一种鼠尾草酸纳米乳口服液及其制备方法与流程

本发明涉及药物制剂技术领域，尤其涉及一种鼠尾草酸口服液及其制备方法。

背景技术：

鼠尾草酸(carnosicacid；ca)主要存在于唇形科植物鼠尾草(salviaofficinalisl.)和迷迭香(rosmarinusofficinalisl.)中的酚类二萜化合物，是天然抗氧化活性成分。鼠尾草酸的化学结构如下所示：

英文化学名称：

(4ar,10as)-5,6-dihydroxy-1,1-dimethyl-7-propan-2-yl-2,3,4,9,10,10a-hexahydrophenanthrene-4a-carboxylicacid

分子式：c20h28o4。

物理化学性质：鼠尾草酸为淡黄色的脂溶性粉末，易溶于油脂和乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等有机溶剂，不溶于水。

鼠尾草酸对大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌等致病菌均有不同程度的抑菌作用。在2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基的清除和铁还原抗氧化能力的实验中，鼠尾草酸的抗氧化能力强于维生素e、丁基羟基茴香醚(bha)和丁基羟基甲苯(bht)，但弱于叔丁基对苯二酚(tbhq)。在抗癌作用方面，鼠尾草酸能抑制多种白血病和实体肿瘤的增殖，并可诱发癌细胞周期的停滞。鼠尾草酸可透过血脑屏障进入大脑，能通过促进谷胱甘肽(gsh)的合成和增加脑源性神经营养因子(bdnf)的分泌等方式提供神经保护作用。

除具有以上的活性，有研究发现鼠尾草酸能抑制肝细胞内的脂质堆积；降低血液中血糖和脂肪酸的浓度、抑制低密度脂蛋白的氧化反应、延缓动脉粥样硬化的发生等作用。

但是，鼠尾草酸难溶于水，在极性溶剂和非极性溶剂中不稳定，例如，鼠尾草酸在甲醇溶液中首先分解为鼠尾草酸醌(鼠尾草酸的醌中间体，可还原成鼠尾草酸)，再进一步转变为鼠尾草酚，鼠尾草酚分解为γ-内酯，包括：外延迷迭香酚、迷迭香酚、7-甲基迷迭香酚和7-甲基外延迷迭香酚。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种鼠尾草酸纳米乳口服液及其制备方法，可显著改善鼠尾草酸在水溶液中的溶解度，使其更易被吸收。

本发明采用以下技术方案实现发明目的：

一种鼠尾草酸纳米乳口服液，包括：

进一步的，所述鼠尾草酸的含量为0.10～5.00g/100.00ml；优选的，所述的鼠尾草酸的含量为0.30～3.00g/100.00ml；更进一步的，所述的鼠尾草酸的含量为0.20～1.00g/100.00ml。

进一步的，所述的环糊精化合物是β-环糊精、甲基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精和麦芽糖基-β-环糊精中的任意一种或多种，优选为磺丁基醚-β-环糊精。

进一步的，所述的磺丁基醚-β-环糊精的含量为0.75～15.00g/100.00ml；进一步的，所述的磺丁基醚-β-环糊精的含量为1.00～10.00g/100.00ml；更进一步的，所述的磺丁基醚-β-环糊精的含量为1.30～5.25g/100.00ml。

进一步的，所述的表面活性剂选自天然表面活性剂或非离子型表面活性剂中的一种或两种，如卵磷脂、大豆卵磷脂、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(tween系列)、失水山梨醇脂肪酸酯(span系列)、myrij系列聚氧乙烯脂肪酸酯、brij系列聚氧乙烯脂肪醇醚、el系列蓖麻油聚氧乙烯醚、蔗糖脂肪酸酯和泊洛沙姆中的一种或多种。

进一步的，所述表面活性剂为吐温80和泊洛沙姆407，其含量为0.01～20.00g/100.00ml；进一步的含量是0.05～15.00g/100.00ml；更进一步的含量是0.10～10.00g/100.00ml；最优选的含量是2.00～5.00g/100.00ml。

进一步的，所述助溶剂为乙醇、丙二醇、丙三醇、乙二醇、正丁醇和聚乙二醇中的一种或多种，优选助溶剂为乙醇和聚乙二醇400，其含量为0.10～50.00ml/100.00ml；进一步的含量是0.30～30.00ml/100.00ml；更进一步的含量是0.50～25.00ml/100.00ml；最优选的含量是2.00～10.00ml/100.00ml。

本发明为纳米乳口服液制剂。对剂型、价格和环保等方面进行考虑后，最适合的溶剂是水。其用量根据溶入的鼠尾草酸和药用辅料进行调节。

本发明还提供一种制备纳米乳口服液制剂的方法，具体制备方法如下：

(1)精准称取鼠尾草酸，加入所需的乙醇，溶解，得到鼠尾草酸溶液；

(2)将环糊精类化合物、表面活性剂和助溶剂溶解于适量去离子水中；

(3)将(2)步骤所得的溶液缓慢地加入(1)步骤得到的溶液中，补入去离子混合的过程在搅拌条件下进行；

(4)将上述混合溶液进行超声均质，直至获得淡黄色澄清溶液，灭菌，得到鼠尾草酸纳米乳口服液。

本发明的有益效果在于：

(1)在应用环糊精类化合物时，因难溶性药物和环糊精类化合物的浓度之间的关系复杂，针对包合不同的药物，其用量难以确定；这是因为在体内，环糊精化合物被稀释、体内某些成分的竞争性置换导致环糊精类化合物包合的药物被快速释放；在本发明中，通过调整鼠尾草酸和环糊精类化合物之间的比例，能提高鼠尾草酸在水溶液中的溶解度，并起到提高稳定性和口服生物利用度的作用。

(2)本发明制得的鼠尾草酸口服液为水包油型纳米乳，为各向同性的热力学稳定体系，改善了鼠尾草酸在水中溶解性、分散性和稳定性；同时，鼠尾草酸纳米乳粒径小，表面积大，与胃肠道上层粘膜有良好的接触，因而能提高鼠尾草酸纳米乳在胃肠道中的消化吸收效率，提高生物利用度。

附图说明

图1为实例4～8中鼠尾草酸溶解效果对比图。

图2为实例4～8中鼠尾草酸标准溶液浓度标准曲线图，其中：a为245nm波长下鼠尾草酸标准溶液浓度标准曲线图，b为282nm波长下鼠尾草酸标准溶液浓度标准曲线。

图3为实例9中透射电镜检测鼠尾草酸纳米乳的粒径情况图。

图4为实例10中质谱显微镜检测显示鼠尾草酸在小鼠脑内代谢分布图，其中：a1-a3为口服灌胃空白纳米乳120分钟鼠脑的质谱图、光镜图和质谱-光镜merge图；b1-b3为小鼠口服灌胃鼠尾草酸纳米乳的质谱图、光镜图和质谱-光镜merge图。

具体实施方式

为进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的鼠尾草酸纳米乳口服液及其制备方法进行详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

以下是具体实施方式所使用的药物和试剂：

鼠尾草酸：成都普利斯生物科技有限公司，纯度≥98％；

吐温80：北京博奥拓达科技有限公司；

磺丁基醚-β-环糊精：北京索莱宝科技有限公司；

泊洛沙姆407：sigma-aldrich公司；

聚乙二醇400：北京索莱宝科技有限公司；

无水乙醇：天津市致远化学试剂有限公司。

实例1

制备方法：精确称取0.60g鼠尾草酸溶于2.00ml无水乙醇中，涡旋溶解，得到鼠尾草酸溶液；将2.62g磺丁基醚-β-环糊精、2.00ml吐温80、2.00g泊洛沙姆407和8.00ml聚乙二醇400溶于20.00ml去离子水中，储存于4℃，直至泊洛沙姆407完全溶解后，在磁力搅拌条件下，将该水溶液缓慢加入鼠尾草酸溶液中，补加去离子水定容至100.00ml；使用超声进行均质，直至获得淡黄色澄清溶液，经巴氏灭菌，既得鼠尾草酸纳米乳口服液。

实例2

制备方法：精确称取0.20g鼠尾草酸溶于0.50ml无水乙醇中，涡旋溶解，得到鼠尾草酸溶液；将0.90g磺丁基醚-β-环糊精、1.00ml吐温80、1.00g泊洛沙姆407和1.00ml聚乙二醇400溶于20.00ml去离子水中，储存于4℃，直至泊洛沙姆407完全溶解后，在磁力搅拌条件下，将该水溶液缓慢加入鼠尾草酸溶液中，补加去离子水定容至100.00ml；使用超声进行均质，直至获得淡黄色澄清溶液，经巴氏灭菌，既得鼠尾草酸纳米乳口服液。

实例3

制备方法：精确称取1.20g鼠尾草酸溶于1.00ml无水乙醇中，涡旋溶解，得到鼠尾草酸溶液；将5.30g磺丁基醚-β-环糊精、5.00ml吐温80、5.00g泊洛沙姆407和20.00ml聚乙二醇400溶于50.00ml去离子水中，储存于4℃，直至泊洛沙姆407完全溶解后，在磁力搅拌条件下，将该水溶液缓慢加入鼠尾草酸溶液中，补加去离子水定容至100.00ml；使用超声进行均质，直至获得淡黄色澄清溶液，经巴氏灭菌，既得鼠尾草酸纳米乳口服液。

实例4～8溶解度实验

各实例分别精准称量32.00mg鼠尾草酸溶于50.00μl无水乙醇中，涡旋溶解，得到鼠尾草酸溶液。根据表1配比，将辅料溶于适宜的去离子水中后，将含辅料水溶液缓慢加入鼠尾草酸溶液中，补加去离子水定容至4.00ml。

超声均质(15分钟，500w，工作3秒，暂停3秒)，离心(6000rpm，30分钟)将未溶解的鼠尾草酸沉积于离心管底部。

表1实例4～8各制剂辅料组成

实例4～8中各辅料比例：

实例4去离子水(ddh2o)

实例51％羧甲基纤维素钠(1％cnc-na)

实例620％聚乙二醇400(20％peg400)

实例710％磺丁基醚-β-环糊精(10％sbe-β-cd)

实例8纳米乳(nanoemulsion)：2％聚乙二醇400、2％吐温80、2％泊洛沙姆407、3.5％磺丁基醚-β-环糊精。

图1，实例4～8鼠尾草酸溶解效果对比，鼠尾草酸不溶于去离子水(ddh2o)及1％cnc-na，微溶于20％peg400和10％磺丁基醚-β-环糊精，鼠尾草酸全溶于纳米乳溶液，制剂显示为淡黄色澄清透明。

运用紫外分光光度计测定实例4～8中鼠尾草酸的浓度，测量方法与结果：

(1)精确称量8.00mg鼠尾草酸溶解于1.00ml甲醇，得到8.00mg/ml鼠尾草酸标准溶液，使用甲醇稀释制备成浓度分别为：0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml和1.00mg/ml的鼠尾草酸标准溶液；

(2)使用紫外分光光度计检测，以甲醇为空白，对鼠尾草酸标准溶液进行全波长扫描，仪器测得：鼠尾草酸在245nm和282nm检测波长有强吸收峰；

(3)使用紫外分光光度计检测，以甲醇为空白，对0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml和1.00mg/ml鼠尾草酸标准溶液进行测量，获取标准溶液在245nm和282nm检测波长的吸光度，各标准溶液重复6次；

(4)取实例4～8各制剂的上清液，用甲醇稀释10倍制得待测样品；

(5)使用甲醇将去离子水、1％羧甲基纤维素钠、20％聚乙二醇400、10％磺丁基醚-β-环糊精和纳米乳辅料稀释10倍，制得空白样品；

(6)使用紫外分光光度计，以空白样品为对照，测量各待测样品在245nm和282nm检测波长的吸光度，各待测样品重复测量6次；

(7)根据鼠尾草酸标准品的吸光度制作标准曲线(图2)；

图2，鼠尾草酸标准品浓度在不同检测波长下的标准曲线图，其中：a为245nm波长下鼠尾草酸标准溶液浓度标准曲线图，b为282nm波长下鼠尾草酸标准溶液浓度标准曲线。

(8)根据各实例待测样品吸光度代入标准曲线公式计算待测样品浓度，实例浓度＝待测样品浓度×10(稀释倍数)，实例4～8的浓度如表2所示。

表2紫外分光法对实例4～8中鼠尾草酸溶解度的测量值(mg/ml)

由图1和表2可知，通过制成纳米乳溶液，可使鼠尾草酸在水溶液中的溶解度增加最大，是鼠尾草酸在10％磺丁基醚-β-环糊精中溶解度的2倍以上。同时也可发现鼠尾草酸极难溶解于水，亦难溶于1％羧甲基纤维素钠溶液和20％聚乙二醇400溶液。

实例9～17溶解度的正交实验设计

各实例分别精准称量32.00mg鼠尾草酸溶于50.00μl无水乙醇中，涡旋溶解，得到鼠尾草酸溶液。根据表3、表4配比，将辅料溶于适宜的去离子水后，将含辅料的水溶液缓慢加入鼠尾草酸溶液中，补加去离子水定容至4.00ml，经超声均质(时间：15分钟；功率：500w；工作模式：工作3秒，暂停3秒)，离心(6000rpm，30分钟)将未溶解的鼠尾草酸沉积于离心管底部。

表3实例9～17各制剂辅料比例(％)

*根据鼠尾草酸与磺丁基醚-β-环糊精物质的量的比计算得到：1.31％(1:0.5)；2.62％(1:1)；5.24％(1:2)。

表4实例9～17各制剂辅料组成及溶解度

测量方法：

(1)取实例9～17各制剂的上清液，用甲醇稀释10倍制得待测样品；

(2)根据表4各实例的辅料配比配制各实例对应的空白制剂(不含鼠尾草酸)，用甲醇稀释10倍制得空白待测样品；

(3)使用紫外分光光度计，以对应空白待测样品为对照，测量各待测样品在245nm检测波长的吸光度，各待测样品重复测量6次；

(4)根据各实例待测样品吸光度代入鼠尾草酸浓度标准曲线公式(245nm波长)计算待测样品浓度，实例浓度＝待测样品浓度×10(稀释倍数)。

表5各辅料正交试验分析

由表5各辅料极差值r可知，极差值r越大，影响因素越重要，因此各辅料对鼠尾草酸纳米乳口服液溶解度的影响由大至小：吐温80＞泊洛沙姆407>聚乙二醇400≈磺丁基醚-β-环糊精。

由表4各实例制剂的溶解度可知，实例13、实例10和实例17溶解度最佳，考虑辅料的安全使用剂量和辅料的成本，实例10的辅料配比兼顾安全性、溶解度和性价比。

但是，在实际的辅料试验过程中，发明人发现各辅料对鼠尾草酸纳米乳口服液影响程度与正交试验得到的结果并没有保持一致，存在差异。经过大量反复实验，最终发现各辅料对鼠尾草酸纳米乳口服液的影响由大到小：吐温80＞磺丁基醚-β-环糊精>泊洛沙姆407＞聚乙二醇400。并且，在稳定性上，60℃恒温放置3周测试结果显示，实例9～16均有鼠尾草酸结晶析出，析出结晶大小：实例9＞实例10＞实例13＞实例12＞实例16＞实例15＞实例11＞实例14，实例17无结晶析出，说明实例17同时具有较好的溶解度和稳定性。

因此，加入吐温80和磺丁基醚-β-环糊精有助于提高鼠尾草酸纳米乳的溶解度和稳定性，能使鼠尾草酸纳米乳达到实际应用的需求。

实例18透射电子显微镜实验

制备方法：精确称取24.00mg鼠尾草酸溶于50.00μl无水乙醇中，涡旋溶解；将105.00mg磺丁基醚-β-环糊精、80.00μl吐温80、80.00mg泊洛沙姆407和80.00μl聚乙二醇400溶于1.00ml去离子水中，储存于4℃中直至泊洛沙姆407完全溶解后；将该水溶液缓慢加入鼠尾草酸-乙醇溶液中，补加去离子水定容至4.00ml；使用超声均质，直至获得淡黄色澄清溶液。

实验方法：

(1)将制得的鼠尾草酸纳米乳溶液用去离子水稀释1倍，获得待测样品；

(2)使用10μl移液枪吸取样品，静置于铜网上3分钟，用滤纸吸去多余液体；

(3)使用10μl移液枪滴加磷钨酸(北京中镜科仪有限公司)进行负染，静置2分钟，滤纸吸去多余液体；

(4)将样品置于37℃烘箱烘干，用透射电子显微镜观察，并在80kv加速电压下拍摄图片(图3)。

图3，透射电镜检测鼠尾草酸纳米乳的粒径情况，在磷钨酸进行背景负染(黑色区域)后，加速电压轰击，透射电镜拍摄显示鼠尾草酸纳米乳微粒为白色小点，粒径分布为20～30nm。

实例19鼠尾草酸纳米乳口服液在大脑内的代谢分布

制备方法：精确称取0.60g鼠尾草酸溶于0.20ml无水乙醇中，涡旋溶解；将2.63g磺丁基醚-β-环糊精、2.00ml吐温80、2.00g泊洛沙姆407和2.00ml聚乙二醇400溶于20.00ml去离子水中，储存于4℃中直至泊洛沙姆407完全溶解后，在磁力搅拌下，将该水溶液缓慢加入鼠尾草酸-乙醇溶液中，补加去离子水定容至40.00ml；使用超声均质，直至获得淡黄色澄清溶液。

实验方法：

(1)将0.20ml无水乙醇、2.63g磺丁基醚-β-环糊精、2.00ml吐温80、2.00g泊洛沙姆407和2.00ml聚乙二醇400溶于40.00ml去离子水中，储存于4℃中直至泊洛沙姆407完全溶解，制得空白纳米乳口服液；

(2)取1只c57bl/6雄鼠，将上述制得的鼠尾草酸纳米乳口服液(鼠尾草酸浓度：15.00mg/ml)，根据小鼠体重和给药体积0.30ml/30g进行口服灌胃给药；

(3)另取1只c57bl/6雄鼠，将空白纳米乳口服液(鼠尾草酸浓度：0mg/ml)，根据小鼠体重和给药体积0.30ml/30g进行口服灌胃给药；

(4)给药2小时后，迅速断髓处死小鼠，取出大脑置于干冰中速冻；

(5)使用冰冻切片机将鼠脑按水平面切成13μm厚的切片，贴于ito(indium-tin-oxide)导电载玻片上，进行质谱分析。

图4，质谱显微镜检测显示鼠尾草酸在小鼠脑内代谢分布，(a1-a3)：口服灌胃空白纳米乳120分钟鼠脑鼠尾草酸代谢分布质谱图、光镜图和质谱-光镜merge图；(b1-b3)：小鼠口服灌胃鼠尾草酸纳米乳120分钟鼠脑鼠尾草酸代谢分布质谱图、光镜图和质谱-光镜merge图。鼠尾草酸代谢物在嗅球、脑室周边组织、海马和小脑有特异性分布。

由上述实施例及实验结果分析可知，本发明通过制备鼠尾草酸纳米乳口服液可极大地提高鼠尾草酸的水溶性；通过透射电镜可观察到鼠尾草酸纳米乳粒径小，表面积大，因此鼠尾草酸纳米乳可以与胃肠道粘膜有良好的接触，提高鼠尾草酸纳米乳在胃肠道中的消化吸收效率，提高生物利用度；质谱图显示鼠尾草酸纳米乳口服吸收代谢后，可通过血脑屏障，特异性分布于嗅球、脑室周边组织、海马和小脑。

以上各实施例的说明用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提要求下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也纳入本发明权利要求的保护范围内。