损伤，保护心肌细胞。

由图1可以看出，ta可以显著增加enos的磷酸化，激活enos，并显著减少grk2的表达(与模型组，p<0.05)。dss虽然增加p-enos水平功能较小，但是其降低grk2表达的作用优于ct(p>0.05)，也有较好的p-enos/grk2水平。当ta和dss联用时，其可以在增加p-enos水平的基础上，能很好的抑制grk2的表达，显著增加了p-enos/grk2水平，联用的心肌保护效果更显著。

因此，ta与dss可以协同调节enos/grk2的相对表达水平，从而发挥其心血管保护作用，减少心肌氧化损伤，保护心肌免受缺血再灌注损伤。

表3各组心肌细胞培养液中ldh、mda和sod的含量(n＝4)

注：与正常组相比，^##p<0.01。与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。

动物实验

建立大鼠(spf级sd大鼠雄性(150-200g)，购自河南省医学实验动物中心(合格证号：scxk(豫)2017-0001))心肌缺血再灌注损伤(hri)模型，将ta，dss及两者联用药物(剂量1-200mg/kg)灌胃给药7天后，后腔静脉取血2ml用于生化指标(ck-mb、ldh、sod和mda)的检测。原位结扎左前降支后，用伊文斯蓝和ttc染料染色，固定。

图像采集后，用imageproplus6.0测定心肌梗死面积。左心室面积(leftventriculararea，lva)为总面积。非危险区/正常区(normalmyocardiumarea，nma)的伊文斯蓝染色阳性，ttc染色阳性，为深红(蓝+红)色。梗死区(infarctsize，is)的伊文斯蓝染色阴性，ttc染色阴性，为灰白色。危险(缺血未死亡)区面积(areaatrisk，aar)的伊文斯蓝染色阴性、ttc染色阳性，aar区为红白色与白色区面积的和。心肌梗死率＝(is/aar)×100％。用每只大鼠的心脏切片，求出每只的平均心肌梗死率，再求出每组的平均心肌梗死率。

取心脏组织，提取总蛋白，制备蛋白样本。配制聚丙烯酰胺凝胶(10％的分离胶)进行电泳(80v，30min后换成120v)。将电泳完毕的凝胶样本拿出，裁剪适应的硝酸纤维素(nitrocellulose，nc)膜，进行转膜(200ma，2h，冰浴)。转膜封闭后，根据enos(140kda)、grk2(80kda)和gapdh(37kda)分子量大小，按照marker的位置裁剪nc膜，加上不同一抗，4℃过夜，加上二抗，室温孵育1h。根据超敏ecl化学发光液试剂盒配制发光液，每个nc膜上加上发光液后放入化学发光成像系统中进行曝光，用imagej处理目的条带。

所有数据用spss15.0软件进行处理，以means±sd值来表示，进行单因素方差分析与组间多重比较，以p<0.05为界，标志结果具有显著性差异。

根据表4可以看出，ta可以显著降低因ir增加的ck-mb、ldh和mda水平，并增加sod水平。dss在所测浓度范围内，组间没有显著性差异，且都有很好的改善效果。丹参酮ⅱa与丹参素联用后，ck-mb、ldh、mda和sod体内水平趋近于正常，其心肌保护效果均大于两者单用。

表4ta与dss对ir损伤大鼠生化指标的影响。(n＝8)

注：与正常组相比，^#p<0.05，^##p<0.01。与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。

根据图2可以看出，相比于正常组，模型组的心肌梗死面积显著增加，加药后各组都有不同程度的降低。说明，丹参酮ⅱa和丹参素在所测浓度范围内都有心肌保护作用。丹参酮ⅱa和丹参素联用后都能有效降低心肌梗死面积。且优于两者单用(p<0.05)。

由图3可知，与正常组相比，模型组的enos表达水平显著增加，而grk2的表达水平也有所升高，p-enos/grk2水平与正常组没有显著性差异。相比于模型组，ta能明显增加enos的水平，但是对于grk2的表达影响较小，与模型组相比无显著性差异。dss可以使grk2的表达量显著降低，也可以使enos的水平略有增加，使p-enos/grk2水平显著增加。当ta与dss两者联用时其p-enos/grk2的比值显著高于单用，联用的心肌保护效果更显著。

因此，ta与dss可以协同调节enos/grk2的相对表达水平，从而发挥其心血管保护作用，减少心肌氧化损伤，保护心肌免受缺血再灌注损伤。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。